EL ADN Y ARN

Cuando extraían el ADN de la bacterias que llevaban una generación creciendo en N14 y centrifugaban en CsCl, obtenían una sola banda de densidad intermedia (N^14-15)entre la del ADN N¹⁴ y el ADN N¹⁵. Si extraían el ADN de las bacterias que llevaban dos generaciones creciendo en N¹⁴ y centrifugaban en gradiente de CsCl obtenían dos bandas, una correspondiente al ADN N¹⁴ y otra de densidad intermedia (N^14-15) entre la del ADN N¹⁴ y el ADN N¹⁵. La absorbancia  a 260 nm es directamente proporcional a la cantidad de ADN que contiene una banda, de manera que al medir la absorbancia de las dos bandas obtenidas en la segunda generación, obtenían que ambas contenían igual cantidad de ADN (1:1). Al extraer y centrifugar en CsCl el ADN de las bacterias que llevaban tres generaciones creciendo en N14, obtenían dos bandas, una correspondiente al ADN N¹⁴ y otra de densidad intermedia (N^14-15) entre la del ADN N¹⁴ y el ADN N¹⁵. La cantidad de ADN que contenía la banda correspondiente al ADN N¹⁴ era tres veces mayor que la encontrada en la  banda de densidad intermedia (N^14-15), proporción (3:1).

Los resultados obtenidos por Meselson y Stahl (1958) se ajustaban a un modelo de replicación semiconservativo. Para asegurarse, aislaron la banda de ADN de densidad intermedia (N^14-15) obtenida a partir de las bacterias que llevaban una generación en N¹⁴, desnaturalizaron el ADN de la banda mediante calor para separar sus dos hélices y, manteniéndolas desnaturalizadas, centrifugaron en CsCl. Si la replicación de E. coli se ajustaba al modelo semiconservativo, una de las hélices debería estar construida con N¹⁵ (la vieja) y la otra hélice con N¹⁴ (la nueva) y, al centrifugar en gradiente de densidad esperaríamos obtener dos bandas una más densa correspondiente a la hélice construida con N¹⁵ y otra menos densa sintetizada con  N¹⁴. El resultado obtenido por Meselson y Stahl (1958) fue precisamente el esperado para una replicación semiconservativa.

Resultados centrifugación CsCl	Matthew Meselson y Franklin W. Stahl

Si la replicación del ADN de E. coli se ajustará al modelo Conservativo al centrifugar el ADN de las bacterias después de un generación en medio con N¹⁴, hubieran obtenido dos bandas una de densidad correspondiente al N¹⁴  y otra de densidad correspondiente al N¹⁵. Nunca habrían observado, en este caso,  una banda de ADN de densidad intermedia (N^14-15).

EL ADN BACTERIANO ES CIRCULAR: EXPERIMENTO DE CAIRNS (1963)

Cairns en 1963, llevó a cabo otro experimento en la bacteria E. coli que además de demostrar que la replicación de su ADN se ajustaba al modelo Semiconservativo propuesto por Watson y Crick (1953), también demostraba que el ADN de E. coli es circular. Se trata se la primera evidencia citológica (mediante observación al microscopio) de la circularidad del cromosoma bacteriano, ya que mediante técnicas de construcción de mapas de conjugación, ya se había demostrado previamente por Jacob y Wollman (1958)   que el ADN bacteriano tenía un mapa circular.

El experimento que realizó Cairns (1963) consistió en mantener un cultivo de E. coli creciendo durante dos generaciones sucesivas en un medio que contenía Timidina tritiada (TH³), es decir, utilizaron un nucleótido (la Timina) marcado con un isótopo radiactivo (tritio, H³). Por tanto, cuando las bacterias sintetizaban su ADN empleaban dicho nucleótido marcado. Además, Cairns (1963) desarrolló un sistema para extraer el ADN de E. coli sin romperlo (intacto) y extenderlo sobre un portaobjetos para posteriormente realizar una autorradiografía, revelarla  y observar los resultados al microscopio. Para realizar la autorradiografía, empleaba una emulsión fotográfica que colocaba en contacto directo con la preparación, de forma que en aquel lugar de la preparación en que existía TH³, las partículas b del tritio impresionaban la emulsión fotográfica y al revelarla aparecía una macha o punto en ese lugar. Las autorradiografías correspondientes a la primera generación de replicación presentaban imágenes de puntos formando un círculo. En las autorradiografías correspondientes a la segunda generación de replicación se observaban imágenes de puntos en forma de la letra griega q pero que mostraban una región del interior con doble cantidad de puntos. 

Cairns (1963) interpretó que el cromosoma de E. coli era circular, que se replicada de modo semiconservativo, que existía un punto de inicio de la replicación, un origen, y un punto de crecimiento (PC). Sin embargo, esta interpretación fue errónea, ya que en E. coli existe un solo punto de iniciación de la Replicación (Ori C) pero existen dos puntos de crecimiento (PC), ya que la replicación en E. coli, como veremos más adelante es bidireccional.

Cairns (1963) interpretó que el cromosoma de E. coli era circular, que se replicada de modo semiconservativo, que existía un punto de inicio de la replicación, un origen, y un punto de crecimiento (PC). Sin embargo, esta interpretación fue errónea, ya que en E. coli existe un solo punto de iniciación de la Replicación (Ori C) pero existen dos puntos de crecimiento (PC), ya que la replicación en E. coli, como veremos más adelante es bidireccional.

Autorradiografía de la 2ª generación de Replicación con TH3