La hibridación genómica comparativa es un método citogenético molecular para analizar las variaciones en el número de copias (CNV) en relación con el nivel de ploidía en el ADN de una muestra de prueba en comparación con una muestra de referencia, sin la necesidad de cultivar células. El objetivo de esta técnica es comparar de manera rápida y eficiente dos muestras de ADN genómico que surgen de dos fuentes, las cuales están más relacionadas, porque se sospecha que contienen diferencias en términos de ganancias o pérdidas de cromosomas completos o regiones subcromosómicas.(una porción de un cromosoma entero). Esta técnica se desarrolló originalmente para evaluar las diferencias entre los complementos cromosómicos del tumor sólido y el tejido normal, [1] y tiene una resolución mejorada de 5 a 10 megabases en comparación con las técnicas de análisis citogenético más tradicionales de bandas de giemsa y fluorescencia in situ. Hibridación (FISH) que está limitada por la resolución del microscopio utilizado. [2] [3]
Esto se logra mediante el uso de fluorescencia competitiva de hibridación in situ. En resumen, esto implica el aislamiento del ADN de las dos fuentes que se compararán, más comúnmente una fuente de prueba y de referencia, un marcado independiente de cada muestra de ADN con fluoróforos (moléculas fluorescentes) de diferentes colores (generalmente rojo y verde), desnaturalización de la muestra. ADN para que sea de una sola hebra, y la hibridación de las dos muestras resultantes en una relación 1: 1 a una metafase normal de cromosomas, a la que las muestras de ADN marcadas se unirán en su lugarde origen. Usando un microscopio de fluorescencia y un software de computadora, las señales fluorescentes de colores diferenciales se comparan a lo largo de cada cromosoma para identificar las diferencias cromosómicas entre las dos fuentes. Una mayor intensidad del color de la muestra de prueba en una región específica de un cromosoma indica la ganancia de material de esa región en la muestra fuente correspondiente, mientras que una mayor intensidad del color de la muestra de referencia indica la pérdida de material en la muestra de prueba en ese nivel específico región. Un color neutro (amarillo cuando las etiquetas de fluoróforo son rojas y verdes) indica que no hay diferencia entre las dos muestras en esa ubicación. [2] [3]
CGH solo es capaz de detectar anomalías cromosómicas desequilibradas . Esto se debe a que las anomalías cromosómicas equilibradas, como las translocaciones recíprocas , las inversiones o los cromosomas en anillo , no afectan el número de copias, que es lo que detectan las tecnologías CGH. Sin embargo, CGH permite la exploración de los 46 cromosomas humanos en una sola prueba y el descubrimiento de deleciones y duplicaciones, incluso en la escala microscópica, lo que puede llevar a la identificación de genes candidatos para ser explorados por otras técnicas citológicas. [2]
Mediante el uso de microarrays de ADN junto con las técnicas CGH, se ha desarrollado la forma más específica de la matriz CGH (aCGH), que permite una medición locus por locus de la CNV con una resolución incrementada de tan solo 100 kilobases . [4] [5] Esta técnica mejorada permite descubrir la etiología de afecciones conocidas y desconocidas.
Historia [ editar ]
La motivación subyacente al desarrollo de la CGH se debió al hecho de que las formas disponibles de análisis citogenético en ese momento ( giemsa banding y FISH ) estaban limitadas en su resolución potencial por los microscopios necesarios para la interpretación de los resultados que proporcionaron. Además, la interpretación de la banda giemsa tiene el potencial de ser ambigua y, por lo tanto, tiene una confiabilidad reducida, y ambas técnicas requieren una alta mano de obra, lo que limita los loci que se pueden examinar. [4]
El primer informe de análisis de CGH fue realizado por Kallioniemi y sus colegas en 1992 en la Universidad de California en San Francisco, quienes utilizaron CGH en el análisis de tumores sólidos. Lograron esto mediante la aplicación directa de la técnica tanto a líneas celulares de cáncer de mama como a tumores primarios de vejigapara establecer cariotipos de número de copia completos para las células. Pudieron identificar 16 regiones diferentes de amplificación, muchas de las cuales fueron descubrimientos novedosos. [1]
Poco después, en 1993, du Manoir et al. Informó prácticamente la misma metodología. Los autores pintaron una serie de cromosomas humanos individuales de una biblioteca de ADN con dos fluoróforos diferentes en diferentes proporciones para probar la técnica, y también aplicaron CGH al ADN genómico de pacientes afectados con síndrome de Down o leucemia prolinfocítica de células T , así como células de Una línea celular de carcinoma papilar renal. Se concluyó que las relaciones de fluorescencia obtenidas eran precisas y que las diferencias entre el ADN genómico de diferentes tipos de células eran detectables y, por lo tanto, que la CGH era una herramienta de análisis citogenético de gran utilidad. [6]
Inicialmente, el uso generalizado de la tecnología CGH era difícil, ya que los protocolos no eran uniformes y, por lo tanto, surgían inconsistencias, especialmente debido a las incertidumbres en la interpretación de los datos. [3]Sin embargo, en 1994 se publicó una revisión que describía en detalle un protocolo fácilmente comprensible [7] y el software de análisis de imágenes se puso a disposición comercialmente, lo que permitió que CGH se utilizara en todo el mundo. [3] Como nuevas técnicas como la microdisección y la reacción en cadena de la polimerasacebada con oligonucleótidos degenerados. (DOP-PCR) se hizo disponible para la generación de productos de ADN, fue posible aplicar el concepto de CGH a anomalías cromosómicas más pequeñas y, por lo tanto, se mejoró la resolución de CGH. [3]
La implementación de la matriz CGH, mediante la cual se utilizan micromatrices de ADN en lugar de la tradicional preparación de cromosomas en metafase, fue iniciada por Solinas-Tolodo et al. en 1997 utilizando células tumorales [8] y Pinkel et al. En 1998 por el uso de células de cáncer de mama. [9] Esto fue posible gracias al Proyecto del Genoma Humano, que generó una biblioteca de fragmentos de ADN clonados con ubicaciones conocidas en todo el genoma humano , y estos fragmentos se utilizaron como sondas en la micromatriz de ADN. [10] Ahora sondas de varios orígenes, como el ADNc, los productos genómicos de PCR y los cromosomas bacterianos artificiales.(BAC) se puede usar en micromatrices de ADN que pueden contener hasta 2 millones de sondas. [10] La matriz CGH está automatizada, permite una mayor resolución (hasta 100 kb) que la CGH tradicional, ya que las sondas son mucho más pequeñas que las preparaciones en metafase, requieren cantidades más pequeñas de ADN, pueden dirigirse a regiones cromosómicas específicas si es necesario y están ordenadas y, por lo tanto, Más rápido de analizar, lo que lo hace mucho más adaptable a los usos de diagnóstico. [10] [11]
Métodos básicos [ editar ]
De preparación de portaobjetos Metafase [ editar ]
El ADN en la diapositiva es una muestra de referencia y, por lo tanto, se obtiene de un hombre o mujer cariotípicamente normal, aunque es preferible usar ADN femenino, ya que poseen dos cromosomas X que contienen mucha más información genética que el cromosoma Y masculino. Se utilizan linfocitos de sangre periférica estimulados con fitohemaglutinina. 1 ml de sangre heparinizada se añade a 10 ml de medio de cultivo y se incubó durante 72 horas a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2 . Se agrega la colchicina para detener las células en la mitosis, luego se recolectan las células y se tratan con cloruro de potasiohipotónico y se fijan en metanol / ácido acético 3: 1 . [3]
Una gota de la suspensión celular se debe dejar caer en un portaobjetos limpiado con etanol desde una distancia de unos 30 cm, óptimamente, esto debería llevarse a cabo a temperatura ambiente con niveles de humedad del 60–70%. Las diapositivas se deben evaluar mediante visualización con un microscopio de contraste de fases, se debe observar un mínimo de citoplasma y los cromosomas no se deben superponer y deben tener una longitud de 400–550 bandas sin cromátidas separadas y, finalmente, deben aparecer oscuros en lugar de brillantes. Luego, los portaobjetos deben secarse al aire durante la noche a temperatura ambiente, y cualquier almacenamiento adicional debe hacerse en grupos de cuatro a −20 ° C con perlas de sílice o nitrógenoPresente para mantener la sequedad. Se deben probar diferentes donantes ya que la hibridación puede ser variable. Se pueden usar los portaobjetos disponibles comercialmente, pero siempre se deben probar primero. [3]
Aislamiento de ADN a partir de tejido de prueba y tejido de referencia [ editar ]
La extracción con fenol estándar se utiliza para obtener ADN de tejido de prueba o de referencia (individualmente cariotípicamente normal), que implica la combinación de ácido tris - etilendiaminotetraacético y fenol con ADN acuoso en cantidades iguales. A esto le sigue la separación por agitación y centrifugación, después de lo cual la capa acuosa se elimina y se trata con éter y finalmente se usa precipitación con etanol para concentrar el ADN. [3]
Puede completarse utilizando kits de aislamiento de ADN disponibles comercialmente que se basan en columnas de afinidad . [3]
Preferentemente, el ADN debe extraerse de tejido fresco o congelado, ya que será de la más alta calidad, aunque ahora es posible utilizar material de archivo que se fija con formalina o cera de parafina incrustada, siempre que se sigan los procedimientos apropiados. 0.5-1 µg de ADN es suficiente para el experimento CGH, aunque si no se obtiene la cantidad deseada, se puede aplicar DOP-PCR para amplificar el ADN, sin embargo, en este caso es importante aplicar DOP-PCR tanto en la prueba como en la prueba. Muestras de ADN de referencia para mejorar la fiabilidad. [3]
Marcaje de ADN [ editar ]
La traducción de Nick se usa para etiquetar el ADN e implica cortar el ADN y sustituir los nucleótidos marcados con fluoróforos (marcaje directo) o biotina u oxigenina para agregar más adelante anticuerpos conjugados con fluóforos (marcaje indirecto). Entonces es importante verificar las longitudes de los fragmentos del ADN de prueba y de referencia mediante electroforesis en gel , ya que deben estar dentro del rango de 500 kb-1.500 kb para una hibridación óptima. [3]
Bloqueo [ editar ]
Se agrega el ADN Cot-1 de Life Technologies Corporation sin etiquetar (ADN placentario enriquecido con secuencias repetitivas de longitud 50bp-100bp) para bloquear secuencias de ADN repetitivas normales, particularmente en los centrómeros y los telómeros , ya que estas secuencias, si se detectan, pueden reducir la relación de fluorescencia y causar ganancias o pérdidas para escapar de la detección. [3]
Hibridación [ editar ]
Se mezclan 8–12 µl de cada prueba marcada y ADN de referencia marcado y se agregan 40 µg de Cot-1 DNA®, luego se precipitan y posteriormente se disuelven en 6 µl de mezcla de hibridación, que contiene 50% de formamida para disminuir la temperatura de fusión del ADN y 10% de dextrano Sulfato para aumentar la concentración efectiva de la sonda en una solución salina de citrato de sodio (SSC) a un pH de 7.0. [3]
La desnaturalización del portaobjetos y sondas se realiza por separado. El portaobjetos se sumerge en formamida al 70% / 2xSSC durante 5 a 10 minutos a 72 ° C, mientras que las sondas se desnaturalizan por inmersión en un baño de agua a 80 ° C durante 10 minutos y se agregan inmediatamente a la preparación del portaobjetos en metafase. Esta reacción se cubre con un cubreobjetos y se deja durante dos a cuatro días en una cámara húmeda a 40 ° C. [3]
Luego se retira el cubreobjetos y se aplican lavados de 5 minutos, tres con 2xSSC a temperatura ambiente, uno a 45 ° C con 0.1xSSC y uno con TNT a temperatura ambiente. La reacción se preincuba luego durante 10 minutos y luego se realiza una incubación de 60 minutos a 37 ° C, tres lavados más de 5 minutos con TNT y luego uno con 2xSSC a temperatura ambiente. Luego, el portaobjetos se seca utilizando una serie de etanol de 70% / 96% / 100% antes de contrarrestar con DAPI (0,35 μg / ml), para la identificación del cromosoma y sellar con un cubreobjetos. [3]
La visualización de imágenes de fluorescencia y [ editar ]
Se requiere un microscopio de fluorescencia con los filtros apropiados para la tinción DAPI y los dos fluoróforos utilizados para la visualización, y estos filtros también deben minimizar la diafonía entre los fluoróforos, como los filtros de paso de banda estrecha. El microscopio debe proporcionar una iluminación uniforme sin variación cromática , estar alineado adecuadamente y tener un tipo de objetivo "plan" que sea apocromático y dar una ampliación de x63 o x100. [3]
La imagen debe grabarse con una cámara con resolución espacial de al menos 0,1 µm a nivel de muestra y obtener una imagen de al menos 600x600 píxeles. La cámara también debe poder integrar la imagen durante al menos 5 a 10 segundos, con una resolución fotométrica mínima de 8 bits. [3]
El software CGH dedicado está disponible comercialmente para la etapa de procesamiento de imágenes, y se requiere para restar el ruido de fondo, eliminar y segmentar los materiales que no son de origen cromosómico, normalizar la relación de fluorescencia, realizar cariotipos interactivos y escalar los cromosomas a la longitud estándar. Se genera un "cariotipo de número de copia relativo" que presenta áreas cromosómicas de deleciones o amplificaciones promediando las proporciones de varias metafases de alta calidad y representándolas a lo largo de un ideograma, un diagrama que identifica cromosomas basados en patrones de bandas. La interpretación de los perfiles de relación se realiza utilizando umbrales fijos o estadísticos ( intervalos de confianza).). Cuando se usan intervalos de confianza, las ganancias o pérdidas se identifican cuando el 95% de la relación de fluorescencia no contiene 1.0. [3]
Notas extra [ editar ]
Se debe tener mucho cuidado para evitar la contaminación de cualquier paso que involucre ADN, especialmente con el ADN de prueba, ya que la contaminación de la muestra con ADN normal sesgará los resultados más cerca de 1.0, por lo que las anomalías pueden pasar desapercibidas. Se pueden emplear experimentos de FISH, PCRy citometría de flujo para confirmar los resultados. [4] [12]
Matriz de hibridación genómica comparativa [ editar ]
La hibridación genómica comparativa de matriz (también hibridación genómica comparativa basada en micromatriz, matriz CGH, matriz CGH, aCGH) es una técnica citogenética molecular para la detección de cambios en el número de copias cromosómicas en una escala de genoma amplio y de alta resolución. [13] Lamatriz CGH compara el genoma del paciente con un genoma de referencia e identifica las diferencias entre los dos genomas y, por lo tanto, ubica regiones de desequilibrios genómicos en el paciente, utilizando los mismos principios de hibridación in situ con fluorescencia competitiva que la CGH tradicional.
Con la introducción de la matriz CGH, se supera la principal limitación de la CGH convencional, una baja resolución. En la matriz CGH, los cromosomas en metafase se reemplazan por fragmentos de ADN clonados (+ 100–200 kb) de los cuales se conoce la ubicación cromosómica exacta. Esto permite la detección de aberraciones con más detalle y, además, permite mapear los cambios directamente en la secuencia genómica. [14]
Array CGH ha demostrado ser una técnica específica, sensible, rápida y de alto rendimiento, con ventajas considerables en comparación con otros métodos utilizados para el análisis de cambios en el número de copias de ADN, lo que lo hace más accesible a las aplicaciones de diagnóstico. Usando este método, se pueden detectar cambios en el número de copias a un nivel de 5 a 10 kilobases de secuencias de ADN. [15] A partir de 2006 , incluso las matrices CGH ( HR-CGH ) de alta resolución son precisas para detectar variaciones estructurales (SV) a una resolución de 200 pb. [16] Este método permite identificar nuevos cambios cromosómicos recurrentes, como microdeleciones y duplicaciones en condiciones humanas, comoCáncer y defectos congénitos por aberraciones cromosómicas.
Metodología [ editar ]
Array CGH se basa en el mismo principio que el CGH convencional. En ambas técnicas, el ADN de una muestra de referencia (o control) y el ADN de una muestra de prueba (o paciente) se marcan diferencialmente con dos fluoróforos diferentes y se usan como sondas que se hibridan de forma competitiva en dianas de ácido nucleico . En CGH convencional, el objetivo es una metafase de referencia extendida. En la matriz CGH, estas dianas pueden ser fragmentos genómicos clonados en una variedad de vectores (como BAC o plásmidos ), ADNc u oligonucleótidos . [17]
La Figura 2. [14] es una vista general esquemática de la técnica CGH de matriz. El ADN de la muestra a analizar se marca con un fluoróforo rojo ( Cyanine 5) y una muestra de ADN de referencia se marca con un fluoróforo verde (Cyanine 3). Cantidades iguales de las dos muestras de ADN se mezclan y se hibridan en una micromatriz de ADN de varios miles de fragmentos u oligonucleótidos de ADN clonados espaciados uniformemente, que se han detectado por triplicado en la matriz. Después de la hibridación, los sistemas de imágenes digitales se utilizan para capturar y cuantificar las intensidades de fluorescencia relativas de cada uno de los fluoróforos hibridados. [17]La relación resultante de las intensidades de fluorescencia es proporcional a la relación de los números de copias de las secuencias de ADN en los genomas de prueba y de referencia. Si las intensidades de los flurocromos son iguales en una sonda, se interpreta que esta región del genoma del paciente tiene la misma cantidad de ADN en las muestras de prueba y de referencia; si hay una relación Cy3: Cy5 alterada, esto indica una pérdida o una ganancia del ADN del paciente en esa región genómica específica. [18]
Aproximaciones tecnológicas a la matriz CGH [ editar ]
Array CGH se ha implementado utilizando una amplia variedad de técnicas. Por lo tanto, algunas de las ventajas y limitaciones de la matriz CGH dependen de la técnica elegida. Los enfoques iniciales utilizaron matrices producidas a partir de grandes clones de ADN genómico de inserción, como los BAC . El uso de BAC proporciona suficientes señales intensas para detectar cambios de una sola copia y para localizar con precisión los límites de las aberraciones. Sin embargo, los rendimientos iniciales de ADN de los clones de BAC aislados son bajos y las técnicas de amplificación de ADN son necesarias. Estas técnicas incluyen la reacción en cadena de la polimerasa mediada por la ligadura (PCR), la PCR del cebador degenerado utilizando uno o varios conjuntos de cebadores y la amplificación por círculo rodante . [19]Las matrices también se pueden construir utilizando cDNA. Estas matrices actualmente producen una resolución espacial alta, pero el número de ADNc está limitado por los genes codificados en los cromosomas, y su sensibilidad es baja debido a la hibridación cruzada. [14] Esto resulta en la incapacidad de detectar cambios de copia única en una escala del genoma. [20] El último enfoque es detectar los arreglos con oligonucleótidos cortos. La cantidad de oligos es casi infinita, y el procesamiento es rápido, rentable y fácil. Aunque los oligonucleótidos no tienen la sensibilidad para detectar cambios de copia única, el promedio de las proporciones de los oligos que se mapean uno al lado del otro en el cromosoma puede compensar la sensibilidad reducida. [21] También es posible utilizar matrices que tienen sondas superpuestas para que se puedan descubrir puntos de interrupción específicos.
Enfoques de diseño [ editar ]
Existen dos enfoques para el diseño de microarrays para aplicaciones CGH: genoma completo y específico.
Arreglos de genoma completo están diseñados para cubrir todo el genoma humano. A menudo incluyen clones que proporcionan una amplia cobertura en todo el genoma; y matrices que tienen cobertura contigua, dentro de los límites del genoma. Arreglos de genoma completo se han construido principalmente para aplicaciones de investigación y han demostrado su valor excepcional en el descubrimiento de genes. También son muy valiosos para detectar el genoma en busca de ganancias y pérdidas de ADN en una resolución sin precedentes. [17]
Los arreglos dirigidos están diseñados para una (s) región (es) específica (s) del genoma con el propósito de evaluar ese segmento objetivo. Puede diseñarse para estudiar un cromosoma o segmento cromosómico específico o para identificar y evaluar anomalías específicas de la dosis de ADN en individuos con sospecha de síndromes de microdeleción o reordenamientos subteloméricos. El objetivo crucial de una micromatriz dirigida en la práctica médica es proporcionar resultados clínicamente útiles para el diagnóstico, el asesoramiento genético, el pronóstico y el manejo clínico de las anomalías citogenéticas desequilibradas. [17]
Aplicaciones [ editar ]
Convencional [ editar ]
La CGH convencional se ha utilizado principalmente para la identificación de regiones cromosómicas que se pierden o ganan de forma recurrente en los tumores, así como para el diagnóstico y pronóstico del cáncer. [22]Este enfoque también se puede utilizar para estudiar las aberraciones cromosómicas en genomas fetales y neonatales . Además, el CGH convencional se puede usar para detectar anomalías cromosómicas y se ha demostrado que es eficaz para diagnosticar anomalías complejas asociadas con trastornos genéticos humanos. [14]
En la investigación del cáncer [ editar ]
Los datos de CGH de varios estudios del mismo tipo de tumor muestran patrones consistentes de aberraciones genéticas no aleatorias. [23] Algunos de estos cambios parecen ser comunes a varios tipos de tumores malignos, mientras que otros son más específicos del tumor. Por ejemplo, las ganancias de las regiones cromosómicas lq, 3q y 8q, así como las pérdidas de 8p, 13q, 16q y 17p, son comunes a varios tipos de tumores, como el cáncer de mama, ovario, próstata, renal y vejiga (Figura. 3). Otras alteraciones, como las ganancias de 12p y Xp en el cáncer testicular, 13q ganan 9q en el cáncer de vejiga, 14q en el cáncer renal y la pérdida de Xp en el cáncer de ovario son más específicas y pueden reflejar las fuerzas de selección únicas que operan durante el desarrollo del cáncer en diferentes órganos . [23] Array CGH también se utiliza con frecuencia en la investigación y el diagnóstico de tumores malignos de células B, como la leucemia linfocítica crónica.
Las aberraciones cromosómicas [ editar ]
Cri du Chat (CdC) es un síndrome causado por una eliminación parcial del brazo corto del cromosoma 5. [24]Varios estudios han demostrado que la CGH convencional es adecuada para detectar la eliminación, así como alteraciones cromosómicas más complejas. Por ejemplo, Levy et al. (2002) informaron sobre un niño con un grito similar a un gato, el sello distintivo de CdC, pero con un cariotipo indistinto. El análisis de CGH reveló una pérdida de material cromosómico de 5p15.3 confirmando el diagnóstico clínicamente. Estos resultados demuestran que la CGH convencional es una técnica confiable para detectar aberraciones estructurales y, en casos específicos, puede ser más eficiente en el diagnóstico de anomalías complejas. [24]
Array CGH [ editar ]
Las aplicaciones CGH de Array están dirigidas principalmente a detectar anomalías genómicas en el cáncer. Sin embargo, la matriz CGH también es adecuada para el análisis de las aberraciones del número de copias de ADN que causan trastornos genéticos humanos. [14] Es decir, la matriz CGH se emplea para descubrir eliminaciones, amplificaciones, puntos de interrupción y anomalías de ploidía. El diagnóstico temprano es beneficioso para el paciente, ya que pueden someterse a los tratamientos y asesoramiento adecuados para mejorar su pronóstico. [10]
Alteraciones genómicas en el cáncer [ editar ]
Las alteraciones genéticas y los reordenamientos ocurren con frecuencia en el cáncer y contribuyen a su patogénesis. Detectando estas aberraciones por medio de una matriz, CGH proporciona información sobre la ubicación de los genes importantes del cáncer y puede tener un uso clínico en el diagnóstico, la clasificación del cáncer y la prognostificación. [17] Sin embargo, no todas las pérdidas de material genético son patógenas, ya que parte del ADN se pierde fisiológicamente durante el reordenamiento de los subgenes de inmunoglobulina. En un estudio reciente, la matriz CGH se ha implementado para identificar regiones de aberración cromosómica ( variación en el número de copias ) en varios modelos de ratón de cáncer de mama, lo que lleva a la identificación de genes cooperantes durante la oncogénesis inducida por myc. [25]
La matriz CGH también puede aplicarse no solo al descubrimiento de anomalías cromosómicas en el cáncer, sino también a la monitorización de la progresión de los tumores. La diferenciación entre lesiones metastásicas y leves también es posible usando FISH una vez que las anomalías han sido identificadas por la matriz CGH. [5] [10]
Aberraciones submicroscópicas [ editar ]
El síndrome de Prader-Willi (SPW) es una anomalía estructural paterna que involucra 15q11-13, mientras que una aberración materna en la misma región causa el síndrome de Angelman (AS). En ambos síndromes, la mayoría de los casos (75%) son el resultado de una eliminación de 3 a 5 Mb de la región crítica PWS / AS. [26]Estas pequeñas aberraciones no pueden detectarse utilizando citogenética o CGH convencional, pero pueden detectarse fácilmente utilizando la matriz CGH. Como prueba de principio Vissers et al. (2003) construyeron una amplia gama de genomas con una resolución de 1 Mb para detectar a tres pacientes con síndromes de microdeleción confirmados por FISH conocidos, incluido uno con SPW. En los tres casos, las anomalías, que van desde 1.5 a 2.9Mb, se identificaron fácilmente. [27] Por lo tanto, se demostró que la matriz CGH es un enfoque específico y sensible en la detección de aberraciones submicroscópicas.
Cuando se usan microarrays superpuestos, también es posible descubrir puntos de interrupción involucrados en las aberraciones cromosómicas.
El diagnóstico genético prenatal [ editar ]
Aunque aún no es una técnica ampliamente utilizada, el uso de la matriz CGH como herramienta para la detección genética previa a la implantación se está convirtiendo en un concepto cada vez más popular. Tiene el potencial de detectar CNV y aneuploidía en óvulos, espermatozoides o embriones que pueden contribuir al fracaso del embrión para implantar, aborto involuntario o afecciones como el síndrome de Down (trisomía 21). Esto hace que la matriz CGH sea una herramienta prometedora para reducir la incidencia de condiciones que alteran la vida y mejorar las tasas de éxito de los intentos de FIV . La técnica involucra la amplificación del genoma completo desde una sola célula que luego se usa en el método CGH de matriz. También se puede utilizar en parejas portadoras de translocaciones cromosómicas.tales como translocaciones recíprocas equilibradas o traslocaciones de Robertson, que tienen el potencial de causar desequilibrios cromosómicos en sus descendientes. [12] [28] [29]
Limitaciones de CGH y matriz CGH [ editar ]
Una desventaja principal de la CGH convencional es su incapacidad para detectar las aberraciones cromosómicas estructurales sin cambios en el número de copias , como mosaicismo , translocaciones cromosómicas equilibradas e inversiones . CGH también puede detectar ganancias y pérdidas en relación con el nivel de ploidia. [30] Además, las regiones cromosómicas con secuencias de ADN repetitivas cortas son altamente variables entre los individuos y pueden interferir con el análisis de CGH. [14] Por lo tanto, las regiones de ADN repetitivo, como los centrómeros y los telómeros, deben bloquearse con ADN repetitivo no marcado (por ejemplo, el ADN de Cot1) y / o pueden omitirse de la selección. [31]Además, la resolución de CGH convencional es un problema práctico importante que limita sus aplicaciones clínicas. Aunque CGH ha demostrado ser una técnica útil y confiable en la investigación y el diagnóstico de los trastornos genéticos tanto del cáncer como de los humanos, las aplicaciones involucran solo anormalidades graves. Debido a la resolución limitada de los cromosomas en metafase, las aberraciones menores de 5 a 10 Mb no pueden detectarse utilizando CGH convencional. [23] Para la detección de tales anomalías, se requiere una técnica de alta resolución. Array CGH supera muchas de estas limitaciones. Array CGH se caracteriza por una alta resolución, su principal ventaja con respecto a los CGH convencionales. La resolución estándar varía entre 1 y 5 Mb, pero se puede aumentar hasta aproximadamente 40 kb complementando la matriz con clones adicionales. Sin embargo, como en CGH convencional, la principal desventaja de la matriz CGH es su incapacidad para detectar aberraciones que no producen cambios en el número de copias y está limitada en su capacidad para detectar mosaicismo. [14]El nivel de mosaicismo que se puede detectar depende de la sensibilidad y la resolución espacial de los clones. En la actualidad, los reordenamientos presentes en aproximadamente el 50% de las celdas son el límite de detección. Para la detección de tales anormalidades, otras técnicas, como SKY (karyotyping espectral) o FISH aún deben ser utilizadas.
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