Biología celular

Apoptosis

Las caspasas son un grupo de proteínas perteneciente al grupo de las cisteín-proteasas, caracterizadas por presentar un residuo de cisteína que media la ruptura de otras proteínas. En el caso de las caspasas el corte se produce al nivel de un residuo de aspartato de lo que deriva su nombre (cisteinil-aspartato proteasas). Las caspasas son mediadores esenciales de los procesos de apoptosis, la muerte celular programada, de especial relevancia en los procesos morfogenéticos del desarrollo embrionario. Algunas caspasas también están implicadas en procesos de maduración proteica como en el caso de mediadores del sistema inmune del tipo de la interleucinas. Por estos motivos, fallos en los procesos mediados por caspasas son algunos de los principales responsables del desarrollo de tumores y enfermedades autoinmunes, así como una excesiva activación se cree vinculada con enfermedades como el Alzheimer.

Clasificación y estructura

La familia de las caspasas está compuesta por 14 proteínas de las que 11 se corresponderían con proteínas humanas. La primera en descubrirse fue la enzima convertidora de interleucina-1-b (ICE), conocida desde entonces como caspasa-1 y responsable de la maduración de la pro-interleucina-1-b a su forma pro-inflamatoria y biológicamente activa. La importancia de las caspasas como responsables de los procesos de apoptosis fue establecida por Robert Horvitz y colaboradores al encontrar que el producto del gen ced-3, una cisteín-proteasa análoga de ICE, estaba implicado en los procesos de muerte celular durante el desarrollo de C. elegans. Estudios posteriores permitieron clasificar el resto de la familia de las caspasas en función de su orden de descubrimiento y filogenéticamente en dos grupos, el grupo inflamatorio que estaría formado por los homólogos de ICE como la caspasa-11, y el grupo apoptótico, formado por las relacionadas con ced-3 como las caspasas-3 y -7. Aunque ambos grupos presentan similitudes en cuanto a la especificidad de sustrato, el primero mediaría la maduración de citocinas pro-inflamatorias y el segundo el procesamiento de productos que desencadenarían cambios celulares incluyendo degradación delADN, condensación de cromatina y desintegración de la membrana plasmática.

Las caspasas contienen tres dominios: un prodominio N-terminal, una subunidad grande (p20) que contiene el centro activo con cisteína dentro de un motivo conservado QACXG, y una subunidad pequeña (p10) en el C-terminal. Las caspasas son unas de las proteasas más específicas con un requerimiento inusual y absoluto de cortar después de un residuo de ácido aspártico (Asp). El prodominio y la subunidad grande están separados por un lugar de corte con Asp, y la subunidad grande está separada de la pequeña por uno o dos motivos de este tipo. La presencia de Asp en los motivos de corte para la maduración es consistente con la habilidad de las caspasas de autoactivarse o de ser activadas por otras caspasas como parte de una cascada de amplificación.

Aparte de clasificarse por su filogenia y función general, las caspasas se pueden clasificar en dos tipos según su función en las diversas cascadas de señalización intracelular en las que median: caspasas iniciadoras y caspasas efectoras. Las caspasas iniciadoras como las caspasas-8 y -9 procesan las formas inactivas de las caspasas efectoras como las caspasas-3 y -7, activándolas. Las caspasas efectoras una vez activadas procesan a su vez otros sustratos proteicos que mediarán en las distintas vías de apoptosis. La iniciación de estas reacciones en cascada está regulada por inhibidores de caspasas.

Regulación y mecanismos de acción

Como ya se ha comentado, las caspasas están reguladas a nivel postraduccional, asegurando así que puedan ser activadas rápidamente. En un primer momento son sintetizadas como zimógenos inactivos (pro-caspasas) con su estructura clásica consistente en un prodominio, una subunidad pequeña y una subunidad grande. Las caspasas iniciadoras poseen un prodominio mayor que las caspasas efectoras que contiene dominios como los de reclutamiento y activación de caspasas (CARD) en el caso de caspasa-2 o caspasa-9 (ver Apaf-1) o efectores de muerte celular (DED) en el caso de caspasa-8 y -10, que le permite interactuar con otras moléculas que regulan su activación. Estas moléculas responden a estímulos, ocasionando el agrupamiento de las caspasas iniciadoras, lo que les permite autoactivarse y así proceder a activar a las caspasas efectoras. En todos los casos estudiados, la enzima madura es un heterotetrámero que contiene dos heterodímeros p20/p10 y dos centros activos. Existen tres mecanismos generales de activación de caspasas:

1. Activación por otra caspasa: Con base a su estructura en la que un punto de corte de Asp separa el prodominio de p20 y uno o dos separan p20 de p10 se puede suponer que una posibilidad de activación sea la autocatálisis, es decir, la activación de una pro-caspasa exponiéndola a otra previamente activada. Esta estrategia de activación denominada cascada de caspasas es muy utilizada por las células para la activación de las caspasas efectoras de prodominio corto. La cascada de caspasas es un método útil para amplificar e integrar las señales proapoptóticas, pero no pueden explicar cómo se activó la primera caspasa. Existen al menos dos aproximaciones que explican dicha activación.
2. Activación inducida por proximidad: la caspasa-8 es la caspasa iniciadora clave en la vía de los receptores de muerte. Después de la unión del ligando, los receptores de muerte como Fas se agregan y forman un complejo de señalización de membrana. Estos complejos reclutan, a través de sus proteínas adaptadoras, varias moléculas de procaspasa-8 con lo que se aumenta la concentración local de zimógeno. En estas condiciones, la baja e intrínseca actividad proteasa de la procaspasa-8 es suficiente para permitir que varias moléculas inactivas se corten mutuamente y se activen unas a otras.
3. Asociación con una subunidad reguladora: el mecanismo de activación más complejo es el utilizado por la caspasa-9. Al contrario que en otras caspasas, el procesamiento proteolítico de la procaspasa-9 tiene un efecto mínimo en su activación. El requerimiento clave para la activación de la caspasa-9 es su asociación con un cofactor de proteínas, Apaf-1. También es necesario el citocromo c liberado por la mitocondria. El citocromo c y Apaf-1 se asocian en un proceso ATPdependiente. La oligomerización de Apaf-1 recluta procaspasas-9 formando el apoptosoma. La activación de la caspasa-9 es debida a un cambio conformacional, no a exclusivamente a la proteolisis.

En resumen, las caspasas efectoras se activan proteolíticamente por otras caspasas mientras que las caspasas iniciadoras son activadas por interacciones reguladas proteína-proteína. La cascada de caspasas puede ser activada por la granzima B liberada por los linfocitos T citotóxicos (CD8+) y que activa las caspasas-3 y -7, por receptores de muerte celular como Fas, TRAIL o TNF que activan las caspasas-8 y -10 o por el apoptosoma, regulado por la familia Bcl-2 y el citocromo c que activa la caspasa-9. Una vez activada esta cascada, procesos de retroalimentación positiva aseguran que la célula inevitablemente sufrirá apoptosis. Por ejemplo, la caspasa-9 activada por el apoptosoma procesa y activa la caspasa-3 que, además de procesar sus proteínas diana, procesa a la propia caspasa-9, aumentando la concentración de su forma activa.

Algunas de las dianas finales de las caspasas incluyen las láminas nucleares, el sistema de fragmentación de ADN ICAD/DFF45, la poli-ADP-ribosa polimerasa (PARP) y la kinasa PAK2. La contribución exacta de las diferentes caspasas y el procesamiento de sus respectivas dianas a la apoptosis es todavía incierta. Sin embargo, sí se sabe que la inactivación del complejo ICAD/DFF45 mediada por caspasas permite a la proteína CAD entrar en el núcleo y fragmentar el ADN, originando la característica "escalera de ADN" que se observa en células apoptóticas.

CASPASAS

La mayoría de los cambios morfológicos que observaron Kerr et al ( Kerr JFR, 1972 ) se deben a un grupo de cisteína proteasas que se activan específicamente en las células apoptóticas. Estas proteasas son homólogas entre si y forman parte de un gran familia de proteínas denominadas caspasas ( Alnemri, ES, 1996). Se denominan caspasas pues son c isteín prote asas específicas de ácido asp ártico. Las caspasas están altamente conservadas en la evolución y pueden ser encontradas desde humanos, pasando por insectos y nematodos hasta la Hidra (Budihardjo I, Cikala M, Earnshaw WC, 1999).

El prototipo de caspasa es la enzima convertidora de interleukina-1 b (ICE, caspasa-1) e inicialmente fue identificada como la proteasa responsable de la maduración de la pro-interleukina 1b a su forma pro-inflamatoria y biológicamente activa (Cerretti et al, 1992; Thornberry et al 1992). Aunque la caspasa-1 no tiene un papel obvio en la muerte celular, fue el primer miembro identificado de una gran familia de proteasas cuyos miembros tienen distintos papeles en inflamación y apoptosis.

La familia génica de las caspasas contiene 14 miembros en mamíferos de los que se conocen 11 enzimas humanas. El análisis filogenético indica que esta familia de genes está compuesta por dos grandes subfamilias que están relacionadas con ICE (grupo inflamatorio) o con el homólogo de mamíferos de ced-3 (grupo apoptótico). Las caspasas comparten similitudes en la secuencia de aminoácidos, en la estructura y especificidad de sustratos. Las caspasas se expresan como proenzimas (zimógenos) sin actividad biológica que tienen que activarse para poder ejercer su acción.

Las caspasas contienen tres dominios: un prodominio N-terminal, una subunidad larga (p20) que contiene el centro activo con cisteína dentro de un motivo conservado QACXG, y una subunidad pequeña (p10) en el C-terminal. Las caspasas son unas de las proteasas más específicas con un requerimiento inusual y absoluto de cortar después de un residuo de ácido aspártico (Asp) (Stennicke, 1998). El prodominio y la subunidad larga están separados por un lugar de corte con aspártico, y la subunidad grande está separada de la pequeña por uno o dos motivos de corte en Asp. La presencia de Asp en los motivos de corte para la maduración es consistente con la habilidad de las caspasas de autoactivarse o de ser activadas por otras caspasas como parte de una cascada de amplificación.

Debido a la gran importancia que tienen las caspasas en la apoptosis, es razonable comprender como las caspasas son activadas. Las caspasas son sintetizadas como zimógenos enzimáticamente inertes que deben ser cortados proteolíticamente para ser activos. En todos los casos estudiados, la enzima madura es un heterotetrámero que contiene dos p20/p10 heterodímeros y dos centros activos. Existen tres mecanismos generales de activación de caspasas:

a) Activación por otra caspasa: Como su nombre indica, las caspasas son proteasas que cortan después de un residuo de ácido aspártico. Un punto de corte de Asp separa el prodominio de p20 y uno o dos separan p20 de p10. Esto sugiere la posibilidad de activación autocatalítica. Efectivamente, un modo simple de activar una procaspasa es exponerla a otra previamente activada. Esta estrategia de activación denominada cascada de caspasas es muy utilizada por las células para la activación de las tres caspasas que tienen un prodominio corto: caspasa-3, -6 y -7. Estas tres caspasas se denominan caspasas efectoras y son más abundantes y activas que sus primas con un prodominio más largo.

La cascada de caspasas es un método útil para amplificar e integrar las señales proapoptóticass, pero no pueden explicar cómo se activó la primera caspasa. Existen al menos dos aproximaciones que explican dicha activación.

b) Activación inducida por proximidad: La caspasa-8 es la caspasa iniciadora clave en la vía de los receptores de muerte. Después de la unión del ligando, los receptores de muerte como CD95 (Apo-1/Fas) se agregan y forman un complejo de señalización de membrana. Estos complejos reclutan, a través de sus proteínas adaptadoras, varias moléculas de procaspasa-8 con lo que se aumenta la concentración local de zimógeno. En estas condiciones, la baja e intrínseca actividad proteasa de la procaspasa-8 es suficiente para permitir que varias moléculas de proenzima se corten mutuamente y se activen unas a otras.

c) Asociación con una subunidad reguladora: El mecanismo de activación más complejo es el utilizado por la caspasa-9. Al contrario que en otras caspasas, el procesamiento proteolítico de la procaspasa-9 tiene un efecto mínimo en su activación. El requerimiento clave para la activación de la caspasa-9 es su asociación con un cofactor de proteínas, Apaf-1. También es necesario el citocromo c liberado por la mitocondria. El citocromo c y Apaf-1 se asocian en un proceso ATP dependiente. La oligomerización de Apaf-1 recluta procaspasas-9 formando el apoptosoma . La activación de la caspasa-9 es debida a un cambio conformacional, no a proteolisis.

En resumen, las caspasas efectoras se activan proteolíticamente por otras caspasas mientras que las caspasas iniciadoras son activadas por interacciones reguladas proteína-proteína.

Cada caspasa con prodominio largo contiene en su prodominio un módulo de interacción proteína-proteína que permite la unión y asociación con sus reguladores. Las caspasas -8 y -10 contienen un dominio efector de muerte (death-effector domain, DED ) mientras que las caspasas -2 y -9 contienen un dominio de reclutamiento y activación de caspasas (caspase activation and recruitment domain, CARD ). Estos dos dominios comparten tienen secuencias distintas, pero se pliegan en una disposición espacial similar que consiste en seis hélices a antiparalelas (Hofmann K, 1999). El mismo plegamiento lo encontramos en el dominio de muerte (death domain, DD ), una tercera proteína de interacción presente en varios reguladores iniciales de la apoptosis como CD95 y la molécula adaptadora FADD. Parece que DD, DED y CARD derivan de un dominio ancestral común.

Fas es una proteína de superficie de 36 kDa con un dominio citoplasmático de muerte celular conservado. El ligando Fas (FasL o Apo-1) es una proteína de membrana tipo II de 40 kDa miembro de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF) que está altamente expresado en linfocitos activados.

La inducción de los procesos de muerte celular programada o apoptosissupone una activación de unas enzimas citosólicas denominadas caspasas. La activación de estas enzimas puede inducirse por dos vias distintas, una asociada a cambios en la permeabilidad mitocondrial y otra a señales originadas en los receptores de muerte celular, localizados en la membrana plasmática.

La via intrínseca o mitocondrial de la apoptosis es el resultado de la desaparición de estímulos de supervivencia, esto provoca un aumento en la permeabilidad de las mitocondrias que libera al citoplasmas algunas proteínas como el citocromo c que actúa como cofactor de las proteínas activadoras de la apoptosis (Apaf-1). En linfocitos, esta vía no necesita ninguna señal activa secundaria a la activación de los receptores de muerte celular.

La via extrínseca o mediada por receptores de la apoptosis se desencadena tras la unión de ligandos a receptores de muerte celular presentes en la superficie. Uno de estos receptores es Fas (CD95) y su ligando, FasL. FasL se une a Fas en la misma célula o células adyacentes, formándose grupos de tres o más moléculas de Fas. A causa de esta agregación, los dominios de muerte intracelulares de estos receptores agrupados por Fas se unen a una proteína adaptadora que contiene un dominio de muerte citosólico FADD (del inglés "dominio de muerte asociado a Fas"). FADD, por su parte, se fija a la forma inactiva de la caspasa-8 la cual experimenta una autoactivación catalítica y es entonces capaz de activar a otras caspasas efectoras y desencadenar la apoptosis. Esta vía de la apoptosis se llama muerte celular inducida por activación dado que se ve inducida por la activación receptor/ligando y no por la ausencia de estímulos de supervivencia.

La vía Fas/FasL no es exclusiva de la muerte celular inducida por activación. En alguna células no linfocícitas como los hepatocitos las señales inducidas por Fas provocan un aumento de la permeabilidad mitocondrial de forma que las dos vías apoptóticas pueden actuar conjuntamente para desencadenar la apoptosis. La mayoría de las proteínas inductoras y reguladoras de la apoptosis conocidas son productos de genes que son homólogos a otros inicialmente identificados como reguladores de la apoptosis en C. elegans.

Existe una relación estrecha entre la participación del ligando Fas y la citotoxicidad mediada por los linfocitos T CD8+, mecanismo efector de gran importancia en la respuesta inmune antitumoral. Por ejemplo, la inactivación de las señales vía Fas debida a la baja expresión de este antígeno en la membrana puede llevar a la célula a una supervivencia anormal y contribuir al desarrollo y progresión de células transformadas.