Biología celular

Apoptosis

La proteína Apaf-1 (Apoptosis protease-activating factor-1) es un regulador clave de la vía apoptótica mitocondrial, siendo el elemento central del complejo multimérico denominado apoptosoma, formado también por la procaspasa-9 y elcitocromo c.

Las actividades Apaf se describieron por primera vez en experimentos in vitro para recuperar la actividad caspasa a partir de fracciones citosólicas de células HeLa. Apaf-1 resultó ser una molécula adaptadora con homología con la proteína CED-4 de C. elegans, mientras que Apaf-2 y Apaf-3 fueron identificados como el citocromo c y la caspasa-9 respectivamente (Zou et al. 1997).

La formación de la estructura del apoptosoma se desencadena con la liberación de la mitocondria del citocromo c mediada por la familia Bcl-2. Una vez liberado, el citocromo c se une a Apaf-1 formando un primer complejo. Esta unión viene definida por la existencia en el extremo C-terminal de Apaf-1 de varios dominios WD40 de unión proteína-proteína como los presentes en la subunidad b de las proteínas G heterotriméricas. Apaf-1 presenta también un dominio de reclutamiento de caspasas (CARD) que, en condiciones de inactividad, estaría “secuestrado” por dos de los dominios WD40, pero que se libera con la unión del citocromo c. La exposición de los dominios CARD permite a Apaf-1 reclutar a la procaspasa-9 en presencia de dATP que media la oligomerización del complejo. Una vez unida, la procaspasa-9 sufre un autoprocesamiento dando lugar a su forma activa de caspasa-9, una caspasa iniciadora capaz de activar caspasas efectoras como la caspasa-3. Esta sucesión de acontecimientos acaba desembocando en la activación de otras caspasas y de factores de degradación de ADN que se encargarían de fragmentar el material genético.

APAF1 juega un papel esencial en la apoptosis. En presencia de citocromo c (123970) y dATP, APAF1 se ensambla en un apoptosome oligomérica, que es responsable de la activación de la procaspasa-9 (CASP9; 602,234) y el mantenimiento de la actividad enzimática de procesado de caspasa-9 (Bao et al,. 2007).

Clonación y expresión

De citosol de la célula HeLa, Zou et al. (1997) purificado y clonado un cDNA de APAF1, una proteína de 130 kD que participa en la activación de c-dependiente de citocromo de la caspasa-3 (CASP3; 600,636). Los NH2-terminal de 85 aminoácidos de APAF1 muestran 21% de identidad con el prodominio NH2-terminal de la C. elegans CED3 caspasa.Los próximos 320 aminoácidos muestran 22% de identidad con CED4, una proteína que se cree que iniciar la apoptosis en C. elegans. La región COOH-terminal de APAF1 comprende múltiples repeticiones WD, que se proponen para mediar interacciones proteína-proteína. El citocromo c se une a APAF1, un evento que puede desencadenar la activación de CASP3, lo que lleva a la apoptosis. En una pantalla de RT-PCR de diversas líneas de células y tejidos normales y tumorales, Hahn et al. (1999) identificaron 3 variantes de APAF1. Estas formas varían en longitud, pero el análisis de secuencia indicaron que cada una contenía todos los dominios funcionales previamente caracterizadas por Zou et al. (1.997).

Función Génica

La activación de la procaspasa-9 por APAF1 en el citocromo c / dATP vía dependiente requiere la escisión proteolítica para generar la molécula de caspasa maduro. Srinivasula et al. (1998) mostraron que la supresión de la APAF1 WD40 repite hace APAF1 constitutivamente activo y capaz de procesar la procaspasa-9 independiente de citocromo c y dATP. Procesamiento mediada por APAF1 de procaspasa-9 se produce en asp315 por una actividad autocatalítica intrínseca de procaspasa-9 en sí. Srinivasula et al. (1998) proporcionan evidencia de que APAF1 puede formar oligómeros y puede facilitar la procaspasa-9 autoactivación oligomerizando sus moléculas precursoras. Una vez activada, la caspasa-9 puede iniciar una cascada bioquímica que implica los verdugos aguas abajo caspasa-3, -6, -7 y.El melanoma metastásico es un cáncer mortal que no responde a la quimioterapia convencional. Las mutaciones en p53 (191.170) ocurren a menudo en cánceres agresivos y quimiorresistentes pero rara vez se observan en el melanoma.Soengas et al. (2001) mostraron que los melanomas metastásicos a menudo pierden APAF1. La pérdida de expresión APAF1 fue acompañado por la pérdida alélica en melanomas metastásicos, pero podría ser recuperado en líneas celulares de melanoma por tratamiento con el inhibidor de la metilación 5-aza-2-prime-desoxicitidina (5aza2dC).Melanomas APAF1-negativos eran invariablemente quimiorresistentes y fueron incapaces de ejecutar un programa apoptótico típico en respuesta a la activación de p53. Restauración de los niveles fisiológicos de APAF1 través de la transferencia de genes o tratamiento 5aza2dC notablemente mejorada quimiosensibilidad y rescató a los defectos asociados con la pérdida de apoptosis APAF1. Soengas et al. (2001) concluyeron que APAF1 se inactiva en melanomas metastásicos, dando lugar a defectos en la ejecución de la muerte celular apoptótica. Robles et al. (2001) identificaron un elemento sensible a p53 clásico aguas arriba del sitio de inicio de transcripción APAF1 que unía a p53 y la expresión génica inducida APAF1. La apoptosis en una línea celular linfoblastoide, causada por daño en el ADN debido a la exposición a la radiación o a la doxorrubicina, inducida APAF1 ARNm y la expresión de proteínas ionizante y era estrictamente dependiente de p53 de tipo salvaje función. Robles et al. (2001) concluyeron que APAF1 es un efector aguas abajo esencial de la apoptosis mediada por p53. Fortin et al. (2001) identifica los sitios de unión 2 p53 consenso en el promotor del ratón APAF1. Por ensayos de cambio de movilidad electroforética y transfecciones transitorias de APAF1 reportero construye promotor en células neuronales de ratones, demostraron que ambos sitios fueron utilizados por p53. Los cultivos primarios de neuronas APAF1 deficientes estaban protegidos de manera significativa de la apoptosis inducida por p53. Furukawa et al. (2002) identificado un E2F1 (189971) unión a elemento dentro de la región promotora del APAF1 humana y confirmó la unión en un ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina. Ellos encontraron que la apoptosis inducida por E2F1-fue acompañado por la caspasa-9 de activación y una mayor expresión de APAF1 sin la acumulación citosólica de citocromo c. La sobreexpresión de APAF1 dio lugar a la activación directa de la caspasa-9 sin daño mitocondrial e inició una cascada de caspasas. Marsden et al. (2002)establecieron que la vía de la muerte celular controlada por BCL2 (151,430) no requiere de la caspasa-9 o su activador APAF1. En consonancia con su evidencia de que ni se requiere para la homeostasis hematopoyético, en el que la familia BCL2 tiene importantes papeles, la deleción de timocitos con auto-reactividad depende de BIM (603.827), pero no en APAF1. Debido a que la apoptosis se retrasó a lo sumo ligeramente por la ausencia de APAF1 o caspasa-9,Marsden et al. (2002) concluyeron que la apoptosome no es un desencadenante esencial para la apoptosis, pero es más bien una máquina para la amplificación de la cascada de caspasas. Ellos encontraron que la sobreexpresión BCL2 aumentó el número de linfocitos en ratones y se inhibe muchos estímulos apoptóticos, pero la ausencia de APAF1 y la caspasa-9 no lo hizo. Actividad caspasa todavía era perceptible en las células que carecen APAF1 o caspasa-9 y un antagonista de la caspasa potente tanto la apoptosis inhibe y retarda la liberación del citocromo c. Marsden et al.(2002) concluyeron que BCL2 regula un programa de activación de la caspasa independientemente de la citocromo c / APAF1 / caspasa-9 apoptosome, que parece amplificar en lugar de iniciar la cascada de caspasas. Bao et al. (2007)encontraron que las concentraciones fisiológicas de iones de calcio afectan negativamente a la asamblea de apoptosoma mediante la inhibición de intercambio de nucleótidos en la proteína APAF1 autoinhibited monomérica.En consecuencia, el calcio bloqueaba la capacidad de APAF1 para activar la caspasa-9. Bao et al. (2007) concluyeron que la homeostasis del calcio tiene un papel importante en la vía apoptótica APAF1-dependiente.

Características bioquímicas

Crystal Structure Riedl et al. (2005) informaron de la estructura cristalina 2,2-angstrom de un destino a ADP, APAF1 con deleción de WD40, que reveló el mecanismo molecular por el cual APAF1 existe en un estado inactivo antes de unión a ATP. Los N-terminales paquetes de dominio de reclutamiento de caspasas contra un pliegue de 3 capas alfa / beta, un breve motivo helicoidal, y un dominio de alas de hélice, lo que resulta en el entierro de la CASP9 (602.234) unión a la interfaz. La molécula de ADP profundamente enterrados sirve como un centro de organización para fortalecer las interacciones entre estos 4 ámbitos colindantes, bloqueando así APAF1 en una conformación inactiva. APAF1 se une e hidroliza ATP / dATP y sus análogos. Riedl et al. (2005) llegaron a la conclusión de que la unión y la hidrólisis de los nucleótidos parecen conducir cambios conformacionales que son esenciales para la formación del apoptosoma y la activación de CASP9.

Cartografía

Por hibridación in situ fluorescente, Kim et al. (1999) asignan el gen en el cromosoma 12q23 APAF1.

Genética molecular

Harlan et al. (2006) estudiaron APAF1 variantes para determinar fenotipos moleculares utilizando una reconstrucción in vitro del complejo apoptosome en el que Apaf-1 activa la caspasa-9 y de este modo inicia una cascada de eventos que conducen a la destrucción proteolíticas apoptótica de la célula. Fenotipos celulares se midieron usando un ensayo de expresión heteróloga de la levadura. Variantes Humanos codificadas por alelos APAF1 que segregan con depresión mayor en familias vinculadas al cromosoma 12q (MDD1; 608520) demostraron un fenotipo común de ganancia de función en ambos sistemas de ensayo. Por el contrario, otras variantes APAF1 mostraron neutrales o la pérdida de función de fenotipos. Al Harlan et. (2006) concluyeron que los alelos depresión asociada tienen un fenotipo común que es distinta de la de las variantes no asociados, lo que sugiere un papel etiológico para mejorar la apoptosis en la depresión mayor.

Modelo Animal

La proteína citosólica APAF1, homólogo humano de C. elegans ced-4, participa en la activación CASP9 dependiente de CASP3 en la vía apoptótica general. Cecconi et al. (1998) generada por trampa de genes un alelo nulo del APAF1 murino. Mutantes homocigotos murieron en el día embrionario 16.5. Su fenotipo incluido graves malformaciones craneofaciales, el crecimiento excesivo del cerebro, la persistencia de las bandas interdigitales, y alteraciones dramáticas de la lente y la retina. Fibroblastos de embriones homocigotos mostraron disminución en la respuesta a diversos estímulos apoptóticos. En la inmunodetección situ mostró que la ausencia de la proteína APAF1 impidió la activación de Casp3 in vivo. De acuerdo con la función informado de CED-4 en C. elegans, este fenotipo se puede correlacionar con un defecto de la apoptosis. Cecconi et al. (1998) sugirieron que APAF1 es esencial para la activación Casp3 en el cerebro embrionario y es un regulador clave de la muerte celular programada de desarrollo en los mamíferos. Yoshida et al. (1998) también produjo ratones APAF1 deficientes que presentaban reducción de la apoptosis en el cerebro y anormalidades craneofaciales sorprendentes con la hiperproliferación de las células neuronales. APAF1 células deficientes eran resistentes a una variedad de estímulos apoptóticos, y el procesamiento de las caspasas-2, -3, -8 y se veía afectada. Sin embargo, tanto APAF1 - / - timocitos y linfocitos T activados fueron sensibles a la muerte inducida por Fas, que muestra que la apoptosis mediada por Fas en estas células es independiente de APAF1. Estos datos indicaron que APAF1 juega un papel central en los acontecimientos comunes de la apoptosis dependiente de la mitocondria en la mayoría de las vías de muerte y que este papel es crítico para el desarrollo normal. Honarpour et al. (2000) extendido hallazgos anteriores de la mortalidad perinatal y exencefalia en APAF1 - / - ratones, mostrando que la neurogénesis era aberrante tanto el progenitor neural y la etapa neurona madura en estos ratones. Observaron que 5% de APAF1 ratones mutantes sobrevivieron a la edad adulta sin patología cerebral, pero su desarrollo de las células germinales masculinas exhibió degeneración espermatogonias similar a la observada en Bax (600040) ratones deficientes o ratones que sobreexpresan Bcl2 (151430) o BclxL (Bcl2l1; 600.039).Honarpour et al. (2000) concluyeron que existen alternativas compensatoria vías de apoptosis en ausencia de c- citocromo y la caspasa apoptosis en el desarrollo cerebral 3-mediadas, pero estas vías son esenciales para la espermatogénesis. La mutación 'sobrecrecimiento prosencéfalo' (niebla) en ratones fue descrito originalmente como un autosómica recesiva mapeo mutación espontánea en el cromosoma 10 que produce defectos del cerebro anterior, defectos faciales y espina bífida. Debido a su parecido fenotípica a la proteasa apoptótica factor activador-1 (APAF1) ratones knockout, Honarpour et al. (2001) investigaron la posibilidad de que la mutación niebla es en el gen APAF1.Ellos mostraron que los ratones mutantes carecen de actividad APAF1 niebla, y que APAF1 mRNA se procesa de manera aberrante, lo que resulta en niveles muy reducidos de expresión de mRNA normal. Estos resultados sugirieron fuertemente que la mutación es un defecto niebla APAF1 hypomorphic e implicado la muerte de células progenitoras neurales en la patogénesis de la espina bífida. Debido a una deficiencia completa en APAF1 usualmente resulta en letalidad perinatal y la niebla / niebla ratones homocigotos sobrevivir más fácilmente en la edad adulta, estos mutantes sirven como un valioso modelo con el que la muerte celular por apoptosis puede ser estudiado in vivo.La enfermedad de Huntington (HD; 143100) es causado por la expansión de un tracto de poliglutamina cerca del término N de la huntingtina (HTT; 613004) de proteínas. Mutant formas huntingtina agregados en cuerpo estriado y la corteza, donde se produce la muerte celular extensa. Sang et al. (2005) reportaron que la muerte celular inducida por poliglutaminas se suprimió de manera espectacular en las moscas que carecen Oscuro, el homólogo de mosca de APAF1 humano. Oscuro parece desempeñar un papel en la acumulación de agregados que contienen poliglutamina.También se observó una supresión de la muerte celular, la activación de caspasas, y la formación de agregados cuando la huntingtina mutada exón 1 se expresó en homocigotos moscas Dark-mutantes. Ampliado poliglutamina indujo un marcado incremento en la expresión de la Oscura, y Dark se observó a colocalize con agregados de proteínas ubiquitinadas. APAF1 resultó colocalize con agregados que contiene huntingtina en un modelo murino y HD cerebro, lo que sugiere un papel común para Dark / APAF1 en la patogénesis de poliglutamina en los invertebrados, los ratones, y el hombre. Estos hallazgos sugieren que la limitación de la actividad APAF1 puede aliviar tanto la agregación de proteínas patológica y la muerte de las células neuronales en HD. El Apoptosoma es un complejo implicado en el proceso de apoptosis por vía intrínseca. Este complejo surge de la unión de la proteína Apaf-1 (factor de activación de la apoptosis) con elcitocromo c.1 El apoptosoma produce la activación de la procaspasa 8, para dar lugar a lacaspasa 8. Se producen una serie de activaciones en cascada hasta llegar a la caspasa 3,2 la cual se encarga de la activación de CAD (desoxirribonucleasa) separándolo del inhibidor ICAD. CAD induce la fragmentación de DNA que conduce a la muerte celular por apoptosis.