Reproducción vegetal

cleistogamia al mecanismo de reproducción por la cual la flor se autopoliniza y se autofecunda debido a que la misma permanece cerrada. Debido a que la flor no se abre la cleistogamia es una forma de autogamia obligada.

Las especies que presentan este mecanismo de reproducción se dicen cleistógamas. La cleistogamia puede ser facultativa u obligada. En el primer caso, la planta presenta flores cleistógamas y flores chasmógamas, es decir que presentan polinización cruzada y que, por lo tanto son capaces de ser fertilizadas por otras plantas. Las especies cleistógamas obligadas, en cambio, solamente presentan flores cleistógamas y, por ende, son estrictamente autógamas: toda su descendencia proviene de la autofecundación de la planta madre. En muchas descripciones de especies se utilizan los términos “predominantemente cleistógama” para indicar que el tipo de reproducción más frecuente es la cleistogamia.

En la familia de las gramíneas la cleistogamia es bastante frecuente. Ha sido descrita en 19 de las 60 tribus en las que se divide la familia. De hecho, 70 géneros de gramíneas presentan especies cleistógamas.

Las flores de las especies cleistógamas, en general, son pequeñas, pasan inadvertidas, presentan pedicelos cortos y en muchas ocasiones están asociadas a floración subterránea(Arachis, Paspalum amphicarpum). Además, es frecuente que presenten anteras más pequeñas o menor número de anteras que las especies chasmógamas relacionadas. En el género Briza, por ejemplo, las especies alógamas y autoincompatibles presentan tres anteras mientras que las dos especies cleistógamas solo presentan una antera y la misma posee solamente un décimo del tamaño.

cleistogamia, cuando la polinización se realiza ya en el capullo o botón floral, la autogamia o sea la fecundación con las gametas del propio polen, es obligada porque las flores no se abren. 
Su ventaja es que permite, a una especie bien adaptada, perpetuarse en un medio más o menos estable.  Su desventaja es que por la autogamia, la especie presenta menor variabilidad hereditaria, y pierde plasticidad evolutiva.
Hay plantas como el maní, Arachis (Leguminosa),  y la violeta, Viola odorata (Violaceae), que presentan los dos tipos de flores: producen flores casmógamas, y al comienzo o al final de la floración presentan flores cleistógamas, de tamaño, forma y color diferentes. EnViola odorata las flores cleistógamas tienen pétalos rudimentarios, y las anteras son más pequeñas, con menor cantidad de polen. 

Viola odorata, violeta
Flor casmógama, vistas lateral y frontal		Estambre
Flor cleistógama, vista lateral y con los sépalos abiertos		Estambre

cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales.

Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.

Iniciación

El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas, con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza, dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán a partir del explanto original dependen de los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una masa aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarán presentes otras estructuras reconocibles como tallos, raíces, bulbos u otros órganos. Estos tejidos cultivados in vitro se hallan dentro de un microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico, protegidos del medio exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo, que pueda entrar al mismo, crecerá de forma oportunista a una velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos.

Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es «cultivar los tejidos», deben proveerse además ciertos requerimientos externos: los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuososolidificado con agar o pueden colocarse en un medio líquido.

Algunos tejidos cultivados son lentos en su crecimiento. Para ellos habría dos opciones: (i) la optimización del medio de cultivo, (ii) El cultivo sano y creciendo vigorosamente tejidos o variedades. ³ Necrosis podría estropear los tejidos cultivados. Generalmente, plantas variedades son diferentes en cultivo de tejidos de necrosis. De este modo, mediante el cultivo de forma saludable y creciendo vigorosamente variedades (o tejidos) se puede controlar.³

Los tejidos también necesitarán de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal, también posiblemente algunasvitaminas, azúcares como fuente de energía y una mezcla de hormonas vegetales que se conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares.

Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo, en general, es necesario el suministro de luz a intensidades muy bajas, mucho menores que la de la luz solar. La acumulación en las plantas de la energía de los carbohidratos provendrá de los azúcares agregados al medio de cultivo, más que de la fotosíntesis, de manera que son innecesarios altos niveles de luz.⁴

Sistemas para los cultivos

En las últimas décadas se han desarrollado diferentes sistemas para los cultivos de protoplastos, células, tejidos y órganos vegetales; uno de ellos es el cultivo en suspensión (suspensiones celulares), el cual constituye una forma para mantener y propagar células vegetales.

Descripción y manipulación de las suspensiones celulares

Las suspensiones celulares consisten en células libres y agregados celulares distribuidos en un medio en movimiento. Estas suspensiones pueden ser permanentes mediante el suministro continuo de nutrimentos.

Medios de cultivo

Para el cultivo de suspensiones celulares de una gran variedad de plantas se ha utilizado el medio MS desarrollado por Murashige y Skoog (1962) para el cultivo de tejidos de tabaco, como también el medio B-5 de Gamborg et al. (1968). También se han utilizado otros medios, pero su composición no difiere mucho de los citados.

A menudo, los medios óptimos para la inducción y crecimiento de callos a partir de explantes primarios no son los mismos que para el establecimiento de suspensiones celulares; el nivel óptimo de auxinas y citocininas, p.ej. puede ser diferente .

En ocasiones las células en suspensión necesitan de suplementos orgánicos, aminoácidos, CH, extracto de levadura, y AC; la auxina más utilizada es 2,4-D.

Iniciación de las suspensiones

Las suspensiones celulares se inician generalmente mediante la incubación de trozos de callos friables en medios líquidos que, están en movimiento continuo.

Comúnmente se emplean matraces Erlenmeyer, en los cuales se deposita el medio líquido con los trozos de callo dispersos en el, hasta llenar aproximadamente 1/5 de la capacidad de tos frascos; estos se ponen luego a incubar en un agitador giratorio a 80-150 rpm, bajo luz continua y a 25 °C de temperatura. Mediante subcultivos semanales, las suspensiones celulares quedan establecidas después de varios días.

Durante los primeros subcultivos es recomendable usar una tasa de dilución baja (por ej. 1:1 a 1:4) utilizando cuatro partes de medio fresco por cada parte de suspensión celular. Posteriormente se puede utilizar una tasa de dilución más alta, según el objetivo para el cual se haya establecido la suspensión.

Objetivos

El cultivo de tejidos vegetales es utilizado como herramienta fundamental en un número importante de áreas y técnicas de la investigación y la producción vegetal, todas ellas relacionadas con lo que actualmente se conoce como biotecnología vegetal.

A continuación se enumeran algunas de las más importantes:

• Estudios básicos de anatomía, desarrollo y nutrición vegetal.
• Variación somaclonal y gametoclonal a través de selección celular.
• Aislamiento de protoplastos. Utilizado para realizar fusión celular (hibridación somática) e ingeniería genética .
• Producción de plantas haploides a través de cultivo de anteras o cultivo de polen.
• Rescate de óvulos fecundados y embriones de cruzamientos interespecíficos e intergenéricos
• Ingeniería Genética: incluye todas las técnicas que utilizan organismos vivos o sus componentes para producir o modificar sus productos. La variedad de aplicaciones incluye las áreas de energía, manejo medio ambiental y productos farmacéuticos y agrícolas.
• Micropropagación vegetal. Propagación clonal o propagación in vitro o propagación vegetativa.
• Embriogénesis somática.
• Cultivo de meristemos para la eliminación de virus y enfermedades presentes en las plantas.
• Producción de fitoquímicos o producción de sustancias de metabolismo secundario.

Base biológica

La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, las células de una planta poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo, sin que medie ningún tipo de fusión de células sexuales o gametos. Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular y es característica de un grupo de células vegetales conocidas como células meristemáticas, presentes en distintos órganos de la planta. La potencialidad de una célula diferenciada (una célula de conducción, epidérmica) para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o completamente según las condiciones de cultivo a las que se la someta. ⁵

El éxito en la propagación de una planta depende de que se logre la expresión de la potencialidad celular, es decir, de que algunas células recuperen su condición meristemática. Para ello debe inducirse primero la desdiferenciación y luego la rediferenciación celular.

En condiciones naturales, un proceso de este carácter sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemasadventicias o cuando se busca la propagación de cualquier planta.

Entre los factores más importantes para lograr la respuesta morfogenética deseada se encuentra la composición del medio de cultivo. En todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del proceso de diferenciación está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo, ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales. Esos compuestos, denominados reguladores del crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagación de una planta.⁵

Historia

La totipotencialidad celular fue enunciada como teoría por Gottlieb Haberlandt en 1902, quien propuso que todas las células vegetales tienen la capacidad de regenerar plantas completas.⁶ Haberlandt no llegó a demostrar su hipótesis debido a que no pudo lograr la división celular ya que los medios de cultivo que empleaba no incluíanreguladores del crecimiento debido a que esos compuestos eran desconocidos en ese momento.^7 8 En 1934, Philip White pudo mantener, en forma ilimitada, el crecimiento de raíces en medios líquidos a partir de ápices del tallo del tomate.⁹

Al mismo tiempo se identificó el ácido indolacético (AIA), que posibilitó el mantenimiento indefinido de callos de zanahoria y tabaco in vitro. Posteriormente se descubrió el efecto de la leche de coco como estimulante de la formación de callo sobre el cultivo de embriones de Datura stramonium. En 1948 Folke Skoog y Cheng Tsui, trabajando con cultivos de callo de tabaco, demostraron la existencia de una regulación química en la parte aérea y en la raíz.¹⁰ Trabajos posteriores en callos de la misma especie, con el agregado de cinetina, la primera citocinina descubierta, permitieron demostrar que la diferenciación de brotes, raíces o de ambos, estaba regulada por el balance de auxinas y citocininas.¹¹

Etapas del proceso

El cultivo de tejidos vegetales es el proceso que se inicia con un explanto y termina con la obtención de plantas completas, lo que involucra una serie de etapas, las cuales se enumeran a continuación:

• Elección de la planta y/o tejido donante de explantos. En esta fase se incluyen los tratamientos, preparación y selección de las plantas madre a partir de las cuales se inicia el cultivo, siendo imprescindible comprobar la identidad (especie, variedad o cultivar) y su estado de salubridad (libre de patógenos, deficiencias oestrés).
• Establecimiento: consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial para inducir: callo, brote, raíz o embrión somático, según se desee. Se requiere desinfectar superficialmente el material escogido para evitar que en el medio de cultivo crezcanmicroorganismos, principalmente bacterias y hongos, que competirán ventajosamente con el explanto
• Multiplicación: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.
• Enraizamiento: es el proceso de inducción de la formación de raíces con el fin de convertir a los brotes o embriones somáticos en plántulas completas. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de reguladores de crecimiento o que sólo contenga auxinas. Esta operación se realiza en condiciones de esterilidad (en cabina de flujo). En el segundo caso los brotes se sumergen en una solución concentrada de auxinas y se transfieren a un sustrato limpio, no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turbacon perlita o vermiculita. Los brotes que se utilicen en el enraizamiento ex vitro deben ser vigorosos y poseer hojas bien desarrolladas, ya que las plantas deben realizar la fotosíntesis para obtener la energía necesaria para desarrollarse y formar las raíces.
• Rusticación: es el paso de aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones del ambiente usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo o algún sustrato inerte.⁵

El enraizamiento ex vitro permite que la fase de enraizamiento y la fase de aclimatación se logren simultáneamente y que raramente se forme callo en la base de los explantos, asegurando así una conexión vascular continua entre el vástago y la raíz.¹²

Tipos de morfogénesis

En condiciones de cultivo in vitro, las células somáticas pueden regenerar embriones o bien, brotes, raíces y/o flores. La embriogénesis somática y la organogénesis son dos procesos morfogénicos muy frecuentes en el cultivo in vitro de especies vegetales.

La embriogénesis somática es el proceso por el cual se obtiene una estructura similar a un embrión cigótico sin que medie la fertilización de las gametas, mientras que por organogénesis pueden obtenerse tallos, raíces o flores.

Estos órganos se obtienen a partir de una célula o de un grupo de células a través de un complejo proceso denominado regeneración. La regeneración comprende diferentes fases que se suceden de manera similar tanto para la organogénesis como para la embriogénesis somática.¹¹ Estas fases se denominan: adquisición de la competencia, fase de inducción y fase de realización.¹³

En la primera fase, las células no responden al estímulo organogénico pero adquieren esa competencia durante una fase de desdiferenciación. En la segunda fase o fase de inducción, las células son receptivas al estímulo morfogénico y hay una relación directa con el tipo, concentración y combinación de reguladores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el órgano a desarrollar. En la fase de realización, la célula sufre las sucesivas divisiones para formar el órgano determinado.

A partir de la siembra in vitro de diferentes explantos relativamente grandes y en condiciones de cultivo adecuadas, puede inducirse la formación de nuevos órganos de manera directa, sin la formación de callo.

Si la formación es de brotes, raíces o flores se denomina organogénesis directa. Si en cambio, se induce la formación de embriones somáticos, este proceso se denominará embriogénesis directa. Si por el contrario, a partir de la siembra de un explante in vitro se observa la proliferación de células en forma desordenada y sin ninguna función predeterminada, se iniciará la producción de callos o suspensiones celulares. La diferenciación de órganos a partir de callos, denominada morfogénesis indirecta, estará condicionada a la previa formación de los meristemoides.

“Cultivo de tejidos vegetales” es una descripción genérica que involucra diferentes técnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluyendo las de protoplastos (células desprovistas de su pared celular), células, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y otras técnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en condiciones ambientales controladas (ver Cuaderno Nº 56).
Las primeras experiencias relacionadas al cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recién en 1922 se logró el primer experimento exitoso: germinación in vitro de semillas de orquídeas. Luego de la germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones asépticas, y así se mantuvieron protegidas del ataque de patógenos (hongos, virus y bacterias).
Esta técnica tiene numerosas aplicaciones (ver Cuadernos 5, 26, 56, 89, 93): 

•	Propagación masiva de plantas, especialmente beneficiosa para especies de difícil
•	propagación por otros métodos, o en vías de extinción

•	Clonación de individuos de características agronómicas muy deseables durante todo el año

•	Obtención de plantas libres de virus
•	Producción de semillas sintéticas

•	Conservación de germoplasma: material de un conjunto de individuos que representa la variabilidad genética de una población vegeta

•	Obtención de metabolitos secundarios
•	Producción de nuevos híbridos

•	Mejora genética de plantas, incluyendo obtención de plantas transgénicas

•	Germinación de semillas.
•	Producción de haploides.

•	Estudios fisiológicos diversos.

Algunas de estas aplicaciones se ilustran en la Figura 1. 

Figura 1. Aplicaciones del cultivo de tejidos en plantas. A la izquierda, micropropagación de violeta africana a partir de trozos de hojas desinfectados e introducidos en condiciones de esterilidad. A la derecha, semillas sintéticas formadas por embriones somáticos, obtenidos por cultivo de células, encapsulados en una matriz inerte (como alginato de calcio). Fotografía tomada de:http://www.sp.edu.sg/schools/cls/bioline_08.htm

Las bases biológicas del cultivo de tejidos: la totipotencialidad celular
Antes de comenzar con la descripción del cultivo de tejidos vegetales y sus aplicaciones, se muestra la anatomía de una planta en la figura 2.

Figura 2: las partes de una planta angiosperma. Adaptado del Libro “Biotecnología”, UNQ 2006.

Respecto del proceso de transformación vegetal, existen distintas técnicas para la transferencia de genes a las células vegetales, siendo las principales la interacción con bacterias del género Agrobacterium y el método de Biobalística (Cuadernos 18 y 28, respectivamente). Una vez realizada la transformación genética por alguno de estos dos métodos, el paso siguiente es el cultivo in vitro, con el fin de regenerar plántulas a partir del explanto inicial transformado, proceso que se sustenta en el principio de “totipotencialidad celular” (ver Cuaderno Nº 56, 98). De aquí la importancia del cultivo in vitro como paso fundamental para la obtención y regeneración de plantas genéticamente modificadas (ver figura 3).

Figura 3. Cultivo de tejidos y transformación vegetal. En la figura se observan explantos que, luego del proceso de selección, han perdido coloración y, aquellas células transformadas exitosamente, se han desdiferenciado y rediferenciado para dar origen a un brote (ver texto).

La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, las células de un individuo vegetal poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo, sin que medie ningún tipo de fusión de células sexuales o gametos. Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular (ver Cuaderno Nº 56, 70, 83), y es característica de un grupo de células vegetales conocidas como células meristemáticas, presentes en distintos órganos de la planta. Básicamente, la reproducción asexual se puede realizar debido a que las células vegetales poseen un mecanismo de división mitótico, al igual que las células animales, mediante el cual cumplen sucesivas etapas de crecimiento y desarrollo. La división celular mitótica implica una replicación de los cromosomas de las células hijas, por lo que las  mismas poseen un genotipo idéntico al de la célula madre. La potencialidad de una célula diferenciada (una célula de conducción, epidérmica, etc.) para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o completamente según las condiciones de cultivo a las que se la someta (ver Cuaderno Nº 70, 80, 83).
Así, las células vegetales crecidas en condiciones asépticas sobre medios de cultivo adicionados con hormonas vegetales, pueden dividirse dando dos tipos de respuesta:
i)  una desdiferenciación celular acompañada de crecimiento tumoral, que da lugar a una masa de células indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las condiciones adecuadas es capaz de generar órganos o embriones somáticos (llamados así porque son estructuras similares a un embrión pero que no se originaron por unión de gametas),
ii) una respuesta morfogenética por la cual se forman directamente órganos (organogénesis) o embriones (embriones somáticos).
La primera respuesta se conoce como organogénesis o embriogénesis indirecta (mediada por un estado de callo) mientras que la segunda respuesta se considera organogénesis o embriogénesis directa. 
Como se comentó previamente, el cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (a la que se denomina explanto, como por ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristema, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerará una o muchas plantas.
La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido desdiferenciado (callo), crecer yemas y raíces, u obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales.
El éxito en la propagación de una planta dependerá de lograr la expresión de la potencialidad celular total, es decir, que algunas células recuperen su condición meristemática. Para lograrlo, debe inducirse  primero la desdiferenciación y luego la rediferenciación celular. Un proceso de este carácter sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias o cuando se busca la propagación de Begonias, Violeta africana (ver figura 1) o Peperonias mediante porciones de hojas. Entre los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfogenética deseada, es la composición del medio de cultivo.
En todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del proceso de diferenciación depende del genoma de la especie, y está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo, también se sabe que ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales. Esos compuestos, denominados reguladores del crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagación de una planta

Pasos para generar plantas a partir de explantos aislados
En los protocolos utilizados durante el cultivo in vitro, se pueden distinguir las siguientes etapas (sintetizadas en la figura 4):
1)Elección de la planta y/o tejido donante de explantos.
2)Establecimiento: desinfección de los explantos (generalmente con  hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático, según se desee.
3)Multiplicación: generar una masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.
4)Enraizamiento: formación de raíces con el fin de convertir los brotes o embriones somáticos en plántulas completas.