El empalme alternativo , o empalme diferencial , es un proceso regulado durante la expresión génica que resulta en un único gen que codifica proteínasmúltiples . En este proceso, los exones particulares de un gen pueden incluirse dentro o excluirse del ARN mensajero (ARNm) procesado final producido a partir de ese gen. [1] En consecuencia, las proteínas traducidas de los ARNm empalmados alternativamente contendrán diferencias en su secuencia de aminoácidos y, a menudo, en sus funciones biológicas (ver Figura). Cabe destacar que el empalme alternativo permite el genoma humano. para dirigir la síntesis de muchas más proteínas de lo que se esperaría de sus 20,000 genes codificadores de proteínas.
El empalme alternativo ocurre como un fenómeno normal en los eucariotas , donde aumenta considerablemente la biodiversidad de proteínas que pueden ser codificadas por el genoma; [1] en humanos, ~ 95% de los genes multi-exónicos son empalmados alternativamente. [2] Se observan numerosos modos de empalme alternativo, de los cuales el más común es la omisión de exón . En este modo, un exón particular puede incluirse en los ARNm en algunas condiciones o en tejidos particulares, y omitirse del ARNm en otras. [1]
La producción de ARNm empalmados alternativamente está regulada por un sistema de proteínas de acción trans que se unen a los sitios de acción cis en el propio transcrito primario . Tales proteínas incluyen activadores de empalme que promueven el uso de un sitio de empalme particular, y represores de empalme que reducen el uso de un sitio particular. Los mecanismos de empalme alternativo son muy variables, y constantemente se encuentran nuevos ejemplos, particularmente a través del uso de técnicas de alto rendimiento. Los investigadores esperan dilucidar por completo los sistemas regulatorios involucrados en el empalme, de modo que los productos de empalme alternativo de un gen determinado en condiciones particulares ("variantes de empalme") podrían predecirse mediante un "código de empalme". [3] [4]
Las variaciones anormales en el empalme también están implicadas en la enfermedad ; una gran proporción de trastornos genéticos humanos resultan de variantes de empalme. [3] También se cree que las variantes de empalme anormales contribuyen al desarrollo del cáncer, [5] [6] [7] [8] y los genes del factor de empalme a menudo se mutan en diferentes tipos de cáncer.
Descubrimiento [ editar ]
El corte y empalme alternativo se observó por primera vez en 1977. [9] [10] El Adenovirusproduce cinco transcripciones primarias al principio de su ciclo infeccioso, antes de la replicación del ADN viral, y una adicional más tarde, después de que comience la replicación del ADN. Las primeras transcripciones primarias continúan produciéndose después de que comience la replicación del ADN. La transcripción primaria adicional producida posteriormente en la infección es grande y proviene de 5/6 del genoma de adenovirus de 32 kb. Esto es mucho más grande que cualquiera de los adenovirus individualesARNm presentes en células infectadas. Los investigadores encontraron que la transcripción del ARN primario producida por el adenovirus tipo 2 en la fase tardía se empalmó de muchas maneras diferentes, lo que resultó en ARNm que codifican diferentes proteínas virales. Además, la transcripción primaria contenía múltiples sitios de poliadenilación , dando diferentes extremos 3 'para los ARNm procesados. [11] [12] [13]
En 1981, se caracterizó el primer ejemplo de empalme alternativo en una transcripción de un gen endógeno normal . [11] Se encontró que el gen que codifica la hormona tiroidea calcitonina se empalmó alternativamente en células de mamíferos. La transcripción primaria de este gen contiene 6 exones; el ARNm de calcitonina contiene los exones 1-4, y termina después de un sitio de poliadenilación en el exón 4. Otro ARNm se produce a partir de este pre-ARNm al omitir el exón 4, e incluye los exones 1-3, 5 y 6. Codifica una proteína conocida como CGRP ( péptido relacionado con el gen de la calcitonina ). [14] [15]También se observaron ejemplos de corte y empalme alternativo en las transcripciones del gen de inmunoglobulina en mamíferos a principios de los años ochenta. [11] [16]
Desde entonces, se ha encontrado que el empalme alternativo es ubicuo en los eucariotas. [1] El "titular del registro" para el empalme alternativo es un gen de D. melanogaster llamado Dscam , que podría tener 38,016 variantes de empalme. [17]
Modos [ editar ]
- Salto de exón o exón en casete : en este caso, un exónpuede ser empalmado fuera de la transcripciónprimaria o retenido. Este es el modo más común en pre-ARNm de mamíferos . [18]
- Exones mutuamente exclusivos : uno de los dos exones se conserva en los ARNm después del empalme, pero no ambos.
- Sitio donante Alternativa : Una alternativa 5' nudo de empalme (zona donante) se utiliza, el cambio de la 3' límite de la corriente arriba del exón.
- Sitio aceptador alternativo : se utiliza una unión de empalme 3 'alternativa (sitio aceptador), cambiando el límite 5' del exón descendente.
- Retención de intrones: una secuencia puede ser unida como un intrón o simplemente retenida. Esto se distingue de la omisión de exón porque la secuencia retenida no está flanqueada por intrones . Si el intrón retenido está en la región de codificación, el intrón debe codificar los aminoácidos en el marco con los exones vecinos, o un codón de parada o un cambio en el marco de lectura hará que la proteína no sea funcional. Este es el modo más raro en los mamíferos. [18]
Además de estos modos primarios de empalme alternativo, existen otros dos mecanismos principales por los cuales se pueden generar diferentes ARNm a partir del mismo gen; Múltiples promotores y múltiples sitios de poliadenilación . El uso de múltiples promotores se describe adecuadamente como un mecanismo de regulación transcripcional en lugar de un empalme alternativo; Al comenzar la transcripción en diferentes puntos, se pueden generar transcripciones con diferentes 5'-la mayoría de los exones. En el otro extremo, múltiples sitios de poliadenilación proporcionan diferentes puntos finales en 3 'para la transcripción. Ambos de estos mecanismos se encuentran en combinación con un empalme alternativo y proporcionan una variedad adicional en los ARNm derivados de un gen. [1] [3]
Estos modos describen mecanismos básicos de empalme, pero pueden ser inadecuados para describir eventos complejos de empalme. Por ejemplo, la figura de la derecha muestra 3 formas de empalme del gen de la hialuronidasa 3 del ratón . La comparación de la estructura exónica mostrada en la primera línea (verde) con la de la segunda línea (amarilla) muestra la retención de intrones, mientras que la comparación entre la segunda y la tercera forma de empalme (amarillo contra azul) muestra la omisión de exones. Recientemente se ha propuesto una nomenclatura modelo para designar de manera única todos los posibles patrones de empalme. [18]
Mecanismos [ editar ]
Mecanismo de empalme general [ editar ]
Cuando el pre-ARNm ha sido transcrito a partir del ADN , incluye varios intrones y exones . (En los nematodos , la media es de 4 a 5 exones e intrones; en la mosca de la fruta Drosophila puede haber más de 100 intrones y exones en un pre-ARNm transcrito). Los exones que se retendrán en el ARNm se determinan durante el proceso de empalme . La regulación y selección de los sitios de empalme se realizan mediante el activador de empalme de acción trans y las proteínas represoras de empalme, así como elementos que actúan en cis dentro del pre-ARNm mismo, como los potenciadores de empalme exónico y los silenciadores de empalme exónico.
El intrón eucariótico nuclear típico tiene secuencias de consenso que definen regiones importantes. Cada intrón tiene la secuencia GU en su extremo 5 '. Cerca del extremo 3 'hay un sitio de la rama. El nucleótido en el punto de ramificación es siempre una A; El consenso en torno a esta secuencia varía un poco. En humanos, la secuencia de consenso del sitio de la rama es yUnAy. [19] El sitio de la rama es seguido por una serie de pirimidinas , el tracto de polipirimidina, y luego por AG en el extremo 3 '. [3]
El empalme del ARNm se realiza mediante un complejo de ARN y proteínas conocido como spliceosome , que contiene snRNPs designados U1, U2 , U4, U5 y U6 (U3 no participa en el empalme de ARNm). [20] U1 se une al 5 'GU y U2, con la ayuda de los factores de la proteína U2AF , se une al punto de ramificación A dentro del sitio de la rama. El complejo en esta etapa se conoce como el complejo spliceosome A. La formación del complejo A suele ser el paso clave para determinar los extremos del intrón que se va a empalmar y definir los extremos del exón que se retendrá. [3] (La nomenclatura U se deriva de su alto contenido de uridina).
Los complejos U4, U5, U6 se unen y U6 reemplaza la posición U1. U1 y U4 se van. El complejo restante luego realiza dos reacciones de transesterificación . En la primera transesterificación, el extremo 5 'del intrón se escinde del exón aguas arriba y se une al sitio ramificado A por un enlace 2', 5'- fosfodiéster . En la segunda transesterificación, el extremo 3 'del intrón se escinde del exón corriente abajo, y los dos exones se unen mediante un enlace fosfodiéster. El intrón se libera en forma de lariat y se degrada. [1]
Los elementos reguladores y proteínas [ editar ]
El empalme está regulado por las proteínas de acción trans (represores y activadores) y los sitios reguladores de acción cis correspondientes (silenciadores y potenciadores) en el pre-ARNm. Sin embargo, como parte de la complejidad del empalme alternativo, se observa que los efectos de un factor de empalme a menudo dependen de la posición. Es decir, un factor de empalme que sirve como un activador de empalme cuando está vinculado a un elemento intensificador intrónico puede servir como un represor cuando se une a su elemento de empalme en el contexto de un exón, y viceversa. [21] La estructura secundaria de la transcripción del pre-ARNm también desempeña un papel en la regulación del empalme, por ejemplo, al reunir elementos de empalme o enmascarar una secuencia que de otro modo serviría como elemento de unión para un factor de empalme.[22] [23]Juntos, estos elementos forman un "código de empalme" que rige cómo se producirá el empalme en diferentes condiciones celulares. [24] [25]
Hay dos tipos principales de elementos de secuencia de ARN que actúan en cis presentes en los pre-ARNm y tienen las correspondientes proteínas de unión al ARN que actúan en trans . Los silenciadores de empalme son sitios a los que se unen las proteínas represoras de empalme, lo que reduce la probabilidad de que un sitio cercano se utilice como un empalme de empalme. Estos se pueden ubicar en el intrón mismo (silenciadores de empalme intrónicos, ISS) o en un exón vecino ( silenciadores de empalme exónicos , ESS). Varían en secuencia, así como en los tipos de proteínas que se unen a ellos. La mayoría de los represores de corte y empalme son ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas(hnRNPs) como hnRNPA1 y proteína de unión al tracto de polipirimidina (PTB). [3] [24]Los potenciadores de empalme son sitios a los que se unen las proteínas activadoras de empalme, lo que aumenta la probabilidad de que un sitio cercano se utilice como un empalme de empalme. Estos también pueden ocurrir en el intrón (potenciadores de empalme intrónico, ISE) o exón ( potenciadores de empalme exónico , ESE). La mayoría de las proteínas activadoras que se unen a los ISE y los ESE son miembros de la familia de proteínas SR . Dichas proteínas contienen motivos de reconocimiento de ARN y arginina y dominios ricos en serina (RS). [3] [24]
En general, los determinantes del empalme funcionan de manera interdependiente que depende del contexto, de modo que las reglas que gobiernan cómo se regula el empalme desde un código de empalme. [25] La presencia de un elemento particular de secuencia de ARN que actúa en cispuede aumentar la probabilidad de que un sitio cercano se corte en algunos casos, pero disminuir la probabilidad en otros casos, según el contexto. El contexto dentro del cual actúan los elementos reguladores incluye el contexto de actuación en cis que se establece por la presencia de otras características de la secuencia de ARN y el contexto de actuación en trans que se establece por las condiciones celulares. Por ejemplo, algunos actúan en cis.Los elementos de la secuencia de ARN influyen en el empalme solo si hay múltiples elementos presentes en la misma región para establecer el contexto. Como otro ejemplo, un elemento que actúa en cis puede tener efectos opuestos en el empalme, dependiendo de qué proteínas se expresan en la célula (p. Ej., PTB neuronal frente a no neuronal). La importancia adaptativa de los silenciadores y potenciadores de empalme queda demostrada por estudios que muestran que existe una fuerte selección en genes humanos contra mutaciones que producen nuevos silenciadores o alteran los potenciadores existentes. [26] [27]
Ejemplos [ editar ]
Salto de exón: Drosophila dsx [ editar ]
Los pre-mRNAs del gen dsx de D. melanogastercontienen 6 exones. En los machos, los exones 1,2,3,5 y 6 se unen para formar el ARNm, que codifica una proteína reguladora de la transcripción requerida para el desarrollo masculino. En las hembras, los exones 1,2,3 y 4 están unidos, y una señal de poliadenilación en el exón 4 causa la escisión del ARNm en ese punto. El ARNm resultante es una proteína reguladora de la transcripción requerida para el desarrollo femenino. [28]
Este es un ejemplo de omisión de exón. El intrón corriente arriba del exón 4 tiene un tracto de polipirimidina que no coincide bien con la secuencia de consenso , por lo que las proteínas U2AF se unen pobremente al mismo sin la ayuda de los activadores de empalme. Por lo tanto, este sitio del aceptador de empalme 3 'no se usa en los machos. Las hembras, sin embargo, producen el activador de empalme Transformador (Tra) (ver más abajo). La proteína SR Tra2 se produce en ambos sexos y se une a una ESE en el exón 4; si Tra está presente, se une a Tra2 y, junto con otra proteína SR, forma un complejo que ayuda a las proteínas U2AF a unirse al tracto de polipirimidina débil. U2 se recluta hasta el punto de ramificación asociado, y esto conduce a la inclusión del exón 4 en el ARNm. [28] [29]
Sitios aceptores alternativos: Drosophila Transformer [ editar ]
Los pre-mRNAs del gen Transformer (Tra) de Drosophila melanogaster se someten a un empalme alternativo a través del modo de sitio aceptor alternativo. El gen Tra codifica una proteína que se expresa solo en las hembras. La transcripción primaria de este gen contiene un intrón con dos posibles sitios aceptores. En los machos, se utiliza el sitio aceptor aguas arriba. Esto hace que se incluya una versión más larga del exón 2 en la transcripción procesada, incluido un codón de parada temprana . El ARNm resultante codifica un producto proteico truncado que está inactivo. Las hembras producen la proteína maestra de determinación sexual Sexo letal (Sxl). La proteína Sxl es un represor de empalme que se une a una ISS en el ARN de la transcripción de Tra cerca del sitio aceptor corriente arriba, lo que evitaLa proteína U2AF se une al tracto de polipirimidina. Esto evita el uso de esta unión, desplazando el enlace del empalme al sitio aceptor posterior. El empalme en este punto pasa por alto el codón de parada, que se elimina como parte del intrón. El ARNm resultante codifica una proteína Tra activa, que a su vez es un regulador del empalme alternativo de otros genes relacionados con el sexo (ver dsx más arriba). [1]
Exon definición: receptor Fas [ editar ]
Se producen múltiples isoformas de la proteína del receptor Fas mediante empalme alternativo. Dos isoformas que ocurren normalmente en los humanos son producidas por un mecanismo de omisión de exón. Un ARNm que incluye el exón 6 codifica la forma unida al receptor Fas, que promueve la apoptosis o la muerte celular programada. El aumento de la expresión del receptor de Fas en células de la piel expuestas crónicamente al sol y la ausencia de expresión en las células cancerosas de la piel, sugiere que este mecanismo puede ser importante para la eliminación de células precancerosas en los seres humanos. [30] Si se omite el exón 6, el ARNm resultante codifica una proteína Fas soluble que no promueve la apoptosis. La inclusión o omisión del exón depende de dos proteínas antagónicas, TIA-1 y la proteína de unión al tracto de polipirimidina (PTB).
- El sitio donante 5 'en el intrón en sentido descendente desde el exón 6 en el pre-ARNm tiene una concordancia débil con la secuencia de consenso, y no está unido generalmente por el snRNP U1. Si U1 no se une, se omite el exón (consulte "a" en la figura adjunta).
- La unión de la proteína TIA-1 a un sitio potenciador de empalme intrónico estabiliza la unión de la snRNP U1. [3] El complejo de sitio donante 5 'resultante ayuda a la unión del factor de empalme U2AF al sitio de empalme 3' corriente arriba del exón, a través de un mecanismo que aún no se conoce (ver b). [31]
- El exón 6 contiene un silenciador de empalme exónico rico en pirimidina, ure6 , donde el PTB puede unirse. Si el PTB se une, inhibe el efecto del complejo 5 'donante en la unión de U2AF al sitio aceptor, lo que da como resultado la omisión del exón (ver c).
Este mecanismo es un ejemplo de definición de exón en empalme. Un spliceosome se ensambla en un intrón, y las subunidades snRNP pliegan el ARN para que los extremos 5 'y 3' del intrón se unan. Sin embargo, ejemplos recientemente estudiados como este muestran que también hay interacciones entre los extremos del exón. En este caso particular, estas interacciones de definición de exón son necesarias para permitir la unión de factores de empalme del núcleo antes del ensamblaje de los spliceosomes en los dos intrones flanqueantes. [31]
Competencia represor-activador: VIH-1 tat exon 2 [ editar ]
El VIH , el retrovirus que causa el SIDA en los seres humanos, produce un único transcrito de ARN primario, que se empalma alternativamente de múltiples maneras para producir más de 40 ARNm diferentes. [32] El equilibrio entre las transcripciones empalmadas diferencialmente proporciona múltiples ARNm que codifican diferentes productos que se requieren para la multiplicación viral. [33] Una de las transcripciones empalmadas diferencialmente contiene el tatgen, en el que el exón 2 es un exón en casete que se puede omitir o incluir. La inclusión de tat exon 2 en el ARN está regulada por la competencia entre el represor de empalme hnRNP A1 y la proteína SR SC35. Dentro del exón 2, una secuencia de silenciamiento de empalme exónico (ESS) y una secuencia de potenciador de empalme exónico (ESE) se superponen. Si la proteína represora A1 se une al ESS, inicia la unión cooperativa de múltiples moléculas A1, extendiéndose al sitio donante 5 'corriente arriba del exón 2 y previniendo la unión del factor de empalme del núcleo U2AF35 al tracto de polipirimidina. Si SC35 se une al ESE, evita el enlace A1 y mantiene el sitio donante en 5 'en un estado accesible para el ensamblaje del spliceosome. La competencia entre el activador y el represor garantiza que se produzcan ambos tipos de ARNm (con y sin el exón 2). [32]
Significado adaptativo [ editar ]
El empalme alternativo es una de las varias excepciones a la idea original de que una secuencia de ADN codifica un polipéptido (la hipótesis de la enzima del gen Uno ). Ahora podría ser más correcto decir "Un gen: muchos polipéptidos". [34] Se necesita información externa para decidir qué polipéptido se produce, dada una secuencia de ADN y pre-ARNm. Dado que los métodos de regulación son heredados, esto proporciona formas novedosas para que las mutaciones afecten la expresión génica. [7]
Se ha propuesto que para los eucariotas el empalme alternativo era un paso muy importante hacia una mayor eficiencia, ya que la información se puede almacenar mucho más económicamente. Varias proteínas pueden codificarse por un solo gen, en lugar de requerir un gen separado para cada una, y así permitir un proteoma más variado de un genoma de tamaño limitado. [1] También proporciona flexibilidad evolutiva. Una única mutación puntual puede ocasionar que un exón dado sea ocasionalmente excluido o incluido de una transcripción durante el empalme, lo que permite la producción de una nueva isoforma de proteína sin pérdida de la proteína original. [1] Los estudios han identificado regiones con trastornos intrínsecos (verProteínas intrínsecamente no estructuradas ) como enriquecidas en los exones no constitutivos [35], lo que sugiere que las isoformas de proteínas pueden mostrar diversidad funcional debido a la alteración de los módulos funcionales dentro de estas regiones. Dicha diversidad funcional lograda por las isoformas se refleja en sus patrones de expresión y puede predecirse mediante enfoques de aprendizaje automático. [36] [37] Los estudios comparativos indican que el empalme alternativo precedió a la multicelularidad en la evolución, y sugieren que este mecanismo podría haber sido cooptado para ayudar en el desarrollo de organismos multicelulares. [38]
La investigación basada en el Proyecto del Genoma Humano y otras secuencias del genoma ha demostrado que los humanos tienen solo un 30% más de genes que el gusano redondo Caenorhabditis elegans , y solo aproximadamente el doble que la mosca Drosophila melanogaster . Este hallazgo llevó a la especulación de que la mayor complejidad percibida de los humanos, o de los vertebrados en general, podría deberse a tasas más altas de corte y empalme alternativo en humanos que las encontradas en invertebrados. [39] [40] Sin embargo, un estudio sobre muestras de 100,000 ESTs de humanos, ratones, ratas, vacas, moscas ( D. melanogaster ), gusanos ( C. elegans ) y la planta Arabidopsis thalianaNo se encontraron grandes diferencias en la frecuencia de genes empalmados alternativamente entre los humanos y ninguno de los otros animales analizados. [41] Sin embargo, otro estudio propuso que estos resultados eran un artefacto de los diferentes números de EST disponibles para los diversos organismos. Cuando compararon las frecuencias de empalme alternativas en subconjuntos aleatorios de genes de cada organismo, los autores concluyeron que los vertebrados tienen tasas más altas de empalme alternativo que los invertebrados. [42]
Enfermedad [ editar ]
Los cambios en la maquinaria de procesamiento de ARN pueden llevar a un empalme incorrecto de las transcripciones múltiples, mientras que las alteraciones de un solo nucleótido en sitios de empalme o sitios reguladores de empalme que actúan en cis pueden conducir a diferencias en el empalme de un solo gen, y por lo tanto en el ARNm producido a partir de Transcripciones del gen mutante. Un estudio en 2005 que involucró análisis probabilísticos indicó que más del 60% de las mutaciones causantes de enfermedades humanas afectan el empalme en lugar de afectar directamente a las secuencias de codificación. [43] Un estudio más reciente indica que es probable que un tercio de todas las enfermedades hereditarias tengan un componente de empalme. [21] Independientemente del porcentaje exacto, existen varias enfermedades relacionadas con el empalme. [44] Como se describe a continuación, un ejemplo destacado de enfermedades relacionadas con el empalme es el cáncer.
Los ARNm anormalmente empalmados también se encuentran en una alta proporción de células cancerosas. [5] [6] [8] Los análisis combinados de RNA-Seq y proteómica han revelado una sorprendente expresión diferencial de las isoformas de empalme de proteínas clave en vías importantes para el cáncer. [45] No siempre está claro si tales patrones aberrantes de empalme contribuyen al crecimiento canceroso, o son simplemente consecuencia de anormalidades celulares asociadas con el cáncer. Para ciertos tipos de cáncer, como en el colorrectal y la próstata, se ha demostrado que la cantidad de errores de empalme por cáncer varía mucho entre los cánceres individuales, un fenómeno denominado inestabilidad del transcriptoma . [46] [47]Se ha demostrado además que la inestabilidad del transcriptoma se correlaciona con el nivel de expresión reducido de los genes del factor de empalme. Se ha demostrado que la mutación de DNMT3A contribuye a las neoplasias malignas hematológicas , y que las líneas celulares mutadas con DNMT3A exhiben inestabilidad de transcriptoma en comparación con sus homólogas isogénicas de tipo salvaje. [48]
De hecho, hay una reducción del empalme alternativo en las células cancerosas en comparación con las normales, y los tipos de empalme difieren; por ejemplo, las células cancerosas muestran niveles más altos de retención de intrones que las células normales, pero niveles más bajos de omisión de exón. [49] Algunas de las diferencias en el corte y empalme en las células cancerosas pueden deberse a la alta frecuencia de mutaciones somáticas en los genes del factor de empalme, [8] y algunas pueden ser el resultado de cambios en la fosforilación de los factores de empalme de acción trans. [7] Otros pueden producirse por cambios en las cantidades relativas de factores de empalme producidos; por ejemplo, se ha demostrado que las células de cáncer de mama tienen niveles elevados de factor de empalme SF2 / ASF . [50]Un estudio encontró que un porcentaje relativamente pequeño (383 de más de 26000) de variantes de empalme alternativas fue significativamente mayor en las células tumorales que en las células normales, lo que sugiere que existe un conjunto limitado de genes que, cuando están mal empalmados, contribuyen al tumor desarrollo. [51] Sin embargo, se cree que los efectos nocivos de las transcripciones mal empalmadas generalmente se salvaguardan y eliminan mediante un mecanismo de control de calidad postranscripcional celular denominado desintegración del ARNm sin sentido [NMD]. [52]
Un ejemplo de una variante de empalme específica asociada con los cánceres se encuentra en uno de los genes humanos DNMT . Tres genes DNMT codifican enzimas que agregan grupos metilo al ADN, una modificación que a menudo tiene efectos reguladores. Varios mRNAs de DNMT3B anormalmente empalmados se encuentran en tumores y líneas celulares de cáncer. En dos estudios separados, la expresión de dos de estos ARNm empalmados anormalmente en células de mamíferos causó cambios en los patrones de metilación del ADN en esas células. Las células con uno de los ARNm anormales también crecieron dos veces más rápido que las células de control, lo que indica una contribución directa al desarrollo del tumor por este producto. [7]
Otro ejemplo es el Ron ( MST1R ) proto-oncogén . Una propiedad importante de las células cancerosas es su capacidad para mover e invadir el tejido normal. Se ha encontrado que la producción de una transcripción anómalamente empalmada de Ron está asociada con un aumento de los niveles de SF2 / ASF en células de cáncer de mama. La isoforma anormal de la proteína Ron codificada por este ARNm conduce a la motilidad celular . [50]
La sobreexpresión de una variante de empalme truncada del gen FOSB , ΔFosB , en una población específica de neuronas en el núcleo accumbens, se ha identificado como el mecanismo causal involucrado en la inducción y el mantenimiento de una adicción a los medicamentos y recompensas naturales . [53] [54] [55] [56]
Recientes estudios provocativos apuntan a una función clave de la estructura de la cromatina y las modificaciones de histonas en la regulación de empalme alternativo. Estas ideas sugieren que la regulación epigenética determina no solo qué partes del genoma se expresan sino también cómo se empalman. [57]
Análisis de todo el genoma [ editar ]
El análisis de todo el genoma del empalme alternativo es una tarea desafiante. Normalmente, se han encontrado transcripciones empalmadas alternativamente comparando las secuencias EST , pero esto requiere la secuenciación de un gran número de EST. La mayoría de las bibliotecas EST provienen de un número muy limitado de tejidos, por lo que las variantes de corte y empalme específicas del tejido probablemente se pasen por alto en cualquier caso. Sin embargo, se han desarrollado enfoques de alto rendimiento para investigar el empalme, tales como: análisis basados en micromatrices de ADN , ensayos de unión de ARN y secuenciación profunda . Estos métodos se pueden usar para detectar polimorfismos o mutaciones en o alrededor de elementos de empalme que afectan la unión de proteínas. Cuando se combina con ensayos de empalme, incluido el gen informador in vivo A continuación, se pueden analizar los efectos funcionales de los polimorfismos o mutaciones en el empalme de los transcritos de pre-ARNm. [21] [24] [58]
En el análisis de micromatrices, se han utilizado matrices de fragmentos de ADN que representan exones individuales ( p . Ej., Micromatriz de exón Affymetrix ) o límites de exón / exón ( p . Ej., Matrices de ExonHit o Jivan ). Luego se sondea la matriz con ADNc marcado de tejidos de interés. Los ADNc de la sonda se unen al ADN de los exones que se incluyen en los ARNm en su tejido de origen, o al ADN del límite donde se han unido dos exones. Esto puede revelar la presencia de mRNA particulares empalmados alternativamente. [59]
CLIP ( entrecruzamiento e inmunoprecipitación ) utiliza la radiación UV para unir las proteínas a las moléculas de ARN en un tejido durante el empalme. Una proteína reguladora de interés de empalme de acción trans se precipita luego utilizando anticuerpos específicos. Cuando el ARN unido a esa proteína se aísla y clona, revela las secuencias diana para esa proteína. [4] Otro método para identificar proteínas de unión a ARN y mapear su unión a transcripciones pre-ARNm es la "Evaluación de micromatrices de aptómeros genómicos por cambio (MEGAshift)". Net [60] Este método implica una adaptación de la "Evolución sistemática de ligandos". por Enriquecimiento Exponencial (SELEX) "método [61]Junto con una lectura basada en microarrays. El uso del método MEGAshift ha proporcionado información sobre la regulación del empalme alternativo al permitir la identificación de secuencias en los transcritos de pre-ARNm que rodean a los exones empalmados alternativamente que median la unión a diferentes factores de empalme, como ASF / SF2 y PTB. [62] Este enfoque también se ha utilizado para ayudar a determinar la relación entre la estructura secundaria del ARN y la unión de factores de empalme. [23]
Las tecnologías de secuenciación profunda se han utilizado para realizar análisis de ARNm en todo el genoma, sin procesar y procesados, lo que proporciona información sobre el empalme alternativo. Por ejemplo, los resultados del uso de la secuenciación profunda indican que, en humanos, aproximadamente el 95% de las transcripciones de los genes multiexon se someten a un empalme alternativo, con un número de transcripciones pre-ARNm empalmadas de una manera específica de tejido. [2] La genómica funcional y los enfoques computacionales basados en el aprendizaje de múltiples instancias también se han desarrollado para integrar datos RNA-seq para predecir funciones para isoformas empalmadas alternativamente. [37] La secuenciación profunda también ha ayudado en la detección in vivo de las larvas transitoriasque se liberan durante el empalme, la determinación de secuencias de sitios de ramificación y el mapeo a gran escala de los puntos de ramificación en los transcritos de pre-ARNm humanos. [63]
El uso de ensayos de reporteros hace posible encontrar las proteínas de empalme involucradas en un evento de empalme alternativo específico mediante la construcción de genes reporteros que expresarán una de dos proteínas fluorescentes diferentes dependiendo de la reacción de empalme que ocurra. Este método se ha utilizado para aislar mutantes que afectan el empalme y, por lo tanto, para identificar nuevas proteínas reguladoras de empalme inactivadas en esos mutantes.
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