QUÍMICA - QUÍMICA ANALÍTICA

gráfico de Bland-Altman ( gráfico de diferencia) en química analítica o biomedicina es un método de análisis de datos utilizado para analizar el acuerdo entre dos ensayos diferentes . Es idéntico a un gráfico de diferencia de medias de Tukey ^[1] , el nombre por el que se conoce en otros campos, pero fue popularizado en estadísticas médicas por J. Martin Bland y Douglas G. Altman .

Acuerdo vs correlación [ editar ]

Bland y Altman señalan que cualquiera de los dos métodos que están diseñados para medir el mismo parámetro (o propiedad) debe tener una buena correlación cuando se elige un conjunto de muestras de manera que la propiedad que se va a determinar varía considerablemente. Una alta correlación para cualquiera de los dos métodos diseñados para medir la misma propiedad podría, por lo tanto, ser solo una señal de que se ha elegido una muestra generalizada. Una alta correlación no implica necesariamente que haya un buen acuerdo entre los dos métodos.

Cómo construir un diagrama de Bland-Altman [ editar ]

Considere un conjunto de $${\ displaystyle n}Muestras (por ejemplo, objetos de volumen desconocido). Ambos ensayos (por ejemplo, diferentes métodos de medición de volumen) se realizan en cada muestra, lo que resulta en$${\ displaystyle 2n}puntos de datos. Cada una de las$${\ displaystyle n}las muestras se representan en el gráfico asignando la media de las dos mediciones como la$${\ displaystyle x}-valor, y la diferencia entre los dos valores como el $${\ displaystyle y}-valor.

Las coordenadas cartesianas de una muestra dada.$${\ displaystyle S} con valores de $${\ displaystyle S_ {1}} y $${\ displaystyle S_ {2}} determinado por los dos ensayos es

$${\ displaystyle S (x, y) = \ left ({\ frac {S_ {1} + S_ {2}} {2}}, S_ {1} -S_ {2} \ right).

Para comparar las diferencias entre los dos conjuntos de muestras independientemente de sus valores medios, es más apropiado observar la relación de los pares de mediciones. ^{[4] La} transformación de registro (base 2) de las mediciones antes del análisis permitirá el uso del enfoque estándar; por lo que la trama estará dada por la siguiente ecuación:

$${\ displaystyle S (x, y) = \ left ({\ frac {\ log _ {2} {S_ {1}} + \ log _ {2} {S_ {2}}} {2}}, \ log _ {2} {S_ {1}} - \ log _ {2} {S_ {2}} \ right).

Esta versión de la trama se utiliza en la trama MA .

Aplicación [ editar ]

Una de las aplicaciones principales de la gráfica de Bland-Altman es comparar dos mediciones clínicas que producen algún error en sus mediciones. ^[5] También se puede utilizar para comparar una nueva técnica o método de medición con un estándar de oro , ya que incluso un estándar de oro no implica (y no debería) que implica que está sin error. ^[4] Consulte Analyze-it , MedCalc , NCSS , GraphPad Prism, R o StatsDirect para el software que proporciona gráficos de Bland-Altman.

Los diagramas de Bland-Altman se utilizan ampliamente para evaluar el acuerdo entre dos instrumentos diferentes o dos técnicas de medición. Los gráficos de Bland-Altman permiten la identificación de cualquier diferencia sistemática entre las mediciones (es decir, el sesgo fijo) o posibles valores atípicos . La diferencia de medias es el sesgo estimado, y la desviación estándar de las diferencias mide las fluctuaciones aleatorias en torno a esta media. Si el valor medio de la diferencia difiere significativamente de 0 en base a una prueba t de 1 muestra , esto indica la presencia de sesgo fijo. Si hay un sesgo consistente, se puede ajustar restando la diferencia media del nuevo método. Es común computar límites de acuerdo del 95%.para cada comparación (diferencia promedio ± 1.96 desviación estándar de la diferencia), que nos indica qué tan lejos es más probable que las mediciones por 2 métodos sean para la mayoría de los individuos. Si las diferencias dentro de la media ± 1.96 SD no son clínicamente importantes, los dos métodos pueden usarse indistintamente. Los límites de acuerdo del 95% pueden ser estimaciones poco confiables de los parámetros de la población, especialmente para tamaños de muestra pequeños, por lo que, al comparar métodos o evaluar la repetibilidad, es importante calcular los intervalos de confianza para los límites de acuerdo del 95%. Esto se puede hacer por el método aproximado de Bland y Altman ^[3] o por métodos más precisos. ^[6]

Los gráficos de Bland-Altman también se utilizaron para investigar cualquier posible relación de las discrepancias entre las mediciones y el valor real (es decir, el sesgo proporcional). La existencia de sesgo proporcional indica que los métodos no coinciden por igual en el rango de mediciones (es decir, los límites de acuerdo dependerán de la medición real). Para evaluar formalmente esta relación, la diferencia entre los métodos se debe reducir en el promedio de los 2 métodos. Cuando se identifica una relación entre las diferencias y el valor verdadero (es decir, una pendiente significativa de la línea de regresión), se deben proporcionar límites de acuerdo del 95% basados ​​en la regresión.

ensayo de proteínas de Bradford fue desarrollado por Marion M. Bradford en 1976. ^[1] Es un procedimiento analítico espectroscópico rápido y preciso ^{[2] que} se usa para medir la concentración de proteínas en una solución. La reacción depende de la composición de aminoácidos de las proteínas medidas.

Principio [ editar ]

Figura 1. Coomassie Brilliant Blue G-250, el colorante de unión para el método de Bradford

Reacción del color de la proteína y reactivo de Bradford.

El ensayo de Bradford, un ensayo de proteínas colorimétricas , se basa en un cambio de absorbancia del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 . El colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 existe en tres formas: aniónico (azul), neutro (verde) y catiónico (rojo). ^[3] En condiciones ácidas, la forma roja del colorante se convierte en su forma azul, uniéndose a la proteína que se está analizando. Si no hay proteínas para unir, entonces la solución seguirá siendo marrón. El tinte forma un complejo fuerte y no covalente con el grupo carboxilo de la proteína por la fuerza de Van der Waals y el grupo amino a través de interacciones electrostáticas. ^[1]Durante la formación de este complejo, la forma roja del colorante de Coomassie primero dona su electrón libre a los grupos ionizables de la proteína, lo que provoca una alteración del estado nativo de la proteína, exponiendo sus bolsas hidrófobas . Estas bolsas en la estructura terciaria de la proteína se unen de forma no covalente a la región no polar del colorante a través de la primera interacción de enlace ( fuerzas de van der Waals) que colocan los grupos positivos de amina en proximidad con la carga negativa del tinte. El enlace se fortalece aún más por la segunda interacción de enlace entre los dos, la interacción iónica. La unión de la proteína estabiliza la forma azul del colorante Coomassie; por lo tanto, la cantidad del complejo presente en la solución es una medida de la concentración de proteína y puede estimarse mediante el uso de una lectura de absorbancia. ^{[ cita requerida ]}

La forma catiónica (no unida) es verde / roja y tiene un espectro de absorción que históricamente se mantiene en 465 nm . La forma unida aniónica del colorante que se mantiene unida por las interacciones hidrófobas e iónicas, tiene un espectro de absorción máximo históricamente mantenido a 595 nm . ^[4] El aumento de la absorbancia a 595 nm es proporcional a la cantidad de colorante unido, y por lo tanto a la cantidad (concentración) de proteína presente en la muestra. ^{[ cita requerida ]}

A diferencia de otros ensayos de proteínas, el ensayo de proteínas de Bradford es menos susceptible a la interferencia de varios compuestos químicos como el sodio, el potasio o incluso los carbohidratos como la sacarosa, que pueden estar presentes en las muestras de proteínas. ^[2] Una excepción a la nota son las concentraciones elevadas de detergente . El dodecil sulfato de sodio (SDS), un detergente común, se puede encontrar en extractos de proteínas porque se usa para lisar células al romper la bicapa lipídica de la membrana y para desnaturalizar proteínas para SDS-PAGE . Mientras que otros detergentes interfieren con el ensayo a alta concentración, la interferencia causada por SDS es de dos modos diferentes, y cada uno ocurre a una concentración diferente. Cuando las concentraciones de SDS están por debajo de la concentración crítica de micelas(conocido como CMC, 0,00333% W / V a 0,0667%) en una solución de colorante de Coomassie, el detergente tiende a unirse fuertemente con la proteína, inhibiendo los sitios de unión de proteínas para el reactivo del colorante. Esto puede causar subestimaciones de la concentración de proteínas en solución. Cuando las concentraciones de SDS están por encima de la CMC, el detergente se asocia fuertemente con la forma verde del colorante de Coomassie, lo que provoca que el equilibrio se desplace, produciendo así más de la forma azul. Esto provoca un aumento en la absorbancia a 595 nm independientemente de la presencia de proteínas. ^{[ cita requerida ]}

Otra interferencia puede provenir del tampón utilizado al preparar la muestra de proteína. Una alta concentración de tampón causará una concentración de proteína sobrestimada debido al agotamiento de los protones libres de la solución por la base conjugada del tampón. Esto no será un problema si se utiliza una concentración baja de proteína (posteriormente el tampón). ^{[ cita requerida ]}

Para medir la absorbancia de un compuesto incoloro se debe realizar un ensayo de Bradford. Algunos compuestos incoloros, como las proteínas, se pueden cuantificar a una densidad óptica de 280 nm debido a la presencia de anillos aromáticos como el triptófano, la tirosina y la fenilalanina, pero si ninguno de estos aminoácidos está presente, la absorción no se puede medir a 280 nm. ^[5]

Ventajas [ editar ]

Muchas soluciones que contienen proteínas tienen la absorción más alta a 280 nm en el espectrofotómetro, el rango UV. Esto requiere espectrofotómetros capaces de medir en el rango UV, que muchos no pueden. Además, la absorción máxima a 280 nm requiere que las proteínas contengan aminoácidos aromáticos como la tirosina (Y), fenilalanina (F) y / o triptófano (W). No todas las proteínas contienen estos aminoácidos, un hecho que sesgará las mediciones de concentración. Si los ácidos nucleicos están presentes en la muestra, también absorberían la luz a 280 nm, sesgando los resultados aún más. Al utilizar el ensayo de proteínas de Bradford, se pueden evitar todas estas complicaciones simplemente mezclando las muestras de proteínas con el colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 (reactivo de Bradford) y midiendo sus absorbancias a 595 nm, que se encuentra en el rango de Vis. ^[6]

El procedimiento para el análisis de proteínas de Bradford es muy fácil y sencillo de seguir. Se realiza en un solo paso donde el reactivo de Bradford se agrega a un tubo de ensayo junto con la muestra. Después de mezclar bien, la mezcla cambia casi inmediatamente a un color azul. Cuando el colorante se une a las proteínas a través de un proceso que dura aproximadamente 2 minutos, ocurre un cambio en el máximo de absorción del colorante de 465 nm a 595 nm en soluciones ácidas. ^[2]Este colorante crea fuertes enlaces no covalentes con las proteínas, a través de las interacciones electrostáticas con los grupos amino y carboxilo, así como las interacciones de Van Der Waals. Solo las moléculas que se unen a las proteínas en solución exhiben este cambio en la absorción, lo que elimina la preocupación de que las moléculas no unidas del colorante puedan contribuir a la lectura de la absorción obtenida experimentalmente. Este proceso es más beneficioso, ya que es menos costoso que otros métodos, es fácil de usar y tiene una alta sensibilidad del colorante para la proteína. ^[7]

Después de 5 minutos de incubación, la absorbancia se puede leer a 595 nm usando un espectrofotómetro ; Una máquina de fácil acceso.

Este ensayo es uno de los ensayos más rápidos realizados en proteínas. ^[8] El tiempo total que se tarda en configurar y completar el ensayo es inferior a 30 minutos. ^[9] Todo el experimento se realiza a temperatura ambiente.

El ensayo de proteínas de Bradford puede medir cantidades de proteínas de 1 a 20 μg. ^[10] Es una técnica extremadamente sensible.

El reactivo de tinte es un producto estable listo para usar preparado en ácido fosfórico . Puede permanecer a temperatura ambiente hasta 2 semanas antes de que empiece a degradarse.

Las muestras de proteínas generalmente contienen sales, solventes, tampones, conservantes, agentes reductores y agentes quelantes de metales. Estas moléculas se usan frecuentemente para solubilizar y estabilizar proteínas. Otros ensayos de proteínas como BCA y Lowry son ineficaces porque las moléculas como los agentes reductores interfieren con el ensayo. ^{[11] El} uso de Bradford puede ser ventajoso contra estas moléculas porque son compatibles entre sí y no interfieren. ^[12]

El gráfico lineal adquirido a partir del ensayo (absorbancia frente a la concentración de proteínas en μg / mL) se puede extrapolar fácilmente para determinar la concentración de proteínas utilizando la pendiente de la línea.

Es una técnica sensible. También es muy simple: medir la DO a 595 nm después de 5 minutos de incubación. Este método también puede hacer uso de un espectrofotómetro Vis. ^[13]

Desventajas [ editar ]

El ensayo de Bradford es lineal en un rango corto, generalmente de 0 µg / mL a 2000 µg / mL, lo que a menudo hace que las diluciones de una muestra sean necesarias antes del análisis. Al hacer estas diluciones, el error en una dilución se combina con otras diluciones que resultan en una relación lineal que puede no ser siempre precisa.

Las condiciones básicas y los detergentes, como SDS, pueden interferir con la capacidad del tinte para unirse a la proteína a través de sus cadenas laterales. ^[8] Sin embargo, hay algunos reactivos de Bradford compatibles con detergentes. El ensayo de Bradford depende de la secuencia de la proteína. Por lo tanto, si la proteína no contiene un número ideal de residuos aromáticos, entonces el colorante no podrá unirse a la proteína de manera eficiente. Otra desventaja del ensayo de proteínas de Bradford es que este método depende de la comparación de la absorbancia de la proteína con la de una proteína estándar. Si la proteína no reacciona al colorante de manera similar a la proteína estándar, es posible que la concentración medida sea inexacta.

Los reactivos en este método tienden a teñir los tubos de ensayo. No se pueden usar los mismos tubos de ensayo ya que la mancha afectaría la lectura de absorbancia. Este método también es sensible al tiempo. Cuando se prueba más de una solución, es importante asegurarse de que cada muestra se incuba durante el mismo tiempo para una comparación precisa. ^[14]

También se inhibe por la presencia de detergentes, aunque este problema puede aliviarse mediante la adición de ciclodextrinas a la mezcla de ensayo. ^[15]

Gran parte de la no linealidad proviene del equilibrio entre dos formas diferentes del colorante que se perturba al agregar la proteína. El ensayo de Bradford linealiza midiendo la relación de las absorbancias, 595 sobre 450 nm. Este ensayo de Bradford modificado es aproximadamente 10 veces más sensible que el convencional. ^[dieciséis]

El colorante Coomassie Blue G250 utilizado para unirse a las proteínas en el método original de Bradford se une fácilmente a los grupos de proteínas arginina y lisina. Esto es una desventaja porque la preferencia del colorante para unirse a estos aminoácidos puede dar como resultado una respuesta variada del ensayo entre diferentes proteínas. Se han realizado cambios en el método original, como aumentar el pH al agregar NaOH o agregar más tinte para corregir esta variación. Aunque estas modificaciones dan como resultado un ensayo menos sensible, un método modificado se vuelve sensible a los detergentes que pueden interferir con la muestra. ^[17]

Procedimiento de muestra de Bradford [ editar ]

Materiales [ editar ]

• Globulina bovina liofilizada de gamma
• Azul brillante de Coomassie 1
• 0.15 M NaCl
• Espectrofotómetro y cubetas.
• Micropipetas

Procedimiento (Ensayo estándar, 20-150 µg de proteína; 200-1500 µg / mL) [ editar ]

1. Prepare una serie de estándares diluidos con NaCl 0,15 M hasta concentraciones finales de 0 (blanco = Sin proteína), 250, 500, 750 y 1500 µg / ml. También prepare diluciones en serie de la muestra desconocida para medir.
2. Agregue 100 µL de cada uno de los anteriores a un tubo de ensayo separado (o tubo de espectrofotómetro si usa un Spectronic 20 ).
3. Agregue 5.0 mL de Coomassie Blue a cada tubo y mezcle por vórtice o inversión.
4. Ajuste el espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm, utilizando el tubo que no contiene proteínas (blanco).
5. Espere 5 minutos y lea cada uno de los estándares y cada una de las muestras a una longitud de onda de 595 nm.
6. Grafique la absorbancia de los estándares frente a su concentración. Calcule el coeficiente de extinción y calcule las concentraciones de las muestras desconocidas.

Procedimiento (Micro Ensayo, 1-10 µg de proteína / mL) [ editar ]

1. Prepare concentraciones estándar de proteína de 1, 5, 7.5 y 10 µg / mL. Prepare un blanco de NaCl solamente. Preparar una serie de diluciones de muestra.
2. Agregue 100 µL de cada uno de los anteriores a tubos separados (use tubos de microcentrífuga) y agregue 1.0 ml de Azul de Coomassie a cada tubo.
3. Encienda y ajuste un espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm, y ponga en blanco el espectrofotómetro con cubetas de 1.5 ml.
4. Espere 2 minutos y lea la absorbancia de cada estándar y la muestra a 595 nm.
5. Grafique la absorbancia de los estándares frente a su concentración. Calcule el coeficiente de extinción y calcule las concentraciones de las muestras desconocidas.

Usando los datos obtenidos para encontrar la concentración de desconocido [ editar ]

En resumen, para encontrar una curva estándar, se deben usar concentraciones variables de BSA (albúmina de suero bovino) ^[2] para crear una curva estándar con la concentración representada en el eje x y la absorbancia representada en el eje y. Solo se utiliza una concentración estrecha de BSA (2-10 ug / ml) para crear una curva estándar precisa. ^{[18] El} uso de un amplio rango de concentración de proteínas hará que sea más difícil determinar la concentración de la proteína desconocida. Esta curva estándar se usa para determinar la concentración de la proteína desconocida. Lo siguiente detalla cómo se pasa de la curva estándar a la concentración de lo desconocido.

Primero, agregue una línea de mejor ajuste o regresión lineal y muestre la ecuación en el gráfico. Idealmente, el valor R ² será lo más cercano a 1 como sea posible. R representa la suma de los valores cuadrados del ajuste restado de cada punto de datos. Por lo tanto, si R ² es mucho menor que uno, considere rehacer el experimento para obtener uno con datos más confiables. ^[19]

Gráfico 1. Datos reales de BSA obtenidos de un espectrofotómetro UV-Vis de microescala

La ecuación mostrada en la tabla proporciona un medio para calcular la absorbancia y, por lo tanto, la concentración de las muestras desconocidas. En el gráfico 1, x es la concentración y y es la absorbancia, por lo que uno debe reorganizar la ecuación para resolver para x e ingresar la absorbancia de la medida desconocida. ^[20] Es probable que lo desconocido tenga números de absorbancia fuera del rango de la norma. Estos no deberían incluirse en los cálculos, ya que la ecuación dada no puede aplicarse a números fuera de sus limitaciones. En gran escala, se debe calcular el coeficiente de extinción utilizando la Ley de Beer-Lambert A = εLC en la que A es la absorbancia medida, ε es la pendiente de la curva estándar, L es la longitud de la cubeta y C es la concentración siendo determinado. ^[21] En una microescala, una cubeta no se puede usar y, por lo tanto, solo se debe reorganizar para resolver para x.

Tabla 1. Datos de ensayo reales para determinar la concentración de incógnitas según la línea de mejor ajuste de la curva estándar anterior

Para alcanzar una concentración que tenga sentido con los datos, las diluciones, concentraciones y unidades de lo desconocido deben normalizarse (Tabla 1). Para hacer esto, se debe dividir la concentración por el volumen de proteína para normalizar la concentración y multiplicar por la cantidad diluida para corregir cualquier dilución producida en la proteína antes de realizar el ensayo.