genética

HIPÓTESIS "UN GEN - UNA ENZIMA": EXPERIMENTOS DE BEADLE Y EPHRUSSI (1937) Y DE BEADLE Y TATUM (1941).

Los principales experimentos que han conducido a la formulación de la hipótesis "un gen - una enzima" son los siguientes:

• Experimentos de Beadle y Ephrussi (1937): pigmentación del color de los ojos en Drosophila melanogaster, técnica de trasplante de "discos imaginales".
• Beadle y Tatum (1941): estudio de rutas metabólicas utilizando mutantes nutricionales en el moho rojo del pan Neurospora crassa.

EXPERIMENTOS DE BEADLE Y EPHRUSSI (1937).

En sus trabajos analizaron 24 mutantes distintos que afectaban al color de los ojos en D. melanogaster. El color normal o salvaje de los ojos compuestos de este díptero es rojo oscuro. Este color es el resultado de la mezcla de dos tipos de pigmentos distintos, los pigmentos de color rojo o pterinas y los pigmentos de color marrón u onmocromos. De los 24 mutantes inicialmente utilizados estudiaron más detenidamente dos, el mutante vermilion (v) y el mutante cinnabar (cn) con color de ojos bermellón y rojo cinabrio, respectivamente. Ambos mutantes afectaban a la ruta de formación del pigmento marrón o xantomatina.

Hembra de Drosophila melanogaster	Ojo compuesto de color rojo normal

Para llevar a cabo sus experimentos desarrollaron una técnica de trasplante de "discos imaginales". El desarrollo de D. melanogaster en condiciones óptimas de laboratorio puede realizarse entre 12 y 14 días. Las hembras fecundadas de este díptero ponen sus huevos en el medio de cultivo, dos días después sale un larva, cinco días después las larvas se trasforman en pupas y en cinco días más emerge una mosca adulta o imago. Durante este proceso de desarrollo el individuo adulto se forma a partir de determinados grupos de células de la larva y el resto de las células de la larva se histolizan. Cada uno de los grupos de células de la larva que están determinados para formar una determinada estructura del individuo adulto se denomina "disco imaginal". Existe un "disco imaginal" para los ojos, otro para el primer par de patas, otro para el segundo par de patas, otro para tórax y alas, etc....

En las siguientes figuras se muestran el ciclo de vida de D. melanogaster y las estructuras adultas que se originan a partir de los diferentes "discos imaginales" de la larva.

Ciclo de vida de D. melanogaster	Discos imaginales y estructuras adultas

La técnica que desarrollaron consistió en tomar "disco imaginal" de ojo de una larva donadora y trasplantarlo a una larva receptora, en una región de la larva receptora que va a dar lugar al abdomen. Como consecuencia, cuando la larva receptora del injerto termina su desarrollo y se convierte en imago, el adulto resultante tiene un ojo extra o supernumerario en el abdomen.

Seguidamente trasplantaron "disco imaginal" de ojo de larvas donadoras vermilion a larvas receptoras normales y también trasplantaron "disco imaginal" de ojo de larvas donadorascinnabar a larvas receptoras normales. En ambos casos, los individuos adultos resultantes presentaban un ojo extra en el abdomen de color normal.

También trasplantaron "disco imaginal" de ojo de larvas donadoras vermilion a larvas receptoras cinnabar y el adulto resultante presentó un ojo extra en el abdomen de color normal. Sin embargo, cuando trasplantaron "disco imaginal" de ojo de larva donadora cinnabar sobre larva receptora vermilion, el adulto resultante tenía un ojo extra en el abdomen de color cinnabar.

	Ephrussi y Beadle
Trasplante de "disco imaginal" vermilion sobre larva cinnabar
	G. Beadle
Trasplante de "disco imaginal" cinnabar sobre larva vermilion

Beadle y Ephrussi supusieron que los mutantes vermilion y cinnabar tenían bloqueado algún paso de la ruta que conduce a la formación de los pigmentos del ojo. Además, pensaron que en el abdomen de las larvas receptoras había sustancias que podían difundir hacia las células del "disco imaginal" injertado. Por este motivo, las células de los "discos imaginales" procedentes de los mutantes vermilión y cinnabar trasplantadas a larvas receptoras normales daban lugar a un ojo extra de color normal. La larva receptora podía suministrar sustancias posteriores al punto de bloqueo de estos mutantes.

Cuando analizaron los trasplantes entre vermilion y cinnabar, vieron que el abdomen de la larva receptora cinnabar podía suministrar al "disco imaginal" de ojo vermilion una sustancia posterior a su punto de bloqueo, de manera que este podía proseguir la ruta y producir el pigmento marrón, apareciendo un ojo extra normal. Sin embargo, las células del abdomen de la larva receptora vermilion no pueden suministrar al "disco imaginal" de ojo de cinnabar una sustancia posterior a su punto de bloqueo, de forma que no puede proseguir en la ruta y el ojo extra es cinnabar.

Como conclusión indicaron que el mutante vermilión bloqueaba la ruta de formación del pigmento marrón en un punto anterior al del bloqueo del mutante cinnabar. La ruta propuesta para la formación del pigmento marrón fue la siguiente:

	vermilion		cinnabar
Precursor	→	Sust. Interm. I	→	Sust. Interm. II	→	Pigmento  marrón

En trabajos posteriores llegaron a la conclusión de que el precursor de la ruta era Triptófano, la sustancia intermedia I era Formilquinurenina, la sustancia intermedia II era Hidroxiquinurenina y el pigmento final marrón era la xantomatina.

Por tanto, la mutación vermilión bloqueaba el paso entre triptófano y formilquinurenina, mientras que la mutación cinnabar bloqueaba entre formilquinurenina e hidroxiquinurenina.

EXPERIMENTOS DE BEADLE Y TATUM (1941).

Beadle y Tatum estudiaron mutantes nutricionales del moho rojo del pan (Neurospora crassa). 

Neurospora crassa: moho anaranjado del pan.	Hifas vegetativas y esporas asexuales a la izquierda, ascas con esporas sexuales a la derecha. Neurospora crassa

Antes de comenzar con los experimentos realizados por Beadle y Tatum creo que es conveniente repasar el ciclo biológico de Neurospora crassa, organismo haploide.

Neurospora crassa es un organismo haploide, con un solo juego de cromosomas, que en un determinado momento de su ciclo vital pasa por un estado diploide, con dos juegos de cromosomas, y sufre la meiosis para originar las esporas sexuales. Es un organismo multicelular en el que las células se unen por sus extremos para formas cadenas de células o hifas. Las hifas penetran en el sustrato y también envían ramas aéreas que contienen unas células llamadas conidios (esporas asexuales). Las esporas sexuales o ascosporas son expulsadas por el cuerpo fructífero o peritecio de manera que cada una de ellas puede originar por mitosis un nuevo individuo (hifas). Las esporas asexuales se desprenden o dispersan para formar nuevas colonias o, alternativamente, actúan como gametos masculinos. La autofecundación no es posible en esta especie. Existen dos tipos sexuales determinados por los alelos A y a de un gen. Un cruzamiento solamente puede tener éxito si es del tipo A x a. Una espora asexual del sexo opuesto se fusiona con un pelo receptivo, y el núcleo haploide de la espora desciende por el pelo hasta emparejarse con un núcleo haploide del nódulo. Seguidamente los núcleos emparejados sufren una serie de divisiones sincrónicas y finalmente se fusionan los núcleos y aparecen los meiocitos diploides. Estos meiocitos sufren la meiosis y dan lugar a las ascas que contienen las ascosporas (esporas sexuales).

Ciclo de vida de Neurospora crassa

Ciclo de vida de Neurospora crassa

Los mutantes nutricionales son incapaces de crecer en medios mínimos, mientras que las cepas normales de Neurospora pueden crecer en medios mínimos que contienen sustancias simples como azúcar, algunas sales y ácidos orgánicos, una fuente de nitrógeno (nitrato y tartrato amónicos) y la vitamina biotina. Las estirpes mutantes nutricionales incapaces de vivir enmedio mínimo también se las denomina cepas auxótrofas. Las cepas mutantes nutricionales necesitan para poder crecer que se añadan al medio mínimo determinadas sales, vitaminas, aminoácidos u otras sustancias. Los medios mínimos a los que se les ha añadido alguna sustancia se les denomina medios suplementados. Todas las cepas mutantes son capaces de crecer en medios completos que contienen todos los compuestos anteriormente citados.

Desarrollaron un método de enriquecimiento de mutantes para obtener gran cantidad de estirpes con mutaciones en diferentes pasos de las rutas metabólicas que consistía en irradiar las esporas de Neurospora crassa con luz ultravioleta o con rayos X para producir mutaciones. Las esporas irradiadas se hacían crecer en un medio mínimo. En dicho medio solamente crecen aquellas esporas que carezcan de alteraciones en las rutas metabólicas, es decir, las esporas normales (prototrofas), mientras que las esporas mutantes auxótrofas no generan hifas. Después, de haberlas dejado crecer en el medio mínimo se pasan a través de una malla o tamiz que retiene a las esporas normales (las que han generado hifas) y deja pasar a las mutantes que no han generado hifas. De esta forma tan simple conseguían separar las esporas normales de las mutantes.

Seguidamente, cada espora se ponía a crecer en un medio completo y se cruzaba por una estirpe normal. Estudiaban el tipo de herencia y comprobaban que la alteración de la cepa mutante se debía a un gen con herencia mendeliana, y además conseguían obtener en la descendencia una gran cantidad de esporas mutantes con la misma alteración, con el mismo paso metabólico bloqueado.

El siguiente paso consistía en averiguar el paso metabólico bloqueado de cada estirpe mutante. Para ello tomaban esporas individuales (normales y mutantes) descendientes de los cruzamientos  y las crecían en primer lugar en medio completo para multiplicarlas, a continuación replicaban las muestras en medio mínimo (solo crecen las normales), identificando como mutantes las cepas que no crecen en el medio mínimo. Las estirpes mutantes se sembraban a continuación en medio mínimo, en medio mínimo suplementado con todos los aminoácidos, en medio mínimo suplementado con todas las vitaminas y en medio completo. De esta manera identifican si el paso bloqueado pertenecía a alguna ruta de síntesis de aminoácidos o de vitaminas. Si la estirpe mutante solo crecía en el medio completo y en el suplementado con todos los aminoácidos, deducían que el bloqueo se encontraba en alguna ruta de síntesis de aminoácidos. Posteriormente, crecían la cepa mutante en medio mínimo y en medios suplementados con cada uno de los 20 aminoácidos. Así identificaban el aminoácido que no podían sintetizar y que necesitaban para crecer. Una vez identificado el aminoácido probaban otras sustancias relacionadas con él. Por ejemplo, Beadle y Tatum encontraron tres mutantes distintos que necesitaban para crecer arginina (arg1, arg2 y arg3) y probaron si eran capaces de crecer en medios suplementados con ornitina y citrulina (compuestos relacionados con la arginina). Comprobaron que el mutante arg1 necesitaba para crecer o bien arginina, o bien ornitina o bien citrulina. El mutante arg2 sólo podía crecer o con ornitina o con arginina pero no crecía cuando se añadía citrulina. El mutante arg3 solamente crecía cuando se suplementaba con arginina.

Para resolver esta situación supusieron que cada mutante tenía un paso metabólico bloqueado distinto. Supusieron que cuando se suplementa el medio mínimo con un compuesto posterior al punto de bloqueo el mutante puede producir el compuesto final y crecer, mientras que si se suplementa con un compuesto anterior al punto de bloqueo no puede crecer. Igualmente, razonaron que cuantos más mutantes crecían con un determinado compuesto de la ruta, tanto más hacía el final de la ruta debería estar el compuesto añadido. De la misma forma, cuantos menos mutantes crecen con una sustancia tanto más hacia el principio de la ruta estará esa sustancia. La tabla de crecimiento obtenida con los mutantes que afectaban a la síntesis de arginina fue la siguiente:

Crecimiento de las cepas mutantes en repuesta a distintas sustancias
	Suplemento: sustancia añadida al medio mínimo
Estirpe mutante	Ornitina	Citrulina	Arginia
arg1	+	+	+
arg2	-	+	+
arg3	-	-	+
+ = crecimiento, - = no crecimiento

Llegaron a la siguiente conclusión, la arginina debe ser el compuesto final de la ruta ya que los tres mutantes crecen cuando se añade al medio mínimo. La citrulina debe ser anterior a la arginina, ya que hay dos mutantes que crecen con ella, mientras que la ornitina debe ser anterior a citrulina ya que solamente un mutante crece cuando se añade. El primer compuesto de la ruta sería un precursor. El mutante arg3 debe estar bloqueado entre citrulina y arginina, ya que crece con un compuestos posteriores al bloqueo (arginina) pero no lo hace con los anteriores (citrulina y ornitina). El mutante arg2  debe estar bloqueado entre ornitina y citrulina pues crece con los compuestos posteriores (citrulina y arginina) pero no crece con los anteriores (ornitina). Por último, el mutante arg1 debe estar bloqueado en un paso anterior a ornitina, ya que crece con todos las sustancias posteriores (ornitina, citrulina y arginina).

	arg1		arg2		arg3
Precursor	→	Ornitina	→	Citrulina	→	Arginina