AMIGOS PARA SIEMPRE: bioquímica y biología molecular

En los años 70´s, los avances en múltiples disciplinas como la genética, bioquímica, Biología celular y fisicoquímica, se hicieron patentes en los estudios de la Biología y por primera vez fue posible aislar un gen. Dando origen a las técnicas de clonación.

Clonar un segmento de ADN es un proceso que necesita de 5 pasos:

1. cortar al ADN en posiciones precisas con endonucleasas de restricción que actúan como tijeras moleculares.

2.- Unir los fragmentos obtenidos, proceso que hace naturalmente la ADN ligasa.

3.- seleccionar una pequeña molécula de ADN capaz de autoreplicarse. Esto se logra utilizando plásmidos o ADNs virales (vectores de clonación). Las moléculas de ADN que están compuestas de material genético de diferentes fuentes se denominan ADNs recombinantes.

4.- insertar los vectores de clonación a células específicas que contienen toda la maquinaria genética para la expresión de la información contenida en el vector.

5.- seleccionar o identificar a las células que contienen al ADN recombinante.

Vector de cromosoma

clonación eucarionte

(plasmido)

ruptura con ruptura con

endonucleasas endonucleasas

de restricción de restricción

ADN ligasa

transformación

Vector

Recombinante (infección viral)

Figura: representación de la clonación del ADN

La ingeniería genética ha permitido tratar a los pacientes con diabetes, mediante la utilización del ADN recombinante, este mecanismo permite que la insulina humana pueda producirse en otros organismos, comúnmente se emplean bacterias (siendo la más usada Escherichia coli ) o levaduras, usando un plásmido o vector.

Mediante control de las condiciones de crecimiento de estos microorganismos, los mismos pueden reproducirse en grandes cantidades y producir abundante cantidad de “insulina recombinante” a un precio relativamente bajo y así poder utilizarla para el tratamiento de pacientes.

De esta manera las insulinas de origen animal prácticamente han desaparecido del mercado dando lugar a las insulinas recombinantes, constituyendo actualmente el 93 % de la demanda mundial.

Inserción de los fragmentos de ADN. Esta inserción se realiza en vectores de clonado, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras.
Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras.
Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus. de introducirlos en las células hospedadoras.

Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propioorigen de replicación.

Figura a

En esta secuencia de dibujos se puede ver como se realiza la inserción de un gen en un plásmido.
En la figura a tenemos un gen(color rojo) que interesa insertar en un plásmido (color turquesa)

Figura b

En la figura b, vemos como una enzima de restricción ha cortado el gen y el plásmido, quedando unos bordes cohesivos o pegajosos.

Figura c

La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonación, se realiza por medio de otras enzimas, denominadas ADN-ligasas, que unen ambos trozos de ADN. El resultado es una molécula de ADN recombinante, ya que contiene fragmentos de ADN de distinta procedencia.

Bacteriófagos. El proceso es similar, se trata de insertar el gen deseado en un fragmento de ADN vírico (figura d) Posteriormente se ensamblarán las distintas partes del virus (figura e). Así quedará el virus completo(figura f). En el siguiente paso se insertará este ADN por el proceso de la TRANSDUCCIÓN.

figura d

figura e

figura f

Aquí tienes otro pequeño juego para que construyas tu virus. Tienes dos moléculas de ADN

Cósmidos . Son plasmidos que contienen el fragmento de ADN deseado que posee un borde cohesivo procedente del genoma del fago lambda (extremo cos)y se empaqueta en el interior de un fago. Se construye el cssmido uniendo los tres elementos ginicos, y el resultado final es poder introducir en la cilula receptora fragmentos largos de ADN.

Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia.

Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador.
Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota.

Métodos de introducción del vector. El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve el gen concreto.
Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente.
En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos:

Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos.
La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma. En las siguiente animación puede verse el proceso.
Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus.
En la siguiente figura puede verse el proceso en tres etapas. El número 1 corresponde al virus aproximándose a una bacteria. Se puede observar como lleva un genoma ya con el gen que interesa clonar. El siguiente momento 2, corresponde al contacto entre el virus y la pared bacteriana, en cuya zona de contacto se produce un poro por donde como vemos en la etapa 3, el virus inyecta su ADN al interior de la célula bacteriana.