genética

PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS :

DENSIDAD DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Densidad: existe una relación lineal entre el contenido en G+C y la densidad del ADN determinada en un gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C mayor densidad posee el ADN.

Cuanto mayor es el contenido en (G+C) mayor es la densidad.

Meselson y col. (1957) desarrollaron una técnica de centrifugación en gradiente de densidad. Cuando se centrifuga a alta velocidad un solución densa (saturada) de un soluto de bajo peso molecular (ClCs 7,7 M, sucrosa, etc.) se produce un equilibrio entre dos fuerzas opuestas, la de difusión del soluto y la fuerza de sedimentación, como consecuencia se produce un gradiente de densidad que aumenta en la dirección de la fuerza centrifuga (aumenta a medida que avanzamos hacia el fondo del tubo de centrifuga). Si añadimos al centrifugar una molécula de ADN, está migrará hacia el fondo del tubo hasta llegar al punto en que la densidad del soluto de bajo peso molecular (la densidad del ClCs) coincide con la densidad del ADN centrifugado (densidad de flotación). Posteriormente, es posible aislar las moléculas de ADN de diferente densidad practicando un orificio en el fondo del tubo y sacando varias fracciones diferentes. También es posible pinchar el tubo con una jeringa, justo en la posición de la banda y extraer el ADN contenido de esa zona del tubo. 

Centrifugación en gradiente de CsCl

Basándose en múltiples estudios de la densidad de los ADNs de diferentes organismos y de su composición en bases nitrogenadas, se ha establecido una fórmula empírica que relaciona la densidad de flotación (ρ) con el contenido en G+C expresado en moles por ciento. Está fórmula es la siguiente: ρ = 1,660 + 0,00098(G+C).  

DESNATURALIZACIÓN: TEMPERATURA DE FUSIÓN

Desnaturalización: la proporción A+T/C+G está relacionada en primer lugar con la estabilidad de la molécula de ADN de doble hélice. Cuanto mayor es el contenido en G+C de una molécula, mayor cantidad de pares G-C presentará, como consecuencia tendrá una mayor cantidad de triples enlaces y, por consiguiente, será necesario suministrar una mayor cantidad de energía a esa doble hélice para separar sus dos hebras (desnaturalización o fusión del ADN). Cuanto mayor es el contenido en G+C mayor cantidad de calor que hay que suministrar a un ADN de doble hélice para desnaturalizarlo. La temperatura de fusión (Tm) necesaria para desnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla (punto medio de la reacción ADN doble hélice® ADN hélice sencilla) esta directamente relacionada con el contenido en G+C, a mayor contenido en G+C mayor temperatura de fusión (Tm).

Relación entre el contenido en (G+C) y Tm	Curvas de desnaturalización de diferentes ADNs

ABSORBANCIA A 260 nm

Absorbancia a 2.600 Å: El estado físico de los ácidos nucleicos está relacionado con su capacidad de absorción de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 Å. El menor grado de absorción se produce en estado de doble hélice, la absorción aumenta cuando se produce la desnaturalización pasando a estado de hélice sencilla (efecto hipercrómico, aumento de la absorbancia) y, por último, si degradamos este ADN de hélice sencilla a nivel de nucleótidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia.

Esquema efecto hipercrómico

Por tanto, la absorbancia a 2.600 Å se puede utilizar como una medida del estado físico de la molécula de ADN. Las curvas de fusión tienen forma de S observándose un aumento brusco de la absorbancia al llegar a una temperatura determinada, la temperatura de fusión.  

CINÉTICA DE RENATURALIZACIÓN: CURVAS CoT

Velocidad de renaturalización: la velocidad de renaturalización del ADN de un organismo está relacionada con su complejidad. La complejidad se define como la suma del número de nucleotidos que tiene cada tipo de secuencia sin tener en cuenta el número de veces que esta repetida. El ADN de los virus y las bacterias en su mayoría sólo tiene secuencias que están una sola vez en el genoma (secuencias únicas). Sin embargo, los organismo más complejos, como los eucariontes, presentan distintos tipos de secuencias en su genoma. Los eucariontes tienen secuencias únicas (SU), secuencias de bajo número de copias (SBNC, 2-10 copias), secuencias repetidas (SR, alrededor de 10² copias) y altamente repetidas (SAR, 10³ a 10⁶copias).

Tipo de Secuencia	Nº de repeticiones	Nº de nucleótidos
A (SU)	1	5.700
B (SU)	1	7.530
C (SBNC)	4	3.720
D (SBNC)	6	4.350
E (SR)	200	500
F (SAR)	10.000	300
G (SAR)	1.000.000	200
Complejidad		22.300

Si imaginamos un organismo eucarionte con los tipos de secuencias indicados en la tabla anterior, su complejidad sería la suma del número de nucleótidos de cada tipo de secuencia (22.300) sin tener en cuenta el número de veces que está repetida cada una de ellas.

No es difícil imaginar que la velocidad de renaturalización del ADN (paso de dos hélices sencillas a una doble hélice) este relacionada con el número de veces que esta repetida una determinada secuencia.

Supongamos que tenemos dos organismos hipotéticos distintos, ambos con la misma cantidad de ADN (1.000.000 de pares de nucleótidos). El organismo A posee 1.000 secuencias únicas diferentes, cada una con una longitud media de 1.000  nucleótidos. El organismo B tiene una secuencia de 100 nucleótidos de longitud que está repetida 10.000 veces. Si extraemos el ADN de estos dos organismos por separado, lo desnaturalizamos y las piezas de ADN desnaturalizado de cada organismo se ponen en condiciones de renaturalizar (tamaño uniforme de los fragmentos de ADN, entre 250 y 450 pb, temperatura, condiciones iónicas, etc), es evidente que el ADN del organismo B renaturalizará mucho antes, más rápidamente, que el del organismo A, ya que es mucho más probable que la secuencia que está repetida 10.000 veces encuentre otra complementaria en el medio de reacción para formar la doble hélice.

Las curvas de renaturalización o curvas Cot, de organismos que carecen de secuencias repetidas como virus y bacterias, tienen forma de S, tienen un sólo punto de inflexión o punto medio de la reacción. Todas las secuencias son únicas y tienen la misma probabilidad de encontrar a su complementaria para formar la doble hélice.

Curvas Cot de virus y bacterias	Curvas Cot de un eucarionte

Las curvas Cot de organismos eucariontes con diferentes tipos de secuencias, poseen varios puntos de inflexión. Cada uno de ellos correspondiente a un tipo de secuencias (únicas, moderadamente repetidas, y altamente repetidas).

Como en el caso de las curvas de fusión, también se utiliza como medida el punto medio de la reacción de renaturalización, es decir, el Cot ½ o tiempo al que se ha reasociado la mitad del ADN. El Cot ½ es directamente proporcional a la complejidad del ADN del organismo. Valores de Cot ½ bajos (10^-4 a 10^-1) corresponden a secuencias altamente repetidas, valores de Cot ½ comprendidos entre 10 y 10² corresponden a secuencias moderadamente repetidas y las secuencias únicas o de bajo número de copias dan lugar a valores de Cot ½ altos (mayores de 10³) .

HIBRIDACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Las técnicas de desnaturalización y posterior renaturalización se utilizan para conseguir la hibridación de ácidos nucleicos, es decir, una vez separadas las dos hebras del ADN doble hélice, es posible volver a formar una doble hélice con una hebra de ADN que sea complementaria (hibridación de ADN con ADN) o volver a formar una doble hélice con un segmento de ARN que contenga la secuencia complementaria (hibridación de ADN con ARN).

Endonucleasas de restricción

Las técnicas de hibridación (desnaturalización y posterior renaturalización) permiten, por ejemplo, identificar el gen que ha dado lugar a un determinado ARN-mensajero. Si se aísla un mensajero determinado en una célula, es posible hibridar este ARN con el ADN de la célula previamente fragmentado mediante el uso de endonucleasas de restricción. 

Las endonucleasas de restricción de tipo II son enzimas que reconocen secuencias cortas de ADN (de 4 a 6 pares de bases) de tipo palindrómico y cortan por el interior de la secuencia diana a la misma altura en las dos hélices de ADN (corte simétrico) o a distinto nivel en cada hélice (corte asimétrico). 

Eco RI	Hae III

Dichas endonucleasas de restricción fueron descubiertas por Werner Arber, Hamilton O. Smith y Daniel Nathans en la bacteria E.coli , trabajos por los que recibieron el premio Nobel. Estas enzimas forman parte del sistema de defensa (sistema de modificación-restricción) de las bacterias frente a la entrada de ADN exógeno en su interior. Existen cientos de endonucleasas diferentes que reconocen distintas secuencias cortas de tipo palíndrómico. En la siguiente tabla se indican algunas de las endonucleasas más frecuentes:

Endonucleasa de restricción	Bacteria de la que procede	Secuencia que reconoce (5'→ 3') y lugar de corte (¯)
Eco RI	Escherichia coli	5' G¯AATTC 3' (asimétrico)
Eco RII	Escherichia coli	5' ¯CCTGG 3' (asimétrico)
Hae III	Haemophilus aegyptus	5' GG¯CC 3' (simétrico)
Hin dII	Haemophilus influenzae	5' GTPi¯Pu AC 3' (simétrico)
Hin dIII	Haemophilus influenzae	5' A¯AGCTT 3' (asimétrico)
Hpa I	Haemophilus parainfluenzae	5' GTT¯AAC 3' (simétrico)
Hpa II	Haemophilus parainfluenzae	5' C¯CGG 3' (asimétrico)
Ava I	Anabaena variabilis	5' CGPu¯PiCG 3' (simétrico)

La utilización de diferentes endonucleasas y la separación por tamaños de los fragmentos producidos mediante electroforesis permite construir lo que se denomina Mapas de restricción.

Cuando el ADN de un organismo eucarionte se fragmenta con una endonucleasa de restricción, se producen cientos de miles o incluso hasta millones de fragmentos. Dichos fragmentos se separan por tamaños mediante electroforesis en geles de agarosa, una vez se parados por tamaños se transfieren los fragmentos a una membrana de nylon en condiciones desnaturalizantes y de forma que permanezcan en la misma posición. Los fragmentos desnaturalizados y pegados a la membrana se pueden renaturalizar o hibridar utilizando una segmento de ADN o de ARN (habitualmente denominado sonda) marcado radiactivamente. Dicha sonda, hibridará solamente con aquellos fragmentos de ADN que contengan la secuencia complementaria. La técnica que permite transferir los fragmentos de ADN desnaturalizados a una membrana de nylon y posteriormente hibridar con una sonda de ADN marcada se denomina Técnica Southern (hibridación ADN-ADN), cuando la hibridación se realiza con una sonda de ARN marcada se denomina Northern (hibridación ADN-ARN).

El empleo combinado de endonucleasas de restricción y de diferentes sondas de ADN de secuencia única marcadas permite obtener Polimorfismos para Longitudes de Fragmentos de Restricción (RFLPs), muy utilizados en la construcción de mapas de ligamiento.

Hibridación "in situ"

Las técnicas de hibridación "in situ" permiten localizar un segmento concreto de ADN (por ejemplo un gen) en una posición determinada de un cromosoma eucariótico. Es posible obtener preparaciones citológicas de cromosomas en metafase mitótica o en otras fases del ciclo, desnaturalizar el ADN de los cromosomas en la propia preparación citológica y posteriormente hibridar con la pieza de ADN deseada marcada. Actualmente, el marcaje suele ser de tipo fluorescente, denominándose dicha técnica Hibridación "in situ" mediante fluorescencia (abreviadamente FISH). También, es posible marcar todo el ADN de un genomio o juego de cromosomas completo y realizar una Hibridación "in situ" Genómica (abreviadamente GISH) que permite averiguar si los cromosomas de un determinado genomio están presentes. Otra aplicación, consiste en detectar determinados cromosomas o regiones cromosómicas concretas utilizando sondas o piezas de ADN marcadas mediante fluorescencia y procedentes solamente del cromosoma deseado, de esta manera, se obtiene lo que se denomina Pintura Cromosómica.

FISH trigo (Triticum intermedium)	GISH: Híbrido (Liliaceae)	Pintura cromosómica (ratón)	Pintura cromosómica (humanos)

SECUENCIACIÓN DEL ADN: MÉTODO DIDESOXI Y MÉTODO AUTOMÁTICO

El análisis más detallado de la estructura del ADN consiste en averiguar la secuencia de nucleótidos. A lo largo del tiempo se han desarrollado diferentes métodos para obtener la secuencia de nucleótidos del ADN, sin embargo, actualmente los métodos más utilizados son el de secuenciación automática y el método enzimático de terminación de cadena de Sanger también conocido por el método didesoxi.

Método enzimático de terminación de cadena o método didesoxi de Sanger

Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el método enzimático de terminación de cadena, se necesitan los siguientes compuestos:

• El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado. Además, debe estar en estado de hélice sencilla.
• Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4. La ADN Polimersa I del fago T4 emplea como molde ADN de hélice sencilla y siguiendo las reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas va añadiendo nucleótidos a partir de un cebador o "primer".
• Un cebador o "primer" que suele ser un oligonucleótido corto de alrededor de 20 bases de longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a añadir nucleótidos por el extremo 3' OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de nucleótidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un "primer"  con secuencia complementaria al vector empleado para clonar el fragmento de ADN, además, este cebador procede de una región del vector muy cercana al punto de inserción del ADN problema  cuya secuencia se conoce. El "primer" utilizado suele marcarse radiactivamente.
• Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatro nucleótidos trifosfato en cada reacción.
• Por último, se necesitan nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucleótidos didesoxi son nucleótidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posición 3' de la desoxirribosa. Estos nucleótidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos ningún otro nucleótido por el extremo 3'. Por tanto, una vez incorporado un nucleótido didesoxi se termina la síntesis de la cadena de ADN.

Breve descripción del método enzimático de terminación de cadena

• En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reacción. Cada mezcla de reacción contiene los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP), ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucleótido dideoxi, por ejemplo ddATP, a una concentración baja. El nucleótido didesoxi utilizado (ddATP en este ejemplo) competirá con su homólogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN que se está sintetizando, produciendo la terminación de la síntesis en el momento y lugar donde se incorpora.
• Por este sistema, en cada mezcla de reacción se producen una serie de moléculas de ADN de nueva síntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo nucleótido y marcadas todas radiactivamente por el extremo 5' (todas contienen en el extremo 5' el cebador utilizado).

• Los fragmentos de ADN de nueva síntesis obtenidos en cada mezcla de reacción se separan por tamaños mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida muy finos (0,5 mm de espesor) y de gran longitud (cerca de 50 cm) que permiten distinguir fragmentos de ADN que se diferencian en un solo nucleótido.Los productos de cada una de las cuatro mezclas de reacción se insertan en cuatro calles o carriles diferentes del gel.
• Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una película fotográfica de autorradiografía. La aparición de una banda en una posición concreta de la autorradiografía en una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la secuencia del ADN de nueva síntesis (complementario al ADN molde) está la base correspondiente al nucleótido didesoxi utilizado en la mezcla de reacción correspondiente.

Esquema de las electroforesis de las reacciones de secuenciación	Autorradiografía

• Teniendo en cuenta que el ADN de nueva síntesis crece en la dirección 5' → 3', si comenzamos a leer el gel por los fragmentos de menor tamaño (extremo 5') y avanzamos aumentando el tamaño de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del ADN de nueva síntesis en la dirección 5' → 3'.

Breve descripción del método automático de secuenciación

• La principal diferencia entre método enzimático de terminación de cadena y el método automático de secuenciación radica, en primer lugar en el tipo de marcaje. En el método automático en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reacción, cada una con nucleótido trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva síntesis producto de las cuatro mezclas de reacción.
• La segunda diferencia radica en el sistema de detección de los fragmentos de ADN. La detección del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reacción se lleva a cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamaño que ya han sido detectados se dejan escapar del gel, permitiendo este sistema aumentar el número de nucleótidos que se pueden determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciación.

El siguiente esquema representa de forma abreviada el método automático de secuenciación.

Esquema del método automático de secuenciación

En la siguiente figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el método automático de secuenciación. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucleótido existente en esa posición de la secuencia.

Secuencia obtenida  por métodos automáticos