El electroferograma muestra la secuencia de datos producida por una máquina automática de secuenciación de ADN.1
En 1985 Alec Jeffreys implementó el uso del material genético (ADN[2]) para identificación humana, obteniendo un patrón de bandas parecido a un código de barras al que denominó huella digital del ADN (DNA fingerprinting) (Figura 1). Actualmente a esta prueba se le conoce como perfil de ADN, huella genética, o simplemente prueba de ADN. Este perfil de ADN se ha demostrado que es prácticamente único e irrepetible, a excepción de los gemelos monocigotos[3], lo que permite diferenciar a cualquier persona de otra y establecer sus relaciones biológicas de parentesco. Las aplicaciones de la prueba de ADN son diversas, pero destacan dos, las pruebas de paternidad y los análisis forenses; este último en casos criminales para establecer la relación de un sospechoso con la evidencia dejada en la escena de un crimen (p. ejem. mancha de sangre o semen), para incriminarlo o, en su caso, exonerarlo. Otras aplicaciones menos comunes son para establecer relaciones familiares de restos cadavéricos en casos de desastres o personas desaparecidas, en investigaciones históricas (p. ejem. restos de la familia Romanov, origen de Cristobal Colón, etc.), o en antropología al analizar poblaciones humanas para estudiar su origen y evolución. Esta revisión sobre la prueba de ADN se centrará en su aplicación en paternidad, revisando para ello aspectos básicos del genoma humano y de los marcadores moleculares, técnicas para obtener un perfil de ADN, aspectos bioestadísticos para la interpretación del resultado emitido por un laboratorio, y preguntas frecuentes sobre la prueba de ADN.
La facilidad para obtener perfiles genéticos ha revolucionado la identificación humana para resolver casos criminales así como determinar relaciones biológicas de parentesco, comúnmente paternidad. Las repeticiones cortas en tándem, más bien conocido como STRs son los marcadores genéticos más utilizados con este fin. Un perfil de ADN se compone de los genotipos para varios STRs, que forman un código casi único para diferenciar o relacionar a una persona biológicamente. Actualmente el análisis de laboratorio se basa en tres técnicas: 1) extracción de ADN, 2) PCR multiplex, y 3) electroforesis capilar, y existen kits comerciales para desarrollar fácilmente esta tarea. En paternidad se espera que entre el perfil de ADN de un supuesto padre (SP) e hijo (H) exista al menos una concordancia por cada marcador. Cuando para más de un marcador no hay concordancia entre SP y H, se establece una exclusión y prácticamente el resultado es incuestionable. Sin embargo, cuando todo concuerda entre SP y H se debe hacer una valoración bioestadística del caso, estimando la probabilidad de que algún otro individuo tomado al azar de la población pudiera concordar con el hijo. Para esto se debe haber estudiado a los marcadores STRs en la población donde se realizan las pruebas de ADN, para usar las frecuencias alélicas de los STRs en el análisis bioestadístico. A dicha estimación se le denomina índice de paternidad (IP), que indica cuantas veces es más probable haber encontrado la concordancia SP-H considerando que sí es el padre, respecto a que fuera un individuo tomado al azar de la población. Este IP puede ser transformado a porcentaje de paternidad (W), para facilitar la interpretación. Por ejemplo, un IP de 1000 se convierte en W= 99.9%. Existen formulas especificas para calcular el IP, las cuales cambian según el genotipo de cada marcador analizado, y según el caso de paternidad, ya sea que participe o no la madre, si no está el padre pero sí están los abuelos, si se duda de la paternidad de ambos padres, etc. En México existen estos estudios que sustentan su correcta aplicación, suele ser más preocupante que no hay suficiente personal capacitado, tanto en el ámbito laboratorial como en la impartición de justicia, que garanticen siempre la correcta interpretación de la prueba sobre bases científicas.
Introducción
En 1985 Alec Jeffreys implementó el uso del material genético (ADN[2]) para identificación humana, obteniendo un patrón de bandas parecido a un código de barras al que denominó huella digital del ADN (DNA fingerprinting) (Figura 1). Actualmente a esta prueba se le conoce como perfil de ADN, huella genética, o simplemente prueba de ADN. Este perfil de ADN se ha demostrado que es prácticamente único e irrepetible, a excepción de los gemelos monocigotos[3], lo que permite diferenciar a cualquier persona de otra y establecer sus relaciones biológicas de parentesco. Las aplicaciones de la prueba de ADN son diversas, pero destacan dos, las pruebas de paternidad y los análisis forenses; este último en casos criminales para establecer la relación de un sospechoso con la evidencia dejada en la escena de un crimen (p. ejem. mancha de sangre o semen), para incriminarlo o, en su caso, exonerarlo. Otras aplicaciones menos comunes son para establecer relaciones familiares de restos cadavéricos en casos de desastres o personas desaparecidas, en investigaciones históricas (p. ejem. restos de la familia Romanov, origen de Cristobal Colón, etc.), o en antropología al analizar poblaciones humanas para estudiar su origen y evolución. Esta revisión sobre la prueba de ADN se centrará en su aplicación en paternidad, revisando para ello aspectos básicos del genoma humano y de los marcadores moleculares, técnicas para obtener un perfil de ADN, aspectos bioestadísticos para la interpretación del resultado emitido por un laboratorio, y preguntas frecuentes sobre la prueba de ADN.
 | Figura 1. Alec Jeffreys, quién ideo el uso del ADN para identificación humana en Leicester, UK. Al fondo se observa la huella genética del ADN (DNA fingerprinting) como Jeffreys llamo al patrón de bandas que obtuvo, parecido a un código de barras, presumiblemente único para cada individuo. |
Genoma Humano
La estructura del ácido desoxirribonucleico o ADN es bien conocida: una doble cadena que gira sobre sí que contiene información hereditaria codificada solo por cuatro “letras” o nucleótidos[4]: A, G, C y T (adenina, guanina, citosina y timina, respectivamente) (Figura 2). El ADN es importante porque su información es necesaria para el funcionamiento de la célula, ya que contiene las “instrucciones” para sintetizar proteínas[5], quienes propiamente llevan a cabo las diferentes funciones celulares, en forma de enzimas, hormonas, receptores, transportadores, moléculas estructurales, de contracción, soporte, inmunológicas, etc.
 | Figura 2. Estructura de doble hélice (izquierda) del ADN o ácido desoxirribonucleico. Los nucleótidos (A, G, C, y T) se encuentran en el interior de la doble cadena de ADN. |
A la dotación completa de material genético que recibimos de nuestros padres se le denomina genoma[6], y se localiza en el núcleo de prácticamente todas nuestras células, por lo que teóricamente es posible realizar la prueba de ADN a partir una sola célula de casi cualquier tejido. Los humanos recibimos una dotación genética doble, vía paterna y materna, que constituye nuestro genoma, y que contiene 6,000 millones de nucleótidos. De toda la información que constituye el genoma, solo una pequeña parte sirve o se “expresa” para formar proteínas (menos del 5%); a los fragmentos del genoma con una secuencia de nucleótidos que sirve para formar una proteína se les denomina genes[7] (Figura 3).
 | Figura 3. Localización del genoma humano en el núcleo de la célula. Se muestra un cromosoma y un gen, este último caracterizado por tener información para sintetizar una proteína |
Marcadores Moleculares
Considerando la gran cantidad de información que contiene el genoma, podemos visualizar su potencial para identificación humana. En particular la prueba de ADN se realiza analizando secuencias del genoma muy variables, es decir, que entre los individuos de una población puede tener diferentes formas alternas denominadas alelos . Estas secuencias permiten diferenciar a un individuo de otro y, al heredarse de padres a hijos, también permite establecer relaciones biológicas de parentesco, por lo que se les conoce como marcadores genéticos o marcadores moleculares (por estar en la molécula del ADN). Cabe señalar que para cada marcador una persona tendrá dos alelos, uno materno y otro paterno, y a dicha combinación de alelos que recibimos de nuestros padres se le denomina genotipo . Específicamente las secuencias o marcadores empleados para realizar una prueba de ADN se caracterizan por tener repeticiones cortas en tándem , y son ampliamente conocidos por sus siglas en inglés como STRs (short tandem repeats) o microsatélites. A lo largo del genoma se encuentran miles de STRs que pueden ser usados como marcadores moleculares. Como su nombre lo dice, los STRs se componen de secuencias cortas repetidas, por ejemplo GATA, formando diversos alelos que se nombran por el número de veces que se encuentre la secuencia repetida; por ejemplo, el alelo 6 presentará seis veces la secuencia (p. ejem. GATA,GATA,GATA,GATA,GATA,GATA), y en una población podrían existir los alelos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, etc. El par de alelos o genotipo de una persona para cada marcador STR (p. ejem. 6/9), permite diferenciarlo o relacionarlo con otras personas (Figura 4). Cuando la persona presenta dos alelos diferentes (uno materno y otro paterno), se dice que su genotipo es heterocigoto ; mientras cuando tiene un solo alelo se asume que recibió el mismo alelo de ambos padres, y se dice que su genotipo es homocigoto para el STR en cuestión. En una pareja de heterocigotos para alelos diferentes se pueden generar cuatro genotipos distintos en sus hijos, lo que permite diferenciar individuos estrechamente relacionados como los hermanos (Figura 4). Un perfil de ADN , que también suele llamarse huella genética, se genera obteniendo los genotipos de varios STRs, formando un código que presumiblemente puede llegar a ser único e irrepetible (6/9, 12/16, 17/21, 22/23, etc.). Hay que señalar que la nomenclatura (rango de alelos) de cada STR puede ser diferente, por ejemplo, para el marcador X los alelos pueden ir del 9 al 12, mientras para el marcador Y la nomenclatura va del 12 al 33, etc.
 | Figura 4. Uso de los marcadores STRs para identificación humana. Los genotipos permiten establecer las relaciones de parentesco y diferenciar a un individuo de otro. De una pareja de heterocigotos se generan multiples genotipos en sus hijos. |
Técnica para obtener el Perfil de ADN
La forma de obtener un perfil de ADN se basa en generar millones de copias o amplificar las secuencias del genoma que permiten diferenciar individuos, en este caso los marcadores STRs. Esta técnica permite replicar al ADN in vitro, y se conoce ampliamente por sus siglas en inglés como PCR[15] (polymerase chain reaction). La PCR se realiza por ciclos de temperatura en los que básicamente suceden los siguientes tres pasos en cada ciclo: 1) desnaturalización, por calor se abren las cadenas de ADN, 2) alineamiento de secuencias cortas conocidas como primers[16], que delimitan las regiones que se van a replicar, y 3) extensión, formándose cadenas nuevas de ADN por acción de la Taq polimerasa[17], una enzima termoestable capaz de añadir nucleótidos a los extremos de los primers. En cada ciclo de PCR se duplica la secuencia de interés (STRs), por lo que en solo 25 ciclos teóricamente habrá millones de copias, a lo que se conoce como “amplificado”, lo que facilitará enormemente su análisis posterior (Figura 5). Para el análisis post-PCR hay que recordar que los alelos STRs se diferencian por el número de veces que se repite una secuencia, esto significa que el tamaño o longitud va a ser diferente de un alelo de otro (Figura 4). Para ver estas diferencias se emplea la electroforesis[18], técnica para separar moléculas en una superficie de soporte (gel) por acción de un campo eléctrico en base a la carga y tamaño de la molécula; las más pequeñas corren más rápido mientras las grandes se van retrasando (Figura 6).
 | Figura 5. Amplificación exponencial de una secuencia de ADN por ciclos de temperatura por la técnica de PCR |
 | Figura 6. Amplificación de STRs y detección por electroforesis en geles verticales de poliacrilamida en un caso forense. Nótese que el perfil de ADN de la mancha de sangre en ropa del sospechoso es igual al de la víctima. |
Para ello simultáneamente se someten a electroforesis muestras con fragmentos de tamaño conocido, también llamados marcadores de peso molecular o estándar de tamaño, y/o una mezcla de los diferentes alelos posibles para los STRs que se están analizando, y que se conoce como escalera alélica[19] o ladder; con lo que resulta relativamente sencillo definir los alelos/genotipos y posteriormente el perfil genético de una persona. La electroforesis en una prueba de ADN se realiza de dos formas: 1) por geles verticales de poliacrilamida, técnica que ha caído francamente en desuso, y 2) electroforesis capilar (EC)[20], cuyo proceso es más preciso y automatizado, por lo que constituye el método de elección en los laboratorios de genética forense en el mundo. Finalmente, para observar el ADN amplificado (STRs) y sometido a electroforesis es necesario teñirlo; existen métodos tradicionales como la tinción con nitrato de plata de los geles de poliacrilamida (Figura 6), o más sofisticados que involucran la detección de fluorescencia añadida durante la PCR y que se detecta en sistemas automatizados de electroforesis capilar.
La siguiente descripción se enfocará en el análisis de varios STRs simultáneamente (PCR múltiplex), seguido por electroforesis capilar (EC) para obtener un perfil de ADN, donde existen diferentes kits o sistemas genéticos[21] que permiten amplificar hasta 16 marcadores, 15 STRs y un marcador sexual llamado amelogenina[22] que define el sexo de la muestra. Los kits comerciales más empleados son AmpFlSTR® Identifiler™ kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), y el PowerPlex 16 (Promega Corp., Madison, CA). En ambos casos, durante la PCR los productos amplificados (STRs) se marcan con diferentes fluorocromos[23], formándose así grupos de STRs que fueron marcados con el mismo color, pero evitando que alelos de STRs diferentes se sobrelapen en tamaño (Figura 7).
 | Figura 7. Los dos principales kits comerciales para identidad humana que analizan 15 STRs y el marcador sexual amelogenina (A). Los nombres de los STRs están en recuadros de colores, y en la parte de abajo un estándar de tamaño o marcador de peso molecular para definir el tamaño de los alelos STRs. Nótese que cada STR abarca un rango de tamaño por los diferentes tamaños que sus alelos pueden tener, y que no se sobrelapa con otro STR. |
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