Se ha conseguido gracias a las enzimas de restricción y a la posibilidad de obtener numerosas copias de un ácido nucléico por clonación.
Se pueden conseguir muchos fragmentos , de diversos tamaños y lo que se trata es de recomponer la molécula original como si se tratase de un puzzle.
Así se han secuenciado genes, desde virus hasta el genoma humano.
El método más usado para la secuenciación es el conocido como técnica de terminación de cadena de Sanger, la cual se ha perfeccionado conociéndose actualmente como latécnica del didesoxi.
Se denomina así por ser necesario los didesoxirribonucleótidos (figura 1), que han perdido su grupo alcohol OH del carbono 3'. En la figura 2 vemos un nucleótido normal con el grupo alcohol en el carbono 3'.
Como los nucleótidos se unen por este grupo OH del carbono 3', hay que pensar que si nos encontramos con un didesoxinucleótido será imposible que se una otro nucleótido y la cadena terminará aquí. Figura 3 (Es necesario tener esto presente para comprender la técnica del didesoxi)
Como la técnica se basa en la síntesis de ADN, para hacer la reacción de secuenciación se necesita:
- Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a secuenciar.
- Como "cebador" para iniciar la síntesis, se necesita un corto oligonucleótido complementario del extremo de la cadena.
- desoxinucleótidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP.
- didesoxinucleótidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciación.
Figura 4
En el caso expuesto deducimos tres fragmentos con 5, 10 y 14 nucleótidos (sin contar el cebador) en cuyos extremos tenemos ADENINA, nos permite interpretar que en el ADN original, en esas situtaciones tendremos TIMINA.
Deben prepararse cuatro reacciones de secuenciación, cada una con un didesoxi distinto . Los fragmentos resultantes se separan por tamaño mediante electroforesis, se autorradiografían, y la sucesión de bandas de cada una de las cuatro reacciones, comparándolas entre sí,dan la secuencia del ADN. (Figura 5)
Figura 5
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