Un multiplicador de electrones es una estructura de tubo de vacío que multiplica las cargas incidentes. [1] En un proceso llamado emisión secundaria, un solo electrón puede, cuando se bombardea en material emisivo secundario, inducir la emisión de aproximadamente 1 a 3 electrones . Si se aplica un potencial eléctrico entre esta placa metálica y otra más, los electrones emitidos acelerarán a la siguiente placa metálica e inducirán la emisión secundaria de aún más electrones. Esto puede repetirse varias veces, lo que resulta en una gran lluvia de electrones, todos recolectados por un ánodo de metal, y todos han sido disparados por uno solo.
Operación [ editar ]
La avalancha puede ser activada por cualquier partícula cargada que golpee el electrodo de inicio con suficiente energía para causar una emisión secundaria. [2] Por lo tanto, el multiplicador de electrones se usa a menudo como un detector de iones. También podría ser activado por un fotón que causa la fotoemisión al vacío de al menos un electrón. En un fotomultiplicadorEn un tubo, una superficie fotoemisiva es seguida por un multiplicador de electrones con varios electrodos de multiplicación secuencial llamados dinodos. Debido a que estos electrodos están separados entre sí, esto podría llamarse un multiplicador de "dinodo discreto". Normalmente se utiliza una cadena de resistencias divisoras de voltaje para colocar cada dinodo a un potencial de 100 a 200 V más positivo que el anterior. Existen dos modos diferentes que se pueden usar para este detector conocido como modo de conteo analógico o por pulsos. Algunas ventajas de este detector incluyen un tiempo de respuesta rápido, alta sensibilidad y alta ganancia. [3]
Una estructura de "dinodo continuo" es factible si el material de los electrodos tiene una alta resistencia para que las funciones de emisión secundaria y división de voltaje se fusionen. [4] Esto a menudo se construye como un embudo de vidrio recubierto por dentro con una película delgada de material semiconductor, con alto voltaje negativo aplicado en el extremo de entrada más amplio, y voltaje positivo cerca del suelo aplicado en el extremo de salida más estrecho. Los electrones emitidos en cualquier punto se aceleran una distancia modesta por el embudo antes de impactar la superficie, tal vez en el lado opuesto del embudo. En el extremo de destino, se necesita un electrodo separado (ánodo) para recolectar los electrones multiplicados. Esta estructura también se conoce como multiplicador de electrones (único) de canal (CEM) o multiplicador de canal continuo, y uno de los más comunes se vende con el nombre comercial Bendix Channeltron.
Otra geometría del multiplicador de electrones de dinodo continuo se llama placa de microcanales . [5] [6] Se puede considerar una matriz paralela bidimensional de multiplicadores de electrones dinodos continuos muy pequeños, construidos juntos y alimentados en paralelo. Cada microcanal es generalmente de paredes paralelas, no afiladas ni en forma de embudo.
Aplicaciones [ editar ]
En la espectrometría de masas, los multiplicadores de electrones se utilizan a menudo como un detector de iones que se han separado mediante un analizador de masas de algún tipo. Pueden ser del tipo de dinodos continuos y pueden tener una forma de embudo de tipo cuerno curvado o pueden tener dinodos discretos como en un fotomultiplicador .
La electroforesis (del griego "Ηλεκτροφόρηση" que significa "soportar electrones") es el movimiento de partículas dispersas en relación con un fluido bajo la influencia de un campo eléctrico espacialmente uniforme . [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] La electroforesis de partículas cargadas positivamente ( cationes ) a veces se llama cataforesis , mientras que la electroforesis de partículas cargadas negativamente (aniones) a veces se llama anaforesis .
El fenómeno electrocinético se observó de electroforesis por primera vez en 1807 por profesores rusos Peter Ivanovich Strakhov y Fernando Frederic Reuss en la Universidad Estatal de Moscú , [8] que se percató de que la aplicación de un campo eléctrico constante causada arcilla partículas dispersadas en agua a migrar. En última instancia, es causado por la presencia de una interfaz cargada entre la superficie de la partícula y el fluido circundante. Es la base de las técnicas analíticas utilizadas en química para separar moléculas por tamaño, carga o afinidad de unión.
La electroforesis se utiliza en laboratorios para separar macromoléculas según el tamaño. La técnica aplica una carga negativa para que las proteínas se muevan hacia una carga positiva. La electroforesis se utiliza para el análisis de ADN y ARN .
Historia [ editar ]
Teoría [ editar ]
Las partículas suspendidas tienen una carga eléctrica superficial , fuertemente afectada por las especies adsorbidas en la superficie, [9] sobre las cuales un campo eléctrico externo ejerce una fuerza de Coulomb electrostática . De acuerdo con la teoría de la doble capa , todas las cargas superficiales en los fluidos se analizan mediante una capa difusa de iones, que tiene la misma carga absoluta pero un signo opuesto con respecto a la carga superficial. El campo eléctrico también ejerce una fuerza sobre los iones en la capa difusa que tiene una dirección opuesta a la que actúa sobre la carga superficial . Esta última fuerza no se aplica realmente a la partícula, sino a los iones.en la capa difusa ubicada a cierta distancia de la superficie de la partícula, y parte de ella se transfiere completamente a la superficie de la partícula a través de la tensión viscosa. Esta parte de la fuerza también se llama fuerza de retardo electroforético. Cuando se aplica el campo eléctrico y la partícula cargada a analizar se encuentra en movimiento constante a través de la capa difusa, la fuerza total resultante es cero:
Teniendo en cuenta el arrastre de las partículas en movimiento debido a la viscosidad del dispersante, en el caso de un número de Reynolds bajo y una intensidad de campo eléctrico moderada E , la velocidad de deriva de una partícula v dispersa es simplemente proporcional al campo aplicado, que deja la movilidad electroforética μ e sedefine como:
La teoría de la electroforesis más conocida y ampliamente utilizada fue desarrollada en 1903 por Smoluchowski : [10]
- ,
donde ε r es la constante dieléctrica del medio de dispersión , ε 0 es la permitividad del espacio libre (C² N −1 m −2 ), η es la viscosidad dinámica del medio de dispersión (Pa s), y ζ es un potencial zeta (es decir, , el potencial electrocinético del plano de deslizamiento en la doble capa , unidades mV o V).
La teoría de Smoluchowski es muy poderosa porque funciona para partículas dispersas de cualquier forma en cualquier concentración . Tiene limitaciones en su validez. Sigue, por ejemplo, porque no incluye la longitud de Debye κ −1 (unidades m). Sin embargo, la longitud de Debye debe ser importante para la electroforesis, como se desprende de la Figura de la derecha. El aumento del grosor de la doble capa (DL) conduce a eliminar el punto de fuerza de retardo más lejos de la superficie de la partícula. Cuanto más gruesa sea la DL, más pequeña debe ser la fuerza de retardo.
El análisis teórico detallado demostró que la teoría de Smoluchowski es válida solo para DL suficientemente delgada, cuando el radio de la partícula a es mucho mayor que la longitud de Debye:
- .
Este modelo de "capa doble delgada" ofrece tremendas simplificaciones no solo para la teoría de la electroforesis sino para muchas otras teorías electrocinéticas. Este modelo es válido para la mayoría de los sistemas acuosos , donde la longitud de Debye es generalmente de unos pocos nanómetros . Solo se rompe para los nano-coloides en solución con fuerza iónica cerca del agua.
La teoría de Smoluchowski también descuida las contribuciones de la conductividad de la superficie . Esto se expresa en la teoría moderna como condición del pequeño número de Dukhin :
En el esfuerzo de ampliar el rango de validez de las teorías electroforéticas, se consideró el caso asintótico opuesto, cuando la longitud de Debye es mayor que el radio de la partícula:
- .
Bajo esta condición de "capa doble gruesa", Hückel [11] predijo la siguiente relación para la movilidad electroforética:
- .
Este modelo puede ser útil para algunas nanopartículas y fluidos no polares, donde la longitud de Debye es mucho mayor que en los casos habituales.
Existen varias teorías analíticas que incorporan la conductividad de la superficie y eliminan la restricción de un pequeño número de Dukhin, iniciado por Overbeek. [12] y Booth. [13] Las teorías modernas y rigurosas son válidas para cualquier potencial Zeta y, a menudo, cualquier aκ se deriva principalmente de la teoría de Dukhin-Semenikhin. [14] En el límite de doble capa delgada , estas teorías confirman la solución numérica al problema provisto por O'Brien y White.
ensayo de movilidad electroforética cambio (EMSA) o electroforesis de cambio de movilidad , también conocido como un ensayo de desplazamiento en gel , ensayo de cambio de movilidad en gel , ensayo de desplazamiento de banda , o ensayo de retardo en gel , es un común electroforesis afinidad técnica usada para estudiar las proteínas de ADN o proteína - Interacciones de ARN . Este procedimiento puede determinar si una proteína o mezcla de proteínas es capaz de unirse a una secuencia de ADN o ARN dada, y algunas veces puede indicar si más de una molécula de proteína está involucrada en el complejo de unión. Los ensayos de cambio de gel a menudo se realizan in vitrosimultáneamente con la huella de ADNasa , la extensión del cebador y los experimentos de promotor-sonda al estudiar el inicio de la transcripción , la replicación del ADN, la reparación del ADN o el procesamiento y maduración del ARN, así como el empalme previo al ARNm [1] . Aunque los precursores se pueden encontrar en la literatura anterior, la mayoría de los ensayos actuales se basan en los métodos descritos por Garner y Revzin [2] y Fried and Crothers .
Principio [ editar ]
Un ensayo de cambio de movilidad es la separación electroforética de una mezcla de proteína-ADN o proteína-ARN en un gel de poliacrilamida o agarosa durante un corto período (aproximadamente 1.5-2 horas para un gel de 15 a 20 cm). [4] La velocidad a la cual diferentes moléculas (y sus combinaciones) se mueven a través del gel está determinada por su tamaño y carga, y en menor medida, su forma (ver electroforesis en gel).). La línea de control (sonda de ADN sin proteína presente) contendrá una sola banda correspondiente al fragmento de ADN o ARN no unido. Sin embargo, asumiendo que la proteína es capaz de unirse al fragmento, la línea con una proteína que se une presente contendrá otra banda que representa el complejo más grande y menos móvil de la sonda de ácido nucleico unida a la proteína que se "desplaza" en el gel. (ya que se ha movido más lentamente).
Bajo las condiciones experimentales correctas, la interacción entre el ADN (o ARN) y la proteína se estabiliza y la proporción de ácido nucleico unido a no unido en el gel refleja la fracción de moléculas de sonda libres y unidas a medida que la reacción de unión entra en el gel. Esta estabilidad se debe en parte a un "efecto de enjaulado", ya que la proteína, rodeada por la matriz de gel, es incapaz de difundirse lejos de la sonda antes de que se recombinen. [5] Si se conocen las concentraciones iniciales de proteína y sonda, y si se conoce la estequiometría del complejo, se puede determinar la afinidad aparente de la proteína por la secuencia de ácido nucleico. [6]A menos que el complejo tenga una vida muy larga en condiciones de gel, o se tenga en cuenta la disociación durante la electroforesis, el número derivado es un Kd aparente. Si no se conoce la concentración de proteína, pero sí la estequiometría compleja, la concentración de proteína se puede determinar aumentando la concentración de la sonda de ADN hasta que incrementos adicionales no aumenten la fracción de proteína unida. En comparación con un conjunto de diluciones estándar de sonda libre en el mismo gel, se puede calcular el número de moles de proteína. [4]
Variantes y adiciones [ editar ]
Un anticuerpo que reconoce la proteína se puede agregar a esta mezcla para crear un complejo aún más grande con un mayor cambio. Este método se conoce como un ensayo supershift , y se utiliza para identificar de forma inequívoca una proteína presente en el complejo proteína-ácido nucleico.
A menudo, se ejecuta un carril adicional con un oligonucleótido competidor para determinar la secuencia de unión más favorable para la proteína de unión. El uso de diferentes oligonucleótidos de secuencia definida permite la identificación del sitio de unión preciso por competencia (no se muestra en el diagrama). Las variantes del ensayo de competición son útiles para medir la especificidad de la unión y para medir la cinética de asociación y disociación. Por lo tanto, EMSA también podría usarse como parte de un experimento SELEX para seleccionar oligonucleótidos que realmente se unen a una proteína dada. [7]
Una vez que se determina la unión ADN-proteína in vitro , varios algoritmos pueden restringir la búsqueda de la identificación del factor de transcripción. Los oligonucleótidos de secuencia de consenso para el factor de transcripción de interés podrán competir por la unión, eliminando la banda desplazada, y deben ser confirmados por supershift. Si la secuencia de consenso pronosticada no puede competir por la unión, la identificación del factor de transcripción puede ser asistida por un competidor multiplexado EMSA (MC-EMSA), por lo que grandes conjuntos de secuencias de consenso se multiplexan en cada reacción, y cuando un conjunto compite por la unión, el Las secuencias de consenso individuales de este conjunto se ejecutan en una reacción adicional. [8]
Para fines de visualización, el fragmento de ácido nucleico suele estar marcado con un marcador radioactivo , fluorescente o de biotina . La tinción estándar con bromuro de etidio es menos sensible que estos métodos y puede carecer de la sensibilidad para detectar el ácido nucleico si se usan pequeñas cantidades de ácido nucleico o ácido nucleico monocatenario en estos experimentos. Cuando se utiliza un marcador de biotina, se usa estreptavidina conjugada con una enzima como la peroxidasa de rábano picante para detectar el fragmento de ADN. [9] [10]Si bien el marcaje con ADN isotópico tiene poco o ningún efecto sobre la afinidad de unión a proteínas, el uso de marcadores no isotópicos que incluyen flurophores o biotina puede alterar la afinidad y / o la estequiometría de la interacción de proteínas de interés. La competencia entre la sonda marcada con fluoróforo o biotina y el ADN no marcado de la misma secuencia se puede usar para determinar si el marcador altera la afinidad de unión o la estequiometría.
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