Resumen: El objetivo de este trabajo fue estudiar la infección por Epstein Barr en niños VIH+ menores de 12 años, de ambos sexos, con TARAE y su relación con carga viral del VIH y contaje de linfocitos T CD4+. La detección de IgM/IgG anti CVA y anti EBNA1 se realizó por ELISA, la cuantificación de EBV en sangre periférica por PCR y el inmunofenotipaje por citometría de flujo. Estudio estadístico mediante el análisis de correlación de Spearman y la prueba de t de Student. Se evaluaron 21 niños con edades comprendidas entre 3 a 12 años, 18 de los cuales (85,7%) presentaron carga viral detectable para EBV. Dos de ellos tuvieron infección aguda temprana (IgM CVA e IgM EBNA1 +), 5 infección aguda tardía (IgM CVA - IgM EBNA +) con carga viral para EBV de 573 copias/ml, y 14 con infección pasada (IgG CVA e IgG EBNA positivos), 11 de los cuales tenían carga viral para EBV de 646 copias/ml (crónicos activos). No hubo diferencias estadísticamente significativas al comparar los promedios de las cargas virales de EBV en infecciones agudas y pasadas, ni entre esas cargas y las de VIH, pero si con los contajes de linfocitos T CD4+: cifras menores se correlacionaron con niveles altos de carga viral de EBV (p<0 a="" anti="" anticuerpos="" as="" carga="" cd4="" como="" contaje="" cuantificaci="" cva="" de="" debe="" detecci="" ebna1="" ebv.="" ebv="" font="" linfocitos="" los="" mayor="" menor="" moleculares="" n="" ni="" o="" por="" positivo="" pruebas="" que="" realizarse="" t="" todo="" vih="" viral="" y="" ya="">
Palabras clave: Virus Epstein Barr, virus de la inmunodeficiencia humana, serología, PCR, carga viral, linfocitos T CD4+
Epstein Barr virus infection in HIV positive children: relationship with viral load and T CD4+ lymphocyte count
Abstract: The purpose of this work was to study Epstein Barr infection in HIV+ children less than 12 years old of both sexes, with TARAE and its relationship with the HIV viral load and T CD4+ lymphocyte count. The detection of anti CVA and anti EBNA1 IgM/IgG was done by ELISA, the EBV quantification in peripheral blood by PCR, and the immunophenotype by flow cytometry. The statistical study was done through Spearman’s correlation analysis and Student’s t test. The evaluation included 21 children with ages between 3 and 12 years, 18 of which (85.7%) presented a detectable EBV viral load. Two of them had an acute early infection (IgM CVA and IgM EBNA1 +), 5 an acute late infection (IgM CVA – IgM EBNA+) with a EBV viral load equal to 573 copies/ml, and 14 with past infections ( IgG CVA and IgG EBNA positive), 11 of which had an EBV viral load equal to 646 copies/ml (active chronics). There were no statistical significant differences when comparing the mean EBV viral load in acute and past infections, nor between those loads and the HIV loads, but there were differences in the T CD4+ loads; lower numbers were correlated with high EBV viral loads (p<0 .05="" a="" all="" and="" anti="" antibodies="" as="" be="" cd4="" children="" count="" cva="" detection="" done="" ebna1="" ebv="" font="" higher="" hiv="" load.="" lower="" lymphocyte="" means="" molecular="" of="" positive="" quantification="" should="" since="" t="" tests="" through="" to="" viral="" well="">
Keywords: Epstein Barr Virus, Human Immunodeficiency Virus, Serology, PCR, viral load, CD4+ lymphocytes
Recibido 10 de marzo de 2008; aceptado 13 de julio de 2008
Introducción
El virus de Epstein Barr es un gammaherpesvirus humano ubicuo, con un fuerte linfotropismo por células B, estrechamente asociado con el desarrollo de severas enfermedades malignas, particularmente en hospederos inmunocomprometidos (linfoma de Burkitt, enfermedad de Hodgkin y linfoma de células B), por lo que la infección activa puede contribuir significativamente a la morbimortalidad de los pacientes portadores del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o con SIDA [1,2].
Posterior a la infección aguda, el virus persiste en forma latente durante toda la vida en los linfocitos B de memoria en reposo, con reactivaciones periódicas, infectando nuevas células: durante esta fase de replicación se pueden encontrar en sangre periférica células B circulantes infectadas, en un número que varia considerablemente entre los individuos infectados y con potencial para transformación maligna. Afortunadamente, la mayoría de los portadores permanecen libres de neoplasias debido al control efectivo por el sistema inmune, fundamentalmente a través de linfocitos T citotóxicos específicos [1,3-5].
Hoy en día, debido a la poca especificad de la prueba de anticuerpos heterófilos, el diagnóstico de infección por el EBV se basa en técnicas serológicas. Cuando la infección es primaria aguda, la muestra sérica contiene tanto IgG como IgM contra el antígeno de la cápside viral (ACV). Pueden estar presentes también anticuerpos contra el denominado antígeno precoz del EBV, pero la mayoría no tienen anticuerpos detectables anti EBNA (Epstein Barr Nuclear Antigen) o bien existen títulos apenas detectables. Si la sintomatología se relaciona con una infección persistente o una reactivación viral, el patrón serológico generalmente observado es IgG anti ACV en altos títulos, con IgM anti ACV negativa y anti EBNA positivo. Las anticuerpos IgG anti ACV y anti EBNA persisten de por vida e identifican a portadores crónicos [6,7]. En el hospedero inmunocomprometido, la reactivación del virus se produce más frecuentemente, con el consiguiente aumento de susceptibilidad a procesos patológicos ligados con la infección por el EBV; en este grupo, la respuesta serológica no siempre es útil, dado que puede estar ausente o incompleta, siendo necesaria la demostración del acido nucleico del EBV en tejidos o sangre, idealmente por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa (carga viral) [1,6,8].
En portadores sanos, no se ha establecido claramente la relación entre los marcadores serológicos presentes en un momento dado y la carga viral en sangre periférica; en pacientes inmunosuprimidos, específicamente con infección por el VIH, los resultados son todavía más contradictorios y no se ha podido establecer a ciencia cierta la posible relación entre la carga viral para el EBV, el grado de inmunosupresión y la carga viral para el VIH [1].
La presencia de anticuerpos anti EBNA se asocia con infección pasada por el EBV [9,10], sin embargo, específicamente los que se producen en contra del EBNA1 deben ser cuidadosamente interpretados. Este antígeno es expresado periódicamente en las células B de memoria para asegurar el pasaje del episoma viral durante la división celular y es crucial para la persistencia del virus; su presencia es diagnóstica de replicación viral, puede dar lugar inicialmente a la producción de anticuerpos tipo IgM, y secundariamente a los de tipo IgG en replicaciones sucesivas [1,9,11-13].
Con el fin de aclarar la utilidad y significado de las diferentes pruebas señaladas, en la presente investigación se realizó un despistaje de infección por el EBV en pacientes pediátricos infectados por el VIH, a través de ensayos serológicos: detección de anticuerpos IgM e IgG anticápside viral (anti ACV) y anti EBNA1 y de la cuantificación del ADN-EBV en sangre periférica y su correlación con la carga viral del VIH y el contaje de CD4+.
Materiales y Métodos
1.- Diseño de la investigación
Estudio transversal y descriptivo, en niños con diagnóstico confirmado de infección por VIH, con terapia antirretroviral de alta efectividad (TARAE), que acuden mensualmente a control en la Unidad de Investigación de Infectología Pediátrica de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Carabobo Hospital “Enrique Tejera”, Valencia, Venezuela. Se contó con la aprobación del Comité de Ética de la institución hospitalaria. Las muestras fueron recolectadas durante el período 2005-2006.
2.- Sujetos
2. a. Criterios de inclusión
• Edad igual o menor a 12 años.
• Ambos sexos.
• Diagnóstico confirmado de infección por VIH.
• Recibiendo TARAE.
• Cuentas de linfocitos T CD4+ y carga viral para el VIH en el momento de su inclusión.
• Posibilidad certera de obtener muestras de sangre para serología y PCR EBV en los 7 días siguientes a la realización del contaje de linfocitos T CD4+ y la carga viral para el VIH.
• Ausencia clínica de datos sugestivos de infección por el EBV (asintomáticos).
• Consentimiento informado por escrito, por parte de los padres o representantes legales del menor.
2. b.- Criterios de exclusión
• Complicaciones asociadas con la infección por VIH.
• Hospitalización. 3.- Interpretación de los resultados
I.- Infección aguda
• Temprana: Caracterizada por la presencia de IgM anti EBNA 1 e IgM anti ACV.
• Tardía: Cuando la IgM anti EBNA 1 es positiva con ausencia de IgM anti ACV.
• En ambas etapas existe carga viral del EBV en sangre periférica y serológicamente la IgG anti ACV puede estar o no presente con ausencia de IgG anti EBNA1.
II.- Infección pasada
IgM anti ACV y anti EBNA1 negativos, IgG anti ACV y anti EBNA1 positivos: con carga viral presente: infección crónica activa, de estar ausente: infección pasada no activa.
3.- Metodología
En un lapso de tiempo no mayor de 7 días de realizada la cuantificación de linfocitos T CD4+ y la carga viral para el VIH, a cada niño se le extrajeron 10 cc de sangre de la vena del pliegue del codo, en dos tubos, uno de ellos sin anticoagulante para la obtención de suero, y el segundo con heparina para la cuantificación de la carga viral del EBV.
El estudio de IgM e IgG anti ACV y anti EBNA1 se realizó mediante la técnica de ELISA, utilizando el ensayo comercial World Diagnostic, Inc. Lab. Systems.
La obtención del ADN de EBV, siguiendo el protocolo de Wizard Genomic DNA Purification Kit, se procedió a lisar los glóbulos rojos y blancos del paciente mediante la adición, de solución de lisis celular y, posterior al descarte del sobrenadante, una solución de lisis nuclear para liberar el ADN, el cual se obtuvo por precipitación con isopropanol, con descarte del sobrenadante; el resto se colocó en un bloque térmico para ser secado a 55º por 10 minutos y posteriormente fue hidratado con buffer. Para verificar la calidad del ADN de cada muestra, las mismas se corrieron en un gel de agarosa al 1% preparado en solución 0,045 M tris-borato, 0,001M EDTA pH 8,0 (TBE 1X) más 0,5 ug/ml de bromuro de etidio por 45 minutos a 100 V, observándose las bandas de ADN a través de la luz ultravioleta, considerándose de buena calidad cuando estaban bien definidas y uniformes. Para los experimentos de amplificación se utilizaron 100ng de ADN total, amplificado en un termociclador modelo PTC-100 (M.J Research, Inc). La detección del producto amplificado y la cuantificación viral se realizó usando el estuche Quantitative EBV PCR Detection Kit (Biosource International).
4.- Análisis estadístico
Para el procesamiento y análisis de la información se utilizó el paquete estadístico SPSS, versión 11.0 en español. Se usaron técnicas descriptivas (análisis de frecuencia, porcentajes y promedios aritméticos) y de asociación (coeficiente de correlación de Sperman). También se utilizó el análisis de significación de igualdad de distribuciones de la U de Mann Whitney, dado que los valores de las cargas virales del EBV no siguen una distribución normal (Prueba de Kolmogorov). En relación a las otras variables (carga viral del VIH y porcentaje de linfocitos CD4+), éstas se adaptaban al modelo de distribución de curva normal, por lo que se utilizó la prueba de diferencia de medias de grupos independientes de la t de Student.
Resultados
Se evaluaron 21 niños, 7 menores de tres años, ocho entre 4 y 6 y seis entre 4 y 11 años de edad (13,3%, 38,1% y 28,6% respectivamente). Del total de niños evaluados 19 tuvieron anticuerpos anti EBNA1 positivos.
Siete niños (33,3%) fueron catalogados como portadores de infección aguda: dos (28,6%) con IgM anti ACV e IgM anti EBNA positivos, ubicados por lo tanto dentro la fase temprana del proceso agudo y cinco (71,4%) con IgM anti ACV negativa e IgM anti EBNA positiva, que corresponden a la fase tardía de dicha etapa; todos presentaron cargas virales para el EBV detectables, con un promedio de 573,3 ± 645 copias por ml.
Los 14 pacientes restantes presentaron IgM anti ACV negativa, IgG anti ACV positiva e IgG anti EBNA positiva, interpretándose como infección pasada, de los cuales, 11 (78,6%) presentaron carga viral detectable para el EBV (X= 646 ± 438,8 copias por ml) y se consideraron con infección crónica activa.
De los 21 niños estudiados, 18 (85,7%) presentaron cargas virales detectables en sangre periférica para el EBV, sin evidencia clínica de infección por este virus. Al comparar los promedios de carga viral entre los pacientes con infección aguda y pasada no se encontró diferencia estadísticamente significativa (p>0,05). Tampoco se encontraron diferencias entre la presencia o no de EBV detectable y los promedios de carga viral del VIH, pero si con el promedio de linfocitos T CD4+ en sangre periférica. (Tabla 1). Adicionalmente al realizar el coeficiente de correlación de Sperman se evidenció que la disminución de las cifras porcentuales de los linfocitos T CD4+ se correlacionó con niveles más altos de la carga viral para el EBV, lo que no ocurre con la carga viral para el VIH. (Figuras 1 y 2).
En los niños con infección pasada por el EBV, al analizar estos mismos parámetros (carga viral del VIH y porcentaje de linfocitos CD4+, con la carga viral para el EBV en sangre periférica), nuevamente se evidenció la relación estadísticamente significativa entre los valores en porcentaje de linfocitos T CD4+ y la presencia o no de carga viral para el EBV, lo que no ocurre con la carga viral del VIH.. Por otra parte, los niños con infección aguda temprana, tienen un promedio de carga viral para el EBV de 994 copias por ml, mientras que cuando esa infección ha avanzado en el tiempo a una fase más tardía dentro del mismo periodo (agudo), el promedio de las cargas es inferior, 507 copias por ml, sin embargo, a pesar de observarse esta tendencia, dicha diferencia no fue estadísticamente significativa
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