ÁCIDOS NUCLEICOS

ADN :  ADN complementario o ADN copia (ADNc) es una hebra de ADN de doble cadena una de las cuales constituye una secuencia totalmente complementaria del ARN mensajero a partir del cual se ha sintetizado.¹ Se suele utilizar para la clonación de genes propios de células eucariotas en células procariotas, debido a que, dada la naturaleza de su síntesis, carece de intrones.

El dogma central de la biología molecular dice que durante la síntesis de proteínas, el ADN se transcribe en ARNm, que a su vez se traduce en proteínas.² Una diferencia entre ARNm eucariótico y procariótico es que el ARNm eucariótico puede contener intrones, secuencias no codificantes que deben ser extraídas del ARNm antes de ser traducido a proteínas. El ARNm procariótico no tiene intrones, así que no sufre ningún proceso de corte y empalme (splicing).

A veces se quieren expresar genes eucariotas en células procariotas. Un método simple de hacerlo es insertar ADN eucariótico en un hospedador procariota, que transcribiría el ADN en ARNm y luego lo traduciría a proteínas. Pero como el ADN eucariota tiene intrones, y los procariotas carecen de mecanismos para eliminarlos, el proceso de extracción debe realizarse antes de introducir el ADN eucariota en el hospedador (además, debe ser metilado y hay que añadirle una región promotora procariota). Este ADN despojado de intrones es el ADN complementario, o ADNc.

La enzima retrotranscriptasa trabaja sobre un molde de cadena simple de ARN, creando el ADN complementario basado en la correspondencia de bases ARN (A,U, G, C) con las bases ADN complementarias (T, A, C, G).

Para la obtención de ADN eucariota cuyos intrones han sido eliminados:

1. una célula eucariota transcribe el ADN a ARNm;
2. la misma célula procesa la nueva cadena de ARNm eliminando los intrones, y añadiendo una cola poli-A y un terminal GTP;
3. esta cadena de ARNm maduro se extrae de la célula;
4. se hibrida un oligonucleótido poli-T sobre la cola poli-A del molde de ARNm maduro, ya que la retrotranscriptasa necesita un cebador de doble cadena para comenzar a trabajar; alternativamente, se pueden utilizar hexameros aleatorios que son fragmentos de una sola hebra de ADN de 6 pares de bases que se pueden unir a cualquier región de ARN.³
5. se añade la retrotranscriptasa, junto con una solución de bases A, T, C y G.

La retrotranscriptasa va recorriendo la cadena de ARNm y sintetizando la cadena de ADNc complementaria del molde de ARNm (ADNc).

En genética, ADN complementario es el ADN sintetizado a partir de una plantilla de ARN mensajero en una reacción catalizada por las enzimas transcriptasa inversa y ADN polimerasa. ADNc se utiliza a menudo para clonar los genes eucariotas en procariotas. Cuando los científicos quieren expresar una proteína específica en una célula que no expresa normalmente que la proteína, van a transferir el ADNc que codifica para la proteína de la célula receptora. ADNc también se produce naturalmente por retrovirus y luego integrado en el genoma del huésped, donde se crea un provirus.

De acuerdo con el dogma central de la biología molecular, cuando se sintetiza una proteína, el ADN de un gen se transcribe en ARNm, que luego se traduce en proteína. Una diferencia entre los genes eucariotas y procariotas es que los genes eucariotas pueden contener intrones que no son secuencias de codificación, en contraste con los exones, que son secuencias de codificación de ADN. Durante la transcripción, todo intrón ARN se corta a partir del transcrito primario de ARN y las piezas restantes del transcrito primario de ARN se empalman juntos de nuevo para convertirse en ARNm. El código de ARNm se traduce a continuación en una cadena de aminoácidos que comprende la proteína recién hecho. Genes procariotas no tienen intrones, por lo tanto su ARN no está sujeta a corte y empalme.

A menudo es deseable hacer que las células procariotas expresan los genes eucariotas. Un enfoque que se podría considerar es agregar ADN eucariota directamente en una célula procariota, y dejar que se haga la proteína. Sin embargo, porque el ADN eucariota tiene intrones, y procariotas carecen de la maquinaria para la eliminación de intrones del ARN transcrito, para hacer este trabajo enfoque, todas las secuencias de intrones deben ser eliminado a partir de ADN eucariota antes de la transferencia en el anfitrión. Este ADN 'intrón-libre' se construye utilizando ARNm 'intrón-libre' como una plantilla. Por lo tanto, es una copia 'complementaria' del ARNm, y por lo tanto se llama ADN complementario. Para obtener la expresión de la proteína codificada por los ADNc, secuencias reguladoras procarióticas también sería necesario.

Síntesis

Aunque hay varios métodos para hacerlo, ADNc se sintetizó a partir de más a menudo ARNm maduro usando la enzima transcriptasa inversa. Esta enzima, que se produce naturalmente en los retrovirus, opera en una sola hebra de ARNm, la generación de su DNA complementario basado en el apareamiento de pares de bases de ARN a ADN de sus complementos.

Para obtener ADNc eucariotas cuya intrones se han eliminado:

Una célula eucariota transcribe el ADN en ARN.

La misma célula procesa las hebras de pre-ARNm mediante la eliminación de intrones, y la adición de un poli-Una tapa Metil-Guanina cola y 5

Esta mezcla de hebras de ARNm maduro se extrae de la célula. La cola poli-A de la transcripción del ARNm mensaje puede ser aprovechada con perlas de oligo en un ensayo de cromatografía de afinidad.

Un cebador de oligonucleótido poli-T se hibrida a la cola poli-A de la plantilla de ARNm maduro, o cebadores hexámeros al azar se puede añadir que contienen todas las posibles 6 de base sola hebra de ADN y por lo tanto se puede hibridar en cualquier parte del ARN

Se añade la transcriptasa inversa, junto con desoxinucleótido trifosfatos. Este sintetiza una cadena complementaria de ADN hibridado a la cadena de ARNm original de.

Para sintetizar una cadena de ADN adicional, usted necesita para digerir el ARN de la cadena híbrida, utilizando una enzima como la RNasa H, o por medio de método de digestión alcalina.

Después de la digestión del ARN, un ADN de una sola hebra se deja y porque los ácidos nucleicos de hebra única son hidrófobos, que tiende a bucle alrededor de sí mismo. Es probable que el ssDNA forma un bucle en horquilla en el extremo 3 '.

Desde el bucle de horquilla, una ADN polimerasa a continuación, se puede utilizar como un cebador para transcribir una secuencia complementaria para el ADNc ss.

Ahora, debe quedar con un doble varados cDNA con la secuencia idéntica a la del ARNm de interés.

La transcriptasa inversa escanea el ARNm maduro y sintetiza una secuencia de ADN que complementa la plantilla de ARNm. Esta cadena de ADN es ADN complementario.

Aplicaciones

ADN complementaria se utiliza a menudo en la clonación de genes o como sondas de genes o en la creación de una biblioteca de ADNc. Cuando los científicos transfieren un gen de una célula a otra celda con el fin de expresar el nuevo material genético como una proteína en la célula receptora, el ADNc se añadirán al receptor, debido a que el ADN de un gen completo puede incluir ADN que no codifica para la proteína o que interrumpe la secuencia de codificación de la proteína. Secuencias parciales de ADNc se obtienen a menudo como etiquetas de secuencias expresadas.

Virus

Algunos virus también utilizan cDNA para convertir su ARN viral en ARNm. El ARNm se utiliza para producir proteínas virales para hacerse cargo de la célula huésped.