martes, 31 de marzo de 2015

genética


CÍRCULO RODADOR

Los mecanismos de replicación en virus y bacterias dependen de la propia estructura del material hereditario o cromosoma de la especie procarionte estudiada. Por tanto, el mecanismo de replicación varía según se trata de moléculas de ADN circulares doble hélice (E. coli, papovavirus), ADN cirlar de una hélice (fX174), ADN doble hélice lineal con redundancia terminal (fago T7) o ADN doble hélice lineal con extremos cohesivos (fago l). El mecanismo de replicación puede adoptar la forma q (E. coli, plasmidios), el modelo del circulo rodador (fX174, Fago l) o el Lazo de desplazamiento o lazo D (ADN mitocondrial).
En el modelo del círculo rodador una endonucleasa corta una de las hélices (hélice externa en el esquema) y el extremo 5' se fija a la membrana. El extremo 3'OH producido por el corte lo utiliza la ADN polimerasa como cebador para ir añadiendo nucleótidos y copiando la otra hélice (hélice interna en el esquema). Por el otro extremo de la hélice cortada (el extremo 5') también se va sintetizando una nueva hebra. Lo que se supone que sucede es que la hélice interna giraría de forma continua  en el sentido indicado haciendo que cada vez saliera más cantidad de la hélice inicialmente cortada por la endonucleasa. La hélice interna seguiría dando vueltas de forma que sería copiada varias veces al igual que la hélice que emerge por el lado derecho, formándose una molécula ADN doble hélice muy larga que contienen varias copias sucesivas del ADN del fago. Estas moléculas reciben el nombre de multímeros o concatémeros. El el caso del fago l, posteriormente una endonucleasa denominada ter reconoce la secuencia de doce pares de bases de los extremos cohesivos del fago y produce un corte asimétrico para liberar copias independientes del ADN doble hélice lineal del fago. 
Esquema Circulo rodadorCirculo rodador

REPLICACIÓN DE LOS TELÓMEROS

Las moléculas ADN doble hélice lineal tienen problemas para replicar sus extremos, ya que las ADN polimerasas necesitan un extremo 3' OH al que ir añadiendo nucleótidos. Uno de los extremos de cada hélice (el extremo 5') se puede copiar sin problemas debido a que viene cebado desde atrás, sin embargo, el extremo contrario (extremo 3') no podría replicarse ya que no puede ser cebado desde atrás. Como consecuencia quedaría un corto segmento al final sin copiarse y se iría acortando el ADN por ese extremo en cada ronda de replicación.
Problemas de replicación de los extremos
Algunos virus resuelven este problema de una manera sencilla. Por ejemplo, el fago l cuyo material hereditario es ADN doble hélice lineal con extremos cohesivos, lo primero que hace cuando infecta a E. coli y va a replicar su ADN es convertirse en ADN doble hélice circular a través de los extremos cohesivos. De este manera, ya han desaparecido los problemas de replicación de los extremos lineales.
Otros virus, como los Adenovirus resuelven el problema gracias a la existencia de una proteína que se une al extremo 5' y que contiene un residuo de serina unido a un nucléotido CTP que suministra el extremo 3' necesario para que la ADN polimerasa pueda cebarse y copiar el extremo. La proteína que forma un complejo con la ADN polimerasa tiene 80 Kd, sin embargo, la proteína que aparece en el interior de las partículas virales maduras tiene solamente 55 Kd. Por tanto, durante la maduración del virus debe ser procesada y pasar de 80 Kd a 55 Kd. El virus f29 también tiene proteínas unidas al extremo 5' implicadas en la replicación y algunos virus ARN como el virus de la polio poseen proteínas de bajo peso molecular (Vpg) con solo 22 aminoácidos están unidas al extremo 5' .
Replicación de los extremos en Adenovirus
La replicación de los extremos de los cromosomas eucarióticos también supone un problema, ya que los cromatidios son moléculas de ADN doble hélice lineal y se irían acortando en las sucesivas replicaciones. La manera de solventar este problema consiste en disponer de secuencias repetidas en los extremos, los telómeros eucarióticos contienen una secuencia corta rica en Guanina repetida cientos de veces ( por ejemplo la secuencia 5' TTGGGG 3' en el ciliado Tetrahymena). Además, los telómeros poseen extremos 3' monocatenarios que pueden autoaprearse y suministrar un extremo 3' para replicar los extremos cromosómicos.
Un enzima denominado Telomerasa añade estas secuencias a los extremos cromosómicos. La Telomerasa lleva una corta secuencia de ARN (por ejemplo AACCCC) que sirve de molde para sintetiza la secuencia repetida de los extremos (TTGGGG). La telomerasa, es una transcriptasa inversa, ya que tomando como molde ARN sintetiza ADN. La adición de estas secuencias cortas que lleva a cabo la Telomerasa contrarresta la tendencia al  acortamiento de los telómeros durante la replicación normal.
La telomerasa tiene un pequeño fragmento de ARN

 LAS ADN POLIMERASAS DE E. Coli.

En la bacteria E. coli Arthur Kornberg encontró tres ADN polimerasas diferentes, la ADN Pol I, ADN Pol II y ADN Pol III. Por sus estudios sobre la replicación del ADN y las polimerasas le concedieron el Premio Nobel en 1959.
Las principales etapas de la síntesis de ADN son:
  • Síntesis de los desoxirribonucleótidos monofosfato (dNMPs): dAMP, dTMP, dGMP y dCMP.
  • Fosforilación mediante Quinasas de los dNMP, para convertirlos en desorribonucleótidostrifosfato dNTPs: dATP, dTTP, dGTP y dCTP.
  • Polimerización o síntesis del ADN: selección de los dNTPs complementarios a las de la cadena molde y formación del enlace fosfodiéster entre el extremo 3' del nucleótido (dNTP) anteriormente incorporado y el extremo 5'P del siguiente dNTP.
Las ADN Polimerasas de E. coli solamente saben sintetizar (polimerizar) ADN en la dirección 5'P - 3'OH.
Las principales características de las ADN Polimerasas de E.coli, se pueden resumir en la siguiente tabla:
 ADN Pol IADN Pol IIADN Pol III
EstructuraPM (dalton)
Constitución
Nº Polimerasas/célula
 109.000
Monómero
400
 90.000
Monómero
Desconocido
 900.000
Multímero asimétrico
10-20
Actividad/FunciónPolimeras 5'-3' /Elongación
Exonucleasa 3'-5'/Correctora
Exonucleasa 5'-3'/Reparación
 SI
SI
SI
 SI
SI
NO
 SI
SI
NO
La ADN Pol III y la ADN Pol I son las enzimas que intervienen directamente en la replicación del ADN de E. coli. La ADN Pol I tiene un papel reparador, retira los cebadores con su actividad exonucleasa 5'- 3' y rellena el hueco con su actividad polimerrasa 5'- 3'. 
A la ADN Pol II se la asigna exclusivamente una función reparadora, pero la muchas de sus características y el papel que juega en la replicación del ADN, si es que juega alguno, son desconocidas.
La ADN Pol III es la enzima que realiza la mayoría de la replicación del ADN, el corazón catalítico del enzima lo constituyen las subunidades a (encargada de la polimerización), e (realiza la función correctora de pruebas) y q (¿ensamblaje de las subunidades?). Realmente, el complejo enzimático que lleva a cabo la replicación es un multímero denominado Holoenzima de ADN Pol III que posee muchas cadenas o subunidades polipeptídicas. Este multímero es realmente un dímero asimétrico, una mitad del dímero se encarga de sintetizar la hélice retardada y la otra mitad sintetiza la hélice conductora. La subunidad t interviene en la unión del dímero, el complejo g-d produce la unión al ADN molde y la subunidad b sujeta el enzima al ADN.
Esquema de la formación y composición del Holoenzima de ADN Pol III
El proceso de síntesis de ADN tiene que producir dos moléculas exactamente iguales, ya que cualquier error que se cometa durante la replicación, si no se repara, se convertirá en una mutación. Por tanto, Las ADN polimerasas deben ser bastante fieles copiando el ADN. Para ello poseen una función correctora de pruebas que retira el último nucleótido que la polimerasa haya introducido de forma incorrecta, dicha función, se denomina función exonucleasa 3' - 5' y la lleva a cabo la subunidad e de la ADN Pol III.
En el siguiente esquema se indica como la subunidad e de la ADN Pol III retira la Adenina introducida de forma incorrecta mediante la función exonucleasa 3' - 5'.

LAS ADN POLIMERASAS EUCARIÓTICAS

Las ADN polimerasas eucarióticas tienen una diferencia interesante con las ADN polimerasas de E. coli, ya que se utilizan dos polimerasas diferentes una para sintetizar la hélice conductora y otra para producir la hélice retardada. La ADN polimerasa α sintetiza la hélice retardada mientras que la ADN polimerasa δ sintetiza la hélice conductora. En la siguiente tabla se resumen las polimerasas de mamíferos:
ENZIMAFUNCIÓN
ADN Pol αSíntesis Hélice retardada. Síntesis del cebador: 10 bases de ADN y 25 de ARN.
ADN Pol δSíntesis de la Hélice conductora.
ADN Pol εPolimerización de las Piezas de Okazaki.
ADN Pol βUnión de los fragmentos de Okazaki ( de aproximadamente 250 pb).
ADN Pol γSíntesis ADN mitocondrial.

REPLICACIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL: LAZOS D

La replicación del ADN mitocondrial en mamíferos se ajusta al modelo del Lazo de Desplazamiento o lazo D.  Las dos hélices del ADN mitocondrial se pueden diferenciar en base a su densidad, existiendo una hélice Ligera (L) y otra hélice pesad (H). En primer lugar, se inicia la replicación o síntesis de la nueva Hélice Ligera (L), sin que se comience la replicación de la nueva hélice pesada. El origen de replicación de la hélice ligera (L) es diferente al de la hélice pesada (H), de forma que existen dos orígenes de replicación diferentes para cada una. Además, una vez iniciada la replicación de la nueva hélice ligera (L), la síntesis es unidireccional, tienen lugar en una sola dirección y avanza desplazando a la otra hebra. Cuando se ha sintetizado, aproximadamente, 2/3 de la nueva hélice ligera, comienza la síntesis de la nueva hélice pesada (H), en una sola dirección opuesta a la de síntesis de la hélice ligera L. Por consiguiente, la síntesis de la nueva hélice L termina antes que la de la nueva hélice H. Como se puede ver, la replicación del ADN mitocondrial es diferente a la del cromosoma de E. coli, existen dos orígenes de replicación diferentes para cada hélice y la replicación es unidireccional.
Replicación ADN mitocondrialADN mitocondrial

OTRAS ENZIMAS QUE INTERVIENEN EN LA REPLICACIÓN: LIGASAS, GIRASAS, TOPOISOMERASAS, ETC.

Además de las ADN polimerasas I y III, de la ARN-Polimerasa o Primasa que sintetiza el cebador y de las Ligasas que unen las piezas de Okazaki, en la replicación del ADN intervienen otras enzimas. Algunas de estas enzimas son las siguientes:
  • Helicasas: son enzimas que rompen los puentes de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas de la doble hélice. Entre las helicasas de E. coli se encuentran las proteínas Dna B y Rep. La proteína Rep parece ayudar a desenrollar la doble hélice por delante de la polimerasa.
  • La proteína SSB: se une al ADN de hélice sencilla y lo estabiliza retrasando la regeneración de la doble hélice.
La acción de las Helicasas durante la replicación genera retorcimientos que deben ser eliminados. El ADN circular puede sufrir enrollamientos y retorcimientos, dichos superenrollamientos se generan y eliminan por enzimas denominadas Topoisomerasas.
  • Topoisomerasas: pueden producir o eliminar nudos o enlaces en una hélice. existen toposiomerasas de la clase I que cortan solamente una de las dos hélices y topoisomerasas de la clase II que cortan ambas cadenas. En E. coli, las enzimas Topi I i Topo III pertenecen a la clase I, mientras que la la Girasa es de la clase II. Cuando se separan las dos hélices durante el avance de la horquilla de replicación se producen superenrollamientos positivos en otras regiones que relajan la tensión. La Girasase necesita para eliminar los superenrollamientos positivos que se generan por delante de la horquilla de replicación.
 
Retorcimientos y enrollamientos del ADN circular
Superenrrolamiento en ADN doble hélice circular.

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