Farmacología

Farmacocinética

El modelado farmacocinético fisiologicamente basado (Modelado PBPK por sus siglas en inglés) es una técnica demodelamiento matemático de la farmacocinética para predecir la absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME) de un compuesto en humanos y otras especies animales. El modelado PBPK se usa en investigación y desarrollo farmacéutico, así como en evaluación de riesgo en la salud.

Estructura de ejemplo de un Modelo PBPK.

Descripción

Las modelos PBPK se esfuerzan en ser mecanicistas y matemáticamente transcribir descripciones anatómicas, fisiológicas, físicas, y químicas de los fenómenos de los procesos ADME. Algún grado de simplificación residual y empirismo está todavía presente en esos modelos, pero tienen un dominio extendido de aplicabilidad comparados con los modelos faramacinéticos clásicos. Dada esa propiedad, modelos PBPK puede tener usos puramente predictivos, excepto otros usos, como la inferencia estadística, que se ha hecho posible por el auge de herramientas estadísticas Bayesianas capaces para ocuparse de modelos complejos. Esto es verdadero para la valoración del riego de toxicidad y auge terapéutico de la droga.

Las modelos PBPK hacen un intento para confiar a priori en la estructura anatómica y fisiológica del cuerpo. Éstos son usualmente también modelos del multicompartimiento, pero los compartimientos corresponden a los órganos predefinidos o los tejidos finos, para los cuales las interconexiones corresponden a los flujos de sangre o linfa. Un sistema de ecuaciones diferenciales todavía le pueden ser escritos, pero sus parámetros representan flujos sanguíneos, tasa pulmonar de ventilación, volúmenes del órgano, etcétera, información disponible en publicaciones científicas. Ciertamente la descripción del cuerpo es simplificada y un balance es necesario entre la complejidad y la simplicidad. Además de la ventaja de dejar el reclutamiento de información a priori acerca de valores de esos parámetros, estos modelos también facilitan transposiciones interespecies o extrapolación de un modo de administración a otro (por ejemplo, de inhalación a vía oral). Un ejemplo de un modelo PBTK de 7 compartimientos, adecuado para describir el destino de muchos solventes en el cuerpo mamífero, es dado en la figura lateral.

Historia

Es interesante notar que el primer modelo farmacocinético descrito en la literatura científica¹ fue de hecho un modelo PBPK. Éste llevó, sin embargo, a problemas de cómputo intratables para la época. El foco cambió entonces a modelos más simples, para los cuales se podían obtener soluciones analíticas (aquellas soluciones eran sumas de términos exponenciales, que llevaban más adelante a simplificaciones). La disponibilidad de computadores y algoritmos de integración numérica marcaron un renovado interés en los modelos fisiológicos a principios de los 70s.

Usos del modelado PBPK

Los modelos PBPK son modelos compartimentales como muchos otros, pero tienen unas cuantas ventajas sobre los llamados modelos farmacocinéticos "clásicos", que son menos aterrizados en fisiología. Los Modelos PBPK pueden ser usados en primer lugar para abstaer y eventualmente componer imformacion dispar (De experimentos bioquímicos o fisicoquímicos, experimentos toxicológicos o farmacológicos in vitro o in vivo, etc). También dan acceso a las concentraciones internas de químicos en sus metabolitos, en particular en el sitio de sus efectos, sean terapeuticos o tóxicos. Finalmente, también ayudan a la interpolación y extrapolación de conocimiento entre:

• Dosis: p.e. de las altas concentraciones ocupadas usualmente en experimentos de laboratorio hacia aquellas encontradas en el ambiente.
• Duración de la exposición: p.e. de continua a discontinua, de una a múltiples exposiciones.
• Rutas de administración: p.e. de exposición a la inhalación a la ingestión.
• Especies: p.e., transposiciones de roedores a humanos, antes de dar una droga por primera vez a sujetos en un ensayo clínico, o cuando la experimentación con humanos se considera antiética, como cuando el compuesto es tóxico sin beneficio terapéutico.
• Individuales: p.e., en machos a hembras, de adultos a niños, de no-embarazadas a embarazadas.

Algunas extrapolaciones son "paramétricas": Sólo cambios en los valores de entrada o de parámetros son necesarios para conseguir la correcta exptrapolación (Usualmente casos de extrapolación de dosis y tiempo de exposición). Otros son "no-paramétricos" en el sentido que se necesitó un cambio en el modelo en sí (p.e., cuando se extrapola hacia una mujer emparazada, las ecuaciones del feto deben ser cosideradas).

La P-glicoproteína 1 (glicoproteína de permeabilidad, abreviada como P-gp o Pgp), también conocida como multidrug resistance protein 1 (MDR1), como ATP-bindind cassette sub-family B member 1 (ABCB1), o como clúster de diferenciación 243 (CD243), es una proteína muy importante en la membrana celular que expulsa gran cantidad de sustancias fuera de la célula. Crea un flujo de expulsión de la célula dependiente de ATP con una amplia especificidad de sustrato. Existe en animales, hongos y bacterias, y surgió como un mecanismo de defensa contra sustancias xenobióticas.

Estructura cristalográfica de la proteína MDR3 de ratón. La disposición aproximada de la proteína en la membrana de la célula está indicada por la línea azul (cara extracelular) y por la línea roja (cara citoplasmática).¹

Factor valor	Factor	Up/Down
Leyenda:  - Nº de estudios de genes up/down in
Normal	Estado de la enfermedad	10/3
None	Tratamiento compuesto	3/0
Células estromales	Tipo de célula	1/2
Riñón	Tipo de célula	2/0
MDA-MB-231	Línea celular	0/2
Glioblastoma	Estado de la enfermedad	0/2
Célula epitelial	Tipo de célula	0/2
HeLa	Línea celular	0/2
Primario	Andamiaje de la enfermedad	2/0
Médula ósea	Parte del organismo	0/2
ABCB1 expression data in ATLAS

La P-gp está ampliamente distribuida y se expresa en las células del epitelio intestinal, donde expulsa xenobióticos (como toxinas o fármacos) previamente absorbidos hacia el lumen intestinal; en las células del hígado donde secreta estas sustancias hacia los conductos biliares; en las células del riñón donde secreta estos xenobióticos hacia los túbulos urinarios, y en las células del endotelio capilar formando parte de la barrera hematoencefálica y la hematotesticular. Algunas células tumorales también expresan gran cantidad de P-gp, siendo esta una causa importante de la multirresistencia a los fármacos de algunos cánceres.

La P-gp en humanos está codificada por el gen ABCB1² y constituye un transportador del tipo ABC, responsable del transporte de una amplia variedad de sustratos a través de membranas intra y extracelulares, y pertenece a la subfamilia DMR/TAP³ .

La P-gp fue descubierta en 1971 por Victor Ling.

Función

La P-gp pertenece a la superfamilia de los cassettes transportadores (ABC) de unión al ATP. Estas proteínas ABC transportan diversas moléculas a través de membranas extra e intracelulares, y sus genes se dividen en siete subfamilias distintas (ABC1, MDR / TAP, MRP, ALD, OABP, GCN20, White). Esta proteína es un miembro de la subfamilia MDR / TAP, involucrados en la resistencia a múltiples fármacos. La P-gp es una bomba de flujo de salida de fármacos dependiente de ATP de compuestos xenobióticos con amplia especificidad de sustrato. Es responsable de la disminución de la acumulación del fármaco en células resistentes a múltiples fármacos, y a menudo interviene en el desarrollo de resistencia a los fármacos contra el cáncer. Esta proteína también funciona como un transportador en la barrera hematoencefálica⁴ .

La P-gp transporta diversos sustratos a través de la membrana celular, incluyendo:

• Fármacos como colchicina, tacrolimus y quinidina.
• Agentes quimioterapéuticos como etopósido, doxorrubicina y vinblastina.
• Lípidos.
• Esteroides.
• Xenobióticos
• Péptidos.
• Bilirrubina.
• Glicósidos cardiacos como la digoxina.
• Agentes inmunosupresores.
• Glucocorticoides como la dexametasona.
• Agentes de terapia antirretroviral como los inhibidores de la proteasa y los inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa.

Su capacidad para el transporte de los sustratos mencionados pone de manifiesto la gran cantidad de funciones de la P-gp, entre las que se incluyen:

• La regulación de la distribución y la biodisponibilidad de fármacos.
• El aumento de expresión intestinal de P-glicoproteína puede reducir la absorción neta de fármacos que son sustratos de P-glicoproteína. Por lo tanto, hay una biodisponibilidad reducida, que puede dar lugar a que no se alcancen concentraciones plasmáticas terapéuticas. Por el contrario, cuando la expresión de la P-g está reducida, se pueden alcanzar concentraciones plasmáticas supraterapéuticas con la consiguiente aparición de toxicidad del fármaco. Ej. Digoxina
• La participación de la P-g en el transporte activo de antineoplásicos da como resultado la resistencia de muchos fármacos a ciertos tumores.
• La eliminación de metabolitos tóxicos y xenobióticos a partir de células renales, hepáticas y del lumen intestinal
• El transporte de compuestos fuera del cerebro a través de la barrera hematoencefálica. Ej. La expulsión de la ivermectina y loperamida del sistema nervioso central.
• Protección de las células madre hematopoyéticas de toxinas³ .

La P-gp puede ser inhibida por gran cantidad de fármacos, tales como⁵ :

• Amiodarona.
• Azitromicina.
• Captopril.
• Claritromicina.
• Ciclosporina.
• Piperina.
• Quercetina
• Quinina y quinidina.
• Reserpina.
• Ritonavir.
• Taquiradir.
• Verapamilo.

Estructura

La P-gp es una glicoproteína transmembranal de unos 170 kDa, e incluye una glicosilación N-terminal de 10-15 kDa. El extremo N-terminal de la molécula contiene 6 dominios transmembrana, seguidos por un gran dominio citoplasmático con un sitio de unión de ATP; y una segunda sección con otros 6 dominios transmembrana y un nuevo sitio de unión de ATP que muestra una similitud de aminoácidos de un 65% con la primera parte del polipéptido⁶ . En 2009 se determinó la primera estructura de una P-gp de un mamífero (3G5U)⁷ . La estructura fue determinada a partir del producto del gen MDR3 de un ratón expresado en la levadura Pichia pastoris. La estructura de la P-gp de ratón es similar a la del transportador ABC bacteriano llamado MsbA (3B5W y 3B5X)⁸ , que adopta una conformación orientada hacia dentro, lo cual se cree que es importante para la unión especifica del sustrato a lo largo de la cara interna de la membrana. También se ha determinado la estructura de algunos componentes adicionales de la P-gp, como 3G60 y 3G61, lo cual ha revelado los sitios de unión de dos péptidos sustratos/inhibidores diferentes. La conformación del lugar de unión de la P-gp se alinea con la cadena lateral de los aminoácidos aromáticos. De cualquier manera, la estructura de la P-gp murina es incompleta, ya que falta la secuencia de una cadena intermedia, esencial para el reconocimiento del sustrato y la hidrólisis del ATP. Utilizando simulaciones de dinámica molecular, se ha podido demostrar que esta secuencia tiene un impacto directo en la estabilidad estructural del transportador (en el dominio de unión del nucleótido) y define un menor límite para la conformación interna de unión de fármacos⁹ .

Mecanismo de acción

El sustrato se une a la P-gp ya sea desde una apertura colocada hacia el interior de la membrana o desde la parte citoplasmática de la proteína, y a continuación se une el ATP por el dominio citoplasmático. Una vez que se han producido ambas uniones, la hidrólisis del ATP desplaza el sustrato hacia una posición determinada para que sea excretada de la célula. Así, la liberación de un grupo fosfato se produce a la vez que la excreción del sustrato. Se libera ADP, y una nueva molécula de ATP se coloca en otro lugar de unión específico para él. Una nueva hidrólisis junto con la liberación de ADP y fosfato restablece la conformación original de la proteína, por lo que el proceso puede empezar de nuevo.

Distribución

La P-gp se expresa principalmente en determinados tipos de células del hígado, páncreas, riñón, colon y yeyuno¹⁰ . También puede encontrarse en las células endoteliales capilares del cerebro¹¹ .

Detección de la actividad del transportador

La actividad de esta proteína se puede determinar tanto por ATPasa de membrana como por ensayos de calceína celular. El verapamilo radiactivo se puede usar para medir la función de la P-gp mediante la técnica de tomografía por emisión de positrones¹² .

Historia

La P-gp se clonó y se caracterizó por primera vez en 1976. Se demostró que era la responsable de la resistencia a múltiples fármacos en células cancerosas mutantes cultivadas, que habían desarrollado resistencia a fármacos citotóxicos³ . La estructura de la P-gp se determinó en 2009 mediante cristalografía de rayos X^7 13 .

Uno de los mayores obstáculos a la aplicación de quimioterapia en algunos tipos de tumores es la resistencia de éstos a los fármacos antineoplásicos utilizados, que puede ser intrínseca o adquirirse durante el tratamiento. Uno de los mecanismos mediante el cual se llega a esta resistencia es el de la "multirresistencia a fármacos" (MDR o "multidrug resistance") que, aunque no es el único que se conoce, es el que se va a destacar por su importancia en este artículo. Una de las principales características de la MDR es que, en algunos casos, las células seleccionadas en función de su resistencia a un agente citostático son también resistentes a otros agentes que no poseen ningún tipo de analogía funcional o estructural, pues unos actúan como inhibidores de la síntesis de DNA o RNA, otros intervienen en la formación de tubulina, otros en el potencial de membrana... Lo único que tienen en común estos compuestos es que son anfipáticos y que poseen anillos planos hidrofóbicos. Algunos ejemplos de este tipo de compuestos son los alcaloides de la vinca, las antraciclinas o podofilotoxinas [Gottesman, M.M., Cancer Research 53: 747 (1993)].
Otra característica de la MDR es la superproducción, ya sea por amplificación génica y/o aumento de la expresión, de una glicoproteína de membrana de 170kDa que se denomina glicoproteína P o Pgp (deP-glycoprotein). Esta proteína parece ser la responsable de una disminución en los niveles de fármaco en el interior de las células tumorales mediante un mecanismo de transporte dependiente de ATP (de ahí proviene el nombre de glicoproteína P porque está directamente implicada en la permeabilidad celular) y es el motivo de que algunos cánceres no respondan al tratamiento con fármacos antitumorales, lo que tiene consecuencias fatales para el paciente [Juliano, R.L. y Ling, V., Biochim. Biophys. Acta 455: 152 (1976)]. La comprensión de los mecanismos mediante los cuales se adquiere este tipo de resistencia podría llevar al diseño de una estrategia para revertirla que podría utilizarse en el tratamiento de los enfermos de cáncer.
Aunque en otras especies pueden encontrarse hasta seis genes pertenecientes a la familia mdr, en humanos sólo aparecen dos: el mdr1 que parece ser el responsable del fenotipo MDR, y el mdr2 que ha sido implicado en el transporte de fosfatidil colina [Ruetz y Gros., Cell 77:1071 (1994)].
La Pgp está formada por 1.280 aminoácidos con dos dominios de unión a ATP citoplasmáticos y dos dominios hidrofóbicos, formados cada uno de ellos por seis fragmentos transmembranales que determinan la especificidad de sustrato, al formar la vía por la que éste atraviesa la membrana. Esta estructura se asemeja a la de la superfamilia de proteínas transportadora tipo ABC (de "ATP binding cassette") que cuenta con más de cuarenta miembros en bacterias y en eucariotas.

Un modelo postulado para el mecanismo de acción de esta proteína, es el de "aspirador hidrofóbico" según el cual el fármaco no sólo es bombeado fuera de la célula tumoral sino que también se disminuye su entrada en ésta [Gottesman et al., J. Biol.Chem., 265: 3975 (1990)]. Los compuestos entran por difusión pasiva y son detectados nada más entrar en la membrana y expulsados al exterior de modo que no puedan alcanzar la concentración necesaria para ejercer su efecto citotóxico. Basándose en este mecanismo se ha desarrollado una estrategia en donde el agente antitumoral es suministrado mediante liposomas, facilitando así su entrada al citoplasma sin ser "aspirado" por la glicoproteína P [Thierry, A. R., et al. FASEB J., 572-79 (1993)].
Se ha detectado RNAm de glicoproteína P en muchos tejidos y tipos celulares, lo que sugiere que la proteína es constituyente normal de la célula. Su expresión suele localizarse en células de la corteza adrenal, en la superficie luminal de las células del túbulo proximal renal y en el páncreas, lo que lleva a pensar que el papel fisiológico normal de esta proteína es el de desintoxicante en dichas células. Hay que tener esto en cuenta a la hora de utilizar estrategias de bloqueo de esta proteína demasiado drásticas, por los posibles efectos secundarios que puedan provocar.
Existen varias estrategias para abordar el problema de la MDR, por ejemplo disminuyendo la expresión del gen mdr1 [Deisseroth et al., Am. J. Med., 99: 537 (1995)], pero el que aquí se propone es el uso de inhibidores de la glicoproteína-P. Si la acción de esta proteína pudiera ser modulada, se podría llegar a una concentración intracelular de fármaco suficiente para ejercer su efecto. Existen unos compuestos capaces de revertir la multirresistencia a fármacos en células MDR y que se denominan quimiosensibilizadores. No son tóxicos por sí mismos y, en general, compiten con los fármacos antitumorales por la unión a la Pgp bloqueando así su actividad transportadora y aumentando la concentración intracelular de fármaco que ahora sí alcanza niveles tóxicos. A veces, es necesario utilizar mezclas de quimiosensibilizadores para evitar la aparición de efectos secundarios. De este modo se han utilizado conjuntamente verapamil y quinina, o verapamil y ciclosporina A, con resultados positivos.
Otra aplicación importante es el empleo del gen mdr1 en terapia génica. Uno de los mayores problemas de los quimio- y radioterapeutas es la destrucción indeseada de las células madre (o "stem cells") normales de la médula ósea, debido a las altas concentraciones de fármacos utilizadas. La extracción de la médula de los enfermos de cáncer antes de la terapia y la posterior reinfusión una vez que se haya introducido el gen mdr1 en los precursores hematopoyéticos tempranos, protegería a estos pacientes de los efectos adversos de la quimioterapia, en caso de reincidencia de la enfermedad [Mickish et al.,Blood, 79: 1 (1992)].


Por otro lado, el gen mdr1 también se puede utilizar como marcador seleccionable en terapia génica, ya que es relativamente fácil su introducción en células que no lo expresen así como la selección de aquellas que hayan adquirido el gen mdr1, pues existen gran cantidad de fármacos que pueden utilizarse con este objetivo.