Acoplamiento molecular
Acoplamiento molecular o Docking (del inglés, anclarse). En el campo del Modelado molecular, este es un método que predice la conformación preferida de una molécula, al estar unida a otra, con el fin de formar un complejo estable.1 El conocimiento de la orientación preferida a su vez puede ser usada para predecir la fuerza de la asociación o la afinidad de enlace entre dos moléculas, usando por ejemplo, las funciones de puntuación (o funciones de scoring)
La asociación entre moléculas biológicamente revelantes, tales como proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos y lípidos juega un papel central en la transducción de señal. Por tanto, la orientación relativa del dúo interactúante puede afectar el tipo de señal producida (ejemplo, agonismos contra antagonismo). Por lo que el acoplamiento molecular gana importancia al predecir la fuerza y el tipo de señal producida.
El acoplamiento molecular es usado para predecir la orientación del enlace de una molécula pequeña, que serán candidatos a fármacos, con la proteína que será donde ejercerán su acción, con lo que se podrá predecir la afinidad y la actividad de la molécula pequeña. Y es por eso que este método tiene un rol muy importante en el diseño racional de fármacos.2 Dada la importancia biológica y farmacéutica, se han hecho grandes esfuerzos buscando mejorar el método usado para predecir el acoplamiento molecular.
Definición del problema
Se puede pensar del acoplamiento molecular como algo de "llave-y-cierre", donde lo que interesa conocer la orientación relativa de la "llave" la cual abrirá el "cierre", sobre el cierre, esta la entrada de la llave, en la que se debe girar a la llave luego de insertada, etc). Aquí la proteína se puede ver como el "cierre" y el ligando (molécula que se unirá a la proteína) como la "llave". El acoplamiento molecular puede ser visto como la optimización de un mecanismo, lo cual se describiría como el "mejor encaje" del ligando que se une a una proteína de interés. Sin embargo, tanto el ligando como la proteína son flexibles, tal vez "mano-en-guante" es una analogía que explica esa característica.3 Durante el proceso, el ligando y la proteína ajusta su conformación para lograr el "mejor encaje" global, y esta clase de ajustes conformacionales resultan en el enlazado global se conoce como "encaje-inducido".4
El enfoque de esto es simular computacionalmente el proceso de reconocimiento celular. El objetivo es alcanzar una conformación optima tanto para la proteína, como para su ligando, haciendo que la orientación entre estos minimice la energía libre.
Enfoques del acoplamiento molecular
Hay dos enfoques en particular, que son muy populares en la comunidad del "docking". Uno usa la técnica de parejas que describe la proteína y el ligando como superficies complementarias.5 6 El segundo enfoque simula el proceso mismo de acoplamiento en el que las energías de interacción en el apareamiento proteína-ligando son calculadas.7 Ambos enfoques tienen ventajas significativas tanto como sus limitantes.
Complementariedad de forma
Una complementariedad geométrica es un método que describe la proteína y el ligando como un conjunto de rasgos que los hace acoplables.6 Estos rasgos pueden incluir la superficie molecular, o descriptores de la complementariedad de la superficie. En este caso, la superficie del receptor molecular es descrita en términos de su área superficial de accesibilidad-solvente y la del ligando es descrita en sus términos de descripción a su ajuste a la superficie. La complementariedad entre ambas superficies se suma a la descripción de su compatibilidad que puede ayudar a encontrar la pose complementaria en el acoplamiento con la molécula que es el objetivo del ligando con quien esperamos que se una. Otra enfoque es el describir sus rasgos hidrofóbicos de la proteína usando giros en los átomos de la cadena principal. Otro enfoque más es el de usar la técnica descriptora de la figura de Fourier.8 9 10
Al mismo tiempo que los enfoques que se basan en la complementariedad de forma son normalmente rápidas y robustas, no pueden modelar los movimientos dinámicos y cambios conformacionales en el complejo proteína-ligando de manera precisa, aunque desarrollo reciente les ha permitido a estos métodos investigar la flexibilidad del ligando. Estos métodos pueden escanear rápidamente muchísimos ligandos en cuestión de segundos y lograr deducir si se pueden unir al sitio activo de la proteína, e incluso pueden hacer la escala de la interacción proteína-proteína. También son mucho más flexible a los enfoques farmacóforos, ya que usando las descripciones geométricas de los ligandos para encontrar el enlace optimo.
Simulación
La simulación del procedimiento de acoplamiento como tal, es un proceso muy complicado. En este enfoque, la proteína y el ligando están separados por una distancia física, y el ligando encuentra su posición en el sitio activo de la proteína luego de un cierto número de "movimientos" en su espacio conformacional. Los movimientos incorporan al cuerpo rígido transformaciones tales como el traslado y rotaciones. Cada uno de estos movimientos, en el espacio conformacional del ligando, induce un costo energético al sistema, y por tanto después de cada movimiento, se calcula la energía total del sistema. La ventaja obvia de este método es más fácil incorporar la flexibilidad del ligando en el modelado mientras que la complementariedad de forma tiene que usar unos métodos muy ingeniosos para incorporar la flexibilidad en los ligandos. Otra ventaja es que su proceso es físicamente más cercano a lo que sucede en realidad, cuando la proteína y el ligando se acercan luego del reconocimiento molecular. Un claro inconveniente de esta técnica es que se lleva más tiempo el evaluar la pose óptima de enlace ya que tienen que explorar un muy amplio rango de energía. Sin embargo, en técnicas basadas en rejillas tanto como en métodos de optimización rápida han mejorado mucho estos problemas.
Mecanismos del acoplamiento molecular
Para hacer un examen del acoplamiento, primero se necesita la estructura de la proteína. Normalmente la estructura ha sido determinada usando una técnica biofísica como la cristalografía de rayos X, o menos frecuente, una Espectroscopia de resonancia magnética nuclear. La estructura de esta proteína y la base de datos de ligandos potenciales sirven como los valores a ingresar en el programa que calcula el acoplamiento. El éxito del programa depende de dos factores: el algoritmo de búsqueda y la función de puntuación.
Búsqueda del algoritmo
La búsqueda del algoritmo consiste en la búsqueda espacial de todas las conformaciones y orientaciones posibles que pueden haber en el conjunto proteína-ligando. Con los actuales recursos computacionales, es imposible explorar de manera intensiva la búsqueda del espacio, seria necesario enumerar todas las posibles distorsiones de cada molécula (las moléculas son muy dinámicas y existen en un conjunto de estado) y todas las posibles rotaciones y traslados de orientación del ligando relativo a la proteína a un dado nivel de granularidad. La mayoría de los programas de acoplamiento toman en cuenta la flexibilidad del ligando, y de muchos intentan modelar una proteína aceptora flexible. A cada "captura" se le refiere como pose. Hay muchas estrategias para muestrear la búsqueda de espacio, algunos ejemplos
- Uso de un simulador de grano grueso molecular para proponer poses energéticamente viables
- Uso de una "combinación linear" de múltiples estructuras determinadas por la misma proteína para emular la flexibilidad del receptor
- Uso de un algoritmo genético para "evolucionar" nuevas poses que consecutivamente va representando cada vez más un interacción en el enlace más favorable
Función de puntuación
La función de puntuación toma una pose como dato a introducir y entrega un número indicando si la interacción puede ser favorable.
La mayoría de las funciones de puntuación están basadas en la mecánica de la física molecular por campos de fuerza que estiman la energía de la pose; baja (negativa) energía indica un sistema estable y por tanto con una posibilidad mayor a que así se de la interacción. Un enfoque alternativo es derivar el potencial estadístico para interacciones de una amplia base de datos de complejos proteína-ligando, tales como Protein Data Bank, y evaluar el encaje de la pose según este potencial que se dedujo.
Hay un gran número de estructuras de la Cristalografía de rayos X para complejos de proteínas y ligando de mucha afinidad, pero comparando pocos para ligandos de poca afinidad como los complejos que tienden a ser menos estables y por tanto, más difíciles de cristalizar. Las funciones de puntuación registradas con esta información pueden acoplar ligandos de mucha afinidad de manera correcta, pero también darán un acoplamiento convincente a los ligandos que no enlazan. Esto da un gran número de marcas positivas que son falsas, digamos, un ligando que se predice que enlaza con una proteína cuando en realidad no lo hacen estando una vez juntos en un tubo de ensayo.
Una forma de reducir el número de marcas positivas que son falsas, es recalculando la energía de las poses puntuadas como máximas, usando técnicas (potencialmente) más precisas, pero computacionalmente más intensivas, tales como el método de Nacimiento generalizado o métodos de Poisson-Boltzmann.11
Aplicaciones
Un interacción de enlace entre ligando y una proteína enzimática pueden resultar en la activación o la inhibición de la enzima. Si la proteína es un receptor, el resultado del enlace con el ligando puede resultar en un agonismo o antagonismo. El acoplamiento celular es usado en el campo de diseño de fármacos, la mayoría de los fármacos son pequeñas moléculas orgánicas.
- Identificador de enlace - el acoplamiento junto a las funciones de puntuación puede ser usada para encontrar rápidamente grandes bases de datos con fármacos in silico potenciales, para identificar las moléculas que tienen la mayor probabilidad de enlazar a la proteína de interés (véase ensayo virtual
- Optimización dirigida – el acoplamiento molecular puede ser usado para predecir donde y en que orientación relativa el ligando enlazara con la proteína (también referido como modo de enlace). Esta información puede y usarse para diseñar análogos más potentes y selectivos
- Bioremediación – El acoplamiento proteína-ligando puede ser usado para predecir contaminante que pueden ser degradados por enzimas.
ACOPLAMIENTO MOLECULAR ENTRE LIGANDO Y RECEPTOR
El acoplamiento (docking) molecular es un método computacional que busca formas de unión entre ligandos potenciales (un fármaco) y un blanco macromolecular (normalmente células, proteínas o procesos químicos), cuya estructura es conocida experimentalmente.1,2Particularmente, el acoplamiento molecular se aplica para encontrar la orientación y posición de un ligando en el sitio activo de su blanco macromolecular, sin conocer el resultado final, es decir, la conformación tridimensional de la unión ligando-receptor. Esta última es normalmente estudiada por la cristalografía de rayos X, o analizando los complejos de energía de la resonancia magnética nuclear.
El objetivo de la técnica consiste en encontrar la unión más probable entre el ligando y el receptor, es decir, la que menos energía requiera (a menor energía, más fuerte la unión) así como el sitio idóneo de unión molecular. Es evidente que al conocer esta respuesta, el investigador está en posición de llevarla a la experimentación in vivo y así corroborar sus resultados obtenidos in silico.
Esta forma de trabajo experimental ha resultado de gran valía para entender de qué manera los fármacos que utilizamos diariamente alcanzan su objetivo dentro de nuestro cuerpo, y también facilita el desarrollo de nuevos fármacos con características bien definidas o con objetivos seleccionados previamente.
Un buen ejemplo de lo anterior lo encontramos en una serie de fármacos conocidos genéricamente como antimaláricos (actúan sobre elPlasmodium vivax y ovale, causantes del paludismo), pero que tienen efectos indeseables muy notables sobre el tejido cardiaco.3 El mecanismo por el cual estos fármacos alteran el funcionamiento de las células cardiacas no ha sido bien documentado hasta el momento, y sólo conocemos una pequeña parte de él; estas drogas se unen de manera específica a los canales de sodio (responsables del inicio del latido del corazón) y producen alteraciones del ritmo cardiaco conocidas como arritmias, las cuales pueden variar en intensidad y son responsables de muchas de las muertes ocasionadas por intoxicación con estos fármacos.
En el laboratorio de biofísica cardiaca nos hemos propuesto encontrar cuál es el sitio de unión, o al menos cuál es el sitio más probable, mediante el cual estos fármacos bloquean el paso de iones de sodio al interior de las células cardiacas afectando, posteriormente, la depolarización celular.
MÉTODOS
Para resolver esta pregunta usamos un método experimental in vivo, conocido como transfección heteróloga, esto es, usamos el DNAcomplementario del canal de sodio y lo incluimos en el núcleo de una célula animal (en este caso, ovocitos de Xenopus laevis, una rana), para utilizar el sistema natural de fabricación de cientos de miles de copias de cDNA; una vez fabricada la proteína del canal, ésta viaja hasta la membrana celular para funcionar exactamente igual a como lo hace en las células cardiacas.
RESULTADOS
Para estar seguros de que nuestro método de inclusión de cDNA fue exitoso, marcamos con un gen reportero el cDNA del canal de sodio, de manera que este gen nos indica si el canal ha sido incluido en la membrana celular. En la Figura 1 podemos apreciar un ovocito que está marcado con verde –esfera gris en la imagen– (el gen reportero), lo cual indica que el canal de sodio se encuentra en la membrana celular; junto, observamos el efecto causado por la primaquina sobre la corriente de sodio generada en la célula. Es evidente que el fármaco utilizado disminuye la amplitud de la corriente de sodio en un 50%. Una vez observado el efecto bloqueador de la primaquina, deberemos investigar si este efecto es producido cuando el fármaco se une al canal de sodio de manera directa (ligando-receptor) y dónde lo hace.
FIGURA 1. Un ovocito (media esfera a la izquierda) y la corriente de sodio registrada después de la aplicación de un pulso de voltaje bajo condiciones control y luego de la aplicación de primaquina (PQ).
FIGURA 2. Vista desde arriba de un canal de sodio que muestra un ión de sodio (esfera central) y el fármaco primaquina (estructura con módulos hexagonales sobre el ión).
Para responder esta pregunta usamos la simulación in silico que nos permitirá evaluar la conformación tridimensional del canal de sodio y su interacción con el fármaco utilizado. En la Figura 2 observamos una representación del canal de sodio visto desde arriba, la droga que estamos utilizando y las posibles interacciones proporcionadas por el programa de simulación. En este caso, también incluimos un átomo del ión sodio (la esfera central) que nos indica por dónde ocurre el paso de iones a través del canal. Para apreciar mejor la conformación tridimensional del fármaco con el canal, decidimos cortar los elementos que no interaccionan directamente con la droga, de esta manera, al simplificar el diagrama sólo vemos los elementos esenciales de la unión según se ilustra en la Figura 3.
FIGURA 3. Simplificación del canal de sodio. Estructura del canal de sodio vista lateralmente con la posible unión del fármaco. Nótese que la unión se realiza sólo con dos aminoácidos (bastones grises claros y negros.
Aquí únicamente observamos los aminoácidos que sí se unen al fármaco, los bastones rojos y verdes (negros y grises claros en la imagen), a diferencia de los azules y blancos, indicándonos qué estructura es la responsable de la interacción. Ahora ya tenemos pruebas confiables (en el modelo in silico) de que una serie de aminoácidos interactúan directamente con el fármaco. Sólo nos resta entender cómo en una estructura tridimensional se da esa unión entre el ligando (el fármaco) y su receptor (el canal). En la Figura 4 mostramos cómo sería, dentro del modelo, el arreglo tridimensional; aquí representamos el fármaco con esferas de color azul, celeste (negro y gris en la imagen) y blanco, el canal de sodio con bastones y listones de color verde, magenta, amarillo y naranja (diversos tonos de gris en la imagen) y por último con esferas pequeñas de color rojo, gris y azul (negro, gris y blanco en la imagen), la estructura probable de unión, un sitio conocido como el motivo deka o filtro de selectividad.
FIGURA 4. Vista lateral tridimensional del canal de sodio y el fármaco. El fármaco se muestra con esferas grandes grises y negras y su posible unión a los aminoácidos del canal con esferas pequeñas grises y negras. En el dibujo, la parte superior representa el espacio extracelular, la parte inferior, el espacio intracelular.
El acoplamiento (docking) molecular es un método computacional que busca formas de unión entre ligandos potenciales (un fármaco) y un blanco macromolecular (normalmente células, proteínas o procesos químicos), cuya estructura es conocida experimentalmente.1,2Particularmente, el acoplamiento molecular se aplica para encontrar la orientación y posición de un ligando en el sitio activo de su blanco macromolecular, sin conocer el resultado final, es decir, la conformación tridimensional de la unión ligando-receptor. Esta última es normalmente estudiada por la cristalografía de rayos X, o analizando los complejos de energía de la resonancia magnética nuclear.
El objetivo de la técnica consiste en encontrar la unión más probable entre el ligando y el receptor, es decir, la que menos energía requiera (a menor energía, más fuerte la unión) así como el sitio idóneo de unión molecular. Es evidente que al conocer esta respuesta, el investigador está en posición de llevarla a la experimentación in vivo y así corroborar sus resultados obtenidos in silico.
Esta forma de trabajo experimental ha resultado de gran valía para entender de qué manera los fármacos que utilizamos diariamente alcanzan su objetivo dentro de nuestro cuerpo, y también facilita el desarrollo de nuevos fármacos con características bien definidas o con objetivos seleccionados previamente.
Un buen ejemplo de lo anterior lo encontramos en una serie de fármacos conocidos genéricamente como antimaláricos (actúan sobre elPlasmodium vivax y ovale, causantes del paludismo), pero que tienen efectos indeseables muy notables sobre el tejido cardiaco.3 El mecanismo por el cual estos fármacos alteran el funcionamiento de las células cardiacas no ha sido bien documentado hasta el momento, y sólo conocemos una pequeña parte de él; estas drogas se unen de manera específica a los canales de sodio (responsables del inicio del latido del corazón) y producen alteraciones del ritmo cardiaco conocidas como arritmias, las cuales pueden variar en intensidad y son responsables de muchas de las muertes ocasionadas por intoxicación con estos fármacos.
En el laboratorio de biofísica cardiaca nos hemos propuesto encontrar cuál es el sitio de unión, o al menos cuál es el sitio más probable, mediante el cual estos fármacos bloquean el paso de iones de sodio al interior de las células cardiacas afectando, posteriormente, la depolarización celular.
MÉTODOS
Para resolver esta pregunta usamos un método experimental in vivo, conocido como transfección heteróloga, esto es, usamos el DNAcomplementario del canal de sodio y lo incluimos en el núcleo de una célula animal (en este caso, ovocitos de Xenopus laevis, una rana), para utilizar el sistema natural de fabricación de cientos de miles de copias de cDNA; una vez fabricada la proteína del canal, ésta viaja hasta la membrana celular para funcionar exactamente igual a como lo hace en las células cardiacas.
RESULTADOS
Para estar seguros de que nuestro método de inclusión de cDNA fue exitoso, marcamos con un gen reportero el cDNA del canal de sodio, de manera que este gen nos indica si el canal ha sido incluido en la membrana celular. En la Figura 1 podemos apreciar un ovocito que está marcado con verde –esfera gris en la imagen– (el gen reportero), lo cual indica que el canal de sodio se encuentra en la membrana celular; junto, observamos el efecto causado por la primaquina sobre la corriente de sodio generada en la célula. Es evidente que el fármaco utilizado disminuye la amplitud de la corriente de sodio en un 50%. Una vez observado el efecto bloqueador de la primaquina, deberemos investigar si este efecto es producido cuando el fármaco se une al canal de sodio de manera directa (ligando-receptor) y dónde lo hace.
FIGURA 1. Un ovocito (media esfera a la izquierda) y la corriente de sodio registrada después de la aplicación de un pulso de voltaje bajo condiciones control y luego de la aplicación de primaquina (PQ).
FIGURA 2. Vista desde arriba de un canal de sodio que muestra un ión de sodio (esfera central) y el fármaco primaquina (estructura con módulos hexagonales sobre el ión).
Para responder esta pregunta usamos la simulación in silico que nos permitirá evaluar la conformación tridimensional del canal de sodio y su interacción con el fármaco utilizado. En la Figura 2 observamos una representación del canal de sodio visto desde arriba, la droga que estamos utilizando y las posibles interacciones proporcionadas por el programa de simulación. En este caso, también incluimos un átomo del ión sodio (la esfera central) que nos indica por dónde ocurre el paso de iones a través del canal. Para apreciar mejor la conformación tridimensional del fármaco con el canal, decidimos cortar los elementos que no interaccionan directamente con la droga, de esta manera, al simplificar el diagrama sólo vemos los elementos esenciales de la unión según se ilustra en la Figura 3.
FIGURA 3. Simplificación del canal de sodio. Estructura del canal de sodio vista lateralmente con la posible unión del fármaco. Nótese que la unión se realiza sólo con dos aminoácidos (bastones grises claros y negros.
Aquí únicamente observamos los aminoácidos que sí se unen al fármaco, los bastones rojos y verdes (negros y grises claros en la imagen), a diferencia de los azules y blancos, indicándonos qué estructura es la responsable de la interacción. Ahora ya tenemos pruebas confiables (en el modelo in silico) de que una serie de aminoácidos interactúan directamente con el fármaco. Sólo nos resta entender cómo en una estructura tridimensional se da esa unión entre el ligando (el fármaco) y su receptor (el canal). En la Figura 4 mostramos cómo sería, dentro del modelo, el arreglo tridimensional; aquí representamos el fármaco con esferas de color azul, celeste (negro y gris en la imagen) y blanco, el canal de sodio con bastones y listones de color verde, magenta, amarillo y naranja (diversos tonos de gris en la imagen) y por último con esferas pequeñas de color rojo, gris y azul (negro, gris y blanco en la imagen), la estructura probable de unión, un sitio conocido como el motivo deka o filtro de selectividad.
FIGURA 4. Vista lateral tridimensional del canal de sodio y el fármaco. El fármaco se muestra con esferas grandes grises y negras y su posible unión a los aminoácidos del canal con esferas pequeñas grises y negras. En el dibujo, la parte superior representa el espacio extracelular, la parte inferior, el espacio intracelular.
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