| Endonucleasa asociada a CRISPR Cas9 | |||
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Estructura cristalina de S. pyogenes Cas9 en complejo con sgRNA y su ADN objetivo a una resolución de 2.5 A ˚. [1]
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| Identificadores | |||
| Organismo | |||
| Símbolo | cas9 | ||
| Alt. simbolos | SpyCas9 | ||
| Entrez | 901176 | ||
| PDB | 4OO8 ( ECOD ) | ||
| RefSeq (ARNm) | NC_002737.2 | ||
| RefSeq (Prot) | NP_269215.1 | ||
| UniProt | Q99ZW2 | ||
| Otros datos | |||
| Numero de EC | 3.1.-.- | ||
| Cromosoma | Genómica: 0.85 - 0.86 Mb | ||
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Cas9 ( C RISPR como proteína sociada 9 ) es una proteínaque desempeña un papel vital en la defensa inmunológica de ciertas bacterias contra los virus de ADN y que se utiliza en gran medida en aplicaciones de ingeniería genética. Su función principal es cortar el ADN y, por lo tanto, puede alterar el genoma de una célula.
Más técnicamente, Cas9 es una enzima endonucleasa de ADN guiada por ARN asociada con el sistema de inmunidad adaptativa CRISPR ( Repeticiones Palindrómicas Cortas Interspacidas Clásicamente Interrumpidas ) en Streptococcus pyogenes [2] . S. pyogenes utiliza Cas9 para memorizar [3] y luego interrogar y escindir ADN extraño [4] , como el ADN bacteriófago invasor o el ADN plasmídico. Cas9 realiza esta interrogación al desenrollar el ADN extraño y verificar los sitios complementarios a la región espaciadora de 20 pares de bases del ARN guía. Si el sustrato de ADN es complementario al ARN guía, Cas9 escinde el ADN invasor. En este sentido, el mecanismo CRISPR-Cas9 tiene una serie de paralelos con el mecanismo de interferencia de ARN (RNAi) en los eucariotas.
Además de su función original en la inmunidad bacteriana, la proteína Cas9 se ha utilizado en gran medida como una herramienta de ingeniería del genoma para inducir roturas de doble hebra en el ADN dirigidas al sitio. Estas rupturas pueden conducir a la inactivación de genes o la introducción de genes heterólogos a través de la unión de extremos no homólogos y la recombinación homóloga, respectivamente, en muchos organismos modelo de laboratorio. Junto con las nucleasas de dedos de zinc y las proteínas TALEN , Cas9 se está convirtiendo en una herramienta importante en el campo de la edición del genoma.
Cas9 ha ganado fuerza en los últimos años porque puede dividir casi cualquier secuencia complementaria al ARN guía. [4] Debido a que la especificidad objetivo de Cas9 se deriva de la guía ARN: complementariedad del ADN y no modificaciones a la proteína en sí (como TALEN y dedos de zinc), diseñar Cas9 para apuntar al nuevo ADN es sencillo. [5] Las versiones de Cas9 que se unen pero no escinden el ADN análogo se pueden usar para localizar el activador transcripcional o los represores en secuencias de ADN específicas para controlar la activación y la represión transcripcional. [6] [7]Mientras nativo Cas9 requiere un ARN guía compuesto de dos ARNs dispares que se asocian para hacer que la guía - el ARN CRISPR (crRNA), y la crRNA activadora trans ( tracrRNA ) [2] . La segmentación de Cas9 se ha simplificado a través de la ingeniería de un ARN de guía única quimérico (chiRNA). Los científicos han sugerido que las unidades de genes basadas en Cas9 pueden ser capaces de editar los genomas de poblaciones completas de organismos. [8] En 2015, Cas9 se utilizó para modificar el genoma de embriones humanos por primera vez.
CRISPR mediada por inmunidad [ editar ]
Para sobrevivir en una variedad de hábitats desafiantes e inhóspitos que están llenos de bacteriófagos , bacterias y arqueas, se han desarrollado métodos para evadir y defenderse de los virus predadores . Esto incluye el sistema CRISPR de inmunidad adaptativa. En la práctica, CRISPR actúa como una enzima de restricción autoprogramable. Los loci CRISPR se componen de repeticiones palindrómicas cortas que se producen a intervalos regulares compuestas de repeticiones CRISPR alternativas y espaciadores CRISPR variables entre 24 y 48 nucleótidos de longitud. Estos loci CRISPR suelen ir acompañados de genes adyacentes asociados a CRISPR (cas). En 2005, tres grupos separados descubrieron que las regiones espaciadoras eran homólogas a los elementos de ADN extraños, incluidos los plásmidos.y virus. Estos informes proporcionaron la primera evidencia biológica de que los CRISPR podrían funcionar como un sistema inmunológico.
Cas9 se ha utilizado a menudo como una herramienta de edición del genoma. Cas9 se ha utilizado en desarrollos recientes para evitar que los virus manipulen el ADN de los hosts. Dado que el CRISPR-Cas9 se desarrolló a partir de sistemas de genoma bacteriano, se puede usar para atacar el material genético en los virus. El uso de la enzima Cas9 puede ser una solución para muchas infecciones virales. Cas9 posee la capacidad de atacar virus específicos al atacar cadenas específicas de la información genética viral. Más específicamente, la enzima Cas9 se dirige a ciertas secciones del genoma viral que impide que el virus lleve a cabo su función normal. [10]Cas9 también se ha utilizado para interrumpir la cadena perjudicial de ADN y ARN que causa enfermedades y cadenas mutadas de ADN. Cas9 ya se ha mostrado prometedor para interrumpir los efectos del VIH-1. Se ha demostrado que Cas9 suprime la expresión de las repeticiones terminales largas en el VIH-1. Cuando se introdujo en el genoma del VIH-1, Cas9 ha demostrado la capacidad de mutar las hebras del VIH-1. [11] [12] Cas9 también se ha utilizado en el tratamiento de la hepatitis b mediante la selección de los extremos de ciertas repeticiones terminales largas en el genoma viral de la hepatitis b. [13] Además, Cas9 ya se ha utilizado en ensayos en humanos para el tratamiento de la fibrosis quística y las mutaciones oncogénicas en células madre pluripotentes humanas. [14] Cas9 se ha usado para reparar las mutaciones que causan cataratas en ratones.
Los sistemas CRISPR-Cas se dividen en tres tipos principales (tipo I, tipo II y tipo III) y doce subtipos, que se basan en su contenido genético y diferencias estructurales. Sin embargo, las características que definen el núcleo de todos los sistemas CRISPR-Cas son los genes cas y sus proteínas: cas1 y cas2 son universales en todos los tipos y subtipos, mientras que cas3, cas9 y cas10 son genes característicos de tipo I, tipo II y tipo III , respectivamente.
CRISPR-cas etapas de defensa [ editar ]
Adaptación [ editar ]
La adaptación implica el reconocimiento y la integración de espaciadores entre dos repeticiones adyacentes en el locus CRISPR. El "Protospacer" se refiere a la secuencia en el genoma viral que corresponde al espaciador. Un tramo corto de nucleótidos conservados existe proximal al protospacer, que se llama el motivo adyacente protospacer (PAM). El PAM es un motivo de reconocimiento que se utiliza para adquirir el fragmento de ADN. [15]En el tipo II, Cas9 reconoce el PAM durante la adaptación para garantizar la adquisición de espaciadores funcionales. [3]
Procesamiento CRISPR [ editar ]
La expresión CRISPR incluye la transcripción de un transcrito primario llamado ARN CRISPR (pre-ARNrc), que se transcribe desde el locus CRISPR por la ARN polimerasa. Las endorribonucleasas específicas luego escinden los pre-ARNrc en pequeños ARN CRISPR (ARNrc). [dieciséis]
Interferencia / inmunidad [ editar ]
La interferencia involucra a los ARNcr dentro de un complejo multiproteínico llamado CASCADE, que puede reconocer y específicamente emparejar con regiones de inserción de ADN extraño complementario. El complejo de ácido nucleico extraño crRNA se escinde, sin embargo, si hay desajustes entre el espaciador y el ADN diana, o si hay mutaciones en la PAM, no se iniciará la escisión. En este último escenario, el ADN extraño no está dirigido al ataque de la célula, por lo que la replicación del virus continúa y el huésped no es inmune a la infección viral. La etapa de interferencia puede ser distinta desde el punto de vista mecánico y temporal de la adquisición y expresión de CRISPR, pero para una función completa como sistema de defensa, las tres fases deben ser funcionales. [17]
Etapa 1: Integración del espaciador CRISPR. Los protoespaciales y los motivos asociados al protoespacio (que se muestran en rojo) se adquieren en el extremo "líder" de una matriz CRISPR en el ADN del huésped. La matriz CRISPR está compuesta por secuencias espaciadoras (mostradas en cajas de colores) flanqueadas por repeticiones (diamantes negros). Este proceso requiere Cas1 y Cas2 (y Cas9 en el tipo II [3] ), que están codificados en el locus cas, que generalmente se encuentran cerca de la matriz CRISPR.
Etapa 2: Expresión CRISPR. El pre-crRNA se transcribe comenzando en la región líder por la ARN polimerasa del huésped y luego se escinde por las proteínas Cas en crRNA más pequeños que contienen un espaciador único y una repetición parcial (se muestra como una estructura de horquilla con espaciadores de color).
Etapa 3: Interferencia CRISPR. CrRNA con un espaciador que tiene una fuerte complementariedad con el ADN extraño entrante comienza un evento de escisión (representado con tijeras), que requiere proteínas Cas. La escisión del ADN interfiere con la replicación viral y proporciona inmunidad al huésped. La etapa de interferencia puede ser funcional y temporalmente distinta de la adquisición y expresión de CRISPR (representada por una línea blanca que divide la celda).
Desactivación de la transcripción usando dCas9 [ editar ]
dCas9, también conocido como Cas9 deficiente en endonucleasas, puede utilizarse para editar la expresión génica cuando se aplica al sitio de unión de la transcripción de la sección deseada de un gen. La función óptima de dCas9 se atribuye a su modo de acción. La expresión génica se inhibe cuando los nucleótidos ya no se agregan a la cadena de ARN y, por lo tanto, terminan la elongación de esa cadena y, como resultado, afectan el proceso de transcripción. Este proceso ocurre cuando dCas9 se produce en masa, por lo que es capaz de afectar a la mayor cantidad de genes en un momento dado a través de una molécula de ARN guía específica de secuencia. Dado que dCas9 parece regular a la baja la expresión génica, esta acción se amplifica aún más cuando se usa junto con los dominios represores de la cromatina modificadora. [18]La proteína dCas9 tiene otras funciones fuera de la regulación de la expresión génica. Se puede agregar un promotor a la proteína dCas9 que les permite trabajar entre sí para que sean eficientes al comenzar o detener la transcripción en diferentes secuencias a lo largo de una cadena de ADN. Estas dos proteínas son específicas en donde actúan sobre un gen. Esto prevalece en ciertos tipos de procariotas cuando un promotor y dCas9 se alinean entre sí para impedir la capacidad de elongación del polímero o nucleótidos que se unen para formar una pieza de ADN transcrita. Sin el promotor, la proteína dCas9 no tiene el mismo efecto por sí misma o con un cuerpo genético. [19]
Al examinar más a fondo los efectos de la represión de la transcripción, la H3K27, un componente de aminoácido de una histona, se metila a través de la interacción de dCas9 y un péptido llamado FOG1. Esencialmente, esta interacción causa la represión del gen en la sección terminal C + N del complejo de aminoácidos en la unión específica del gen, y como resultado, termina la transcripción. [20]
dCas9 también demuestra ser eficiente cuando se trata de alterar ciertas proteínas que pueden crear enfermedades. Cuando el dCas9 se adhiere a una forma de ARN llamada guía-ARN, evita la proliferación de codones repetidos y secuencias de ADN que podrían ser perjudiciales para el genoma de un organismo. Esencialmente, cuando se producen múltiples codones de repetición, provoca una respuesta, o recluta una gran cantidad de dCas9 para combatir la sobreproducción de esos codones y da como resultado el cierre de la transcripción. dCas9 funciona de forma sinérgica con el gRNA y afecta directamente a la ADN polimerasa II de la transcripción continua.
Una explicación adicional de cómo funciona la proteína dCas9 se puede encontrar en su utilización de los genomas de las plantas mediante la regulación de la producción de genes en las plantas, ya sea para aumentar o disminuir ciertas características. El sistema CRISPR-CAS9 tiene la capacidad de regular o disminuir los genes. Las proteínas dCas9 son un componente del sistema CRISPR-CAS9 y estas proteínas pueden reprimir ciertas áreas de un gen vegetal. Esto sucede cuando dCAS9 se une a dominios represores, y en el caso de las plantas, se produce la desactivación de un gen regulador como AtCSTF64. [21]
Las bacterias son otro foco del uso de las proteínas dCas9 también. Dado que los eucariotas tienen un ADN y un genoma más grandes; Las bacterias mucho más pequeñas son fáciles de manipular. Como resultado, los eucariotas utilizan dCas9 para inhibir que la ARN polimerasa continúe el proceso de transcripción de material genético. [22]
Estudios estructurales de Cas9 [ editar ]
Estructura cristalina [ editar ]
Cas9 presenta una arquitectura bilobulada con el ARN guía ubicado entre el lóbulo alfa helicoidal (azul) y el lóbulo de nucleasa (cian, naranja y gris). Estos dos lóbulos están conectados a través de una única hélice puente. Hay dos dominios de nucleasa ubicados en el lóbulo de nucleasa de múltiples dominios, el RuvC (gris) que corta la cadena de ADN no objetivo y el dominio de nucleasa HNH (cian) que corta la cadena de ADN objetivo. El dominio RuvC está codificado por sitios secuencialmente dispares que interactúan en la estructura terciaria para formar el dominio de escisión RuvC (Ver la figura de la derecha).
Una característica clave del ADN objetivo es que debe contener un protospacer motivo adyacente (PAM) que consiste en la secuencia de tres nucleótidos - NGG. Este PAM es reconocido por el dominio de interacción PAM (dominio PI, naranja) ubicado cerca del extremo C-terminal de Cas9. Cas9 experimenta distintos cambios conformacionales entre la apo, el ARN guía unido y el ARN guía: estados unidos ADN.
Cas9 reconoce el tallo-bucle arquitectura inherente en el locus CRISPR, que media en la maduración de crRNA-tracrRNA ribonucleoproteincomplejo. [24] Cas9 en complejo con ARN CRISPR (ARNrc) y ARNr-trans activador (ARNracr) reconoce y degrada el dsADN objetivo. [25] En la estructura de cocristal que se muestra aquí, el complejo crRNA-tracrRNA se reemplaza por un RNA quimérico de guía única (sgRNA, en rojo) que ha demostrado tener la misma función que el complejo de RNA natural. [4]La base de sgRNA emparejado con el ssDNA objetivo está anclado por Cas9 como una arquitectura en forma de T. Esta estructura cristalina de la enzima Cas9 unida al ADN revela distintos cambios conformacionales en el lóbulo alfa-helicoidal con respecto al lóbulo de nucleasa, así como la ubicación del dominio HNH. La proteína consiste en un lóbulo de reconocimiento (REC) y un lóbulo de nucleasa (NUC). Se debe tener en cuenta que todas las regiones, excepto la HNH, forman interacciones estrechas entre sí y el complejo sgRNA-ssDNA, mientras que el dominio HNH forma pocos contactos con el resto de la proteína. En otra conformación del complejo Cas9 observado en el cristal, el dominio HNH no es visible. Estas estructuras sugieren la flexibilidad conformacional del dominio HNH.
Hasta la fecha, al menos tres estructuras de cristal han sido estudiadas y publicadas. Uno que representa una conformación de Cas9 en el estado de apo, [23] y dos que representan a Cas9 en el estado unido al ADN. [26] [1]
Las interacciones entre sgRNA y en cas9 [ editar ]
En el complejo sgRNA-Cas9, basado en la estructura cristalina, los dominios REC1, BH y PI tienen contactos importantes con el esqueleto o las bases tanto en la región de repetición como en la región espaciadora. [1] [26] Se han probado varios mutantes Cas9 que incluyen la eliminación de dominios REC1 o REC2 y mutaciones de residuos en BH. Los mutantes relacionados con REC1 y BH muestran una actividad menor o nula en comparación con el tipo salvaje, lo que indica que estos dos dominios son cruciales para el reconocimiento de sgRNA en la secuencia de repetición y la estabilización de todo el complejo. Aunque las interacciones entre la secuencia espaciadora y Cas9, así como el dominio PI y la región de repetición necesitan estudios adicionales, el cocristal demuestra una clara interfaz entre Cas9 y sgRNA.
Digestión objetivo [ editar ]
El análisis de secuencia previo y los estudios bioquímicos han sugerido que Cas9 contiene los dominios homólogos de endonucleasa RNasa H y HNH que son responsables de las escisiones de dos cadenas de ADN diana, respectivamente. Estos resultados son finalmente probados en la estructura. Aunque la similitud de secuencia es baja, la secuencia similar a RNasa H tiene un pliegue RuvC (un miembro de la familia RNase H) y la región HNH se pliega como T4 Endo VII (un miembro de la familia de endonucleasas HNH). Trabajos previos en Cas9 han demostrado que el dominio HNH es responsable de la escisión de la secuencia complementaria del ADN objetivo y RuvC es responsable de la secuencia no complementaria. [27]
Problemas que las bacterias plantean para la edición cas-9 [ editar ]
La mayoría de los archea y las bacterias se niegan obstinadamente a permitir que un cas-9 edite su genoma. Esto se debe a que pueden adjuntar ADN extraño, que no les afecta, en su genoma. Otra forma en que estas celdas desafían a cas-9 es mediante un proceso de sistema de modificación de restricción (RM). Cuando un bacteriófago ingresa a una célula bacteriana o arqueada, el sistema de RM se enfoca en él. El sistema de RM luego corta los ADN de los bacteriófagos en pedazos separados por enzimas de restricción y utiliza las endonucleasas para destruir aún más las cadenas de ADN. Esto plantea un problema para la edición de cas-9 porque el sistema RM también se enfoca en los genes extraños agregados por el proceso de cas-9. [28]
Aplicaciones de Cas9 a la sintonización de transcripción [ editar ]
Interferencia de la transcripción por dCas9 [ editar ]
Debido a la capacidad única de Cas9 para unirse esencialmente a cualquier secuencia de complemento en cualquier genoma , los investigadores querían usar esta enzima para reprimir la transcripción de varios locigenómicos . Para lograr esto, los dos residuos catalíticos cruciales del dominio RuvC y HNH se pueden mutar a alanina aboliendo toda la actividad endonucleasa de Cas9. La proteína resultante acuñada 'muerta' Cas9 o 'dCas9' para abreviar, todavía puede unirse fuertemente a dsDNA. Esta variante de Cas9 catalíticamente inactiva se ha utilizado para estudios mecanísticos en la unión interrogativa de ADN de Cas9 y como un complejo de ARN-proteína de unión de ADN programable general.
La interacción de dCas9 con dsDNA diana es tan estrecha que la proteína desnaturalizante de urea de alta molaridad no puede disociar completamente el complejo dCas9 ARN-proteína de dsDNA diana. [29] dCas9 ha sido dirigido con ARN de guía única diseñados para sitios de inicio de transcripción de cualquier loci donde dCas9 puede competir con la ARN polimerasa en los promotores para detener la transcripción. [30] Además, dCas9 puede dirigirse a la región de codificación de los loci, de modo que la inhibición de la ARN polimerasa se produce durante la fase de elongación de la transcripción. [30] En eucariotas, el silenciamiento de la expresión génica se puede extender al dirigir dCas9 a secuencias potenciadoras, donde dCas9 puede bloquear el ensamblaje de factores de transcripción que conducen al silenciamiento de la expresión génica específica.[7]Además, los ARN guía proporcionados a dCas9 pueden diseñarse para incluir desajustes específicos en su secuencia cognada complementaria que debilitarán cuantitativamente la interacción de dCas9 para su secuencia cognada programada que permite a un investigador ajustar el alcance del silenciamiento génico aplicado a un gen de interés. [30] Esta tecnología es similar en principio al ARNi, de modo que la expresión génica se está modulando a nivel del ARN. Sin embargo, el enfoque de dCas9 ha ganado mucha tracción ya que existen menos efectos fuera del objetivo y, en general, efectos de silenciamiento más grandes y más reproducibles mediante el uso de dCas9 en comparación con las pantallas de RNAi. [31]Además, debido a que el enfoque de dCas9 para el silenciamiento de genes se puede controlar cuantitativamente, un investigador ahora puede controlar con precisión la medida en que se reprime un gen de interés, lo que permite responder a más preguntas sobre la regulación de genes y la estequiometría de los genes .
Más allá de la unión directa de dCas9 a las posiciones de loci transcripcionalmente sensibles, dCas9 puede fusionarse con una variedad de dominios proteicos moduladores para llevar a cabo una gran cantidad de funciones. Recientemente, dCas9 se ha fusionado con las proteínas de remodelación de la cromatina (HDACs / HAT) para reorganizar la estructura de la cromatina alrededor de varios loci. [30] Esto es importante para atacar varios genes eucariotas de interés, ya que las estructuras de heterocromatina dificultan la unión de Cas9. Además, debido a que Cas9 puede reaccionar a la heterocromatina , se teoriza que esta enzima se puede aplicar más para estudiar la estructura de la cromatina de varios loci. [30]Además, dCas9 se ha empleado en pantallas genómicas amplias de represión de genes. Al emplear grandes bibliotecas de ARN de guía capaces de dirigirse a miles de genes, se han llevado a cabo pruebas genéticas de todo el genoma que utilizan dCas9. [32]
Otro método para silenciar la transcripción con Cas9 es dividir directamente los productos de ARNm con la enzima Cas9 catalíticamente activa. [33] Este enfoque es posible mediante la hibridación de ssDNA con una secuencia de complemento de PAM a ssRNA permitiendo un sitio PAM de dsDNA-RNA para la unión de Cas9. Esta tecnología pone a disposición la capacidad de aislar transcritos de ARN endógeno en células sin la necesidad de inducir modificaciones químicas al ARN o métodos de marcado de ARN.
Activación de la transcripción por las proteínas de fusión dCas9 [ editar ]
A diferencia del silenciamiento de genes, dCas9 también puede usarse para activar genes cuando se fusiona con factores activadores de la transcripción. [30] Estos factores incluyen subunidades de ARN polimerasa II bacteriana y factores de transcripción tradicionales en eucariotas. Recientemente, también se han logrado pantallas de activación de transcripción en todo el genoma utilizando fusiones dCas9 llamadas 'CRISPRa' para la activación. [32]
Posibles soluciones a la edición de bacterias cas-9 [ editar ]
Estudios recientes han demostrado que con algunas modificaciones menores en la proteína cas-9 es posible omitir el "Sistema de modificación de restricción". El proceso que logra esto se llama "Photospacing", que significa que el sistema cas-9 copiará una sección de ADN del huésped y lo insertará como un gen espaciador en su propio genoma. [34] Aunque no entendemos completamente por qué funcionan los "espaciadores de fotos", sí entendemos lo que hacen. Cuando un procariota "percibe" una parte de su propia codificación genética dentro de la entidad extraña, es menos probable que destruya la inserción de cas-9. Esto se conoce como el comienzo de la inmunidad cas-9.
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