bioquímica y biología molecular

La hibridación del ADN es el proceso más común para detectar un gen particular o un segmento de un ácido nucleico. Existen muchas variaciones del método básico, el que mas se utiliza es el uso de fragmentos de ADN o ARN marcados radioactivamente conocidos como sondas. De hecho esta metodología es la base de la amplificación controlada de ADN conocida como PCR por sus siglas en inglés Polimerase Chain Reaction o reacción en cadena de la polimerasa que se utiliza para la clonación y secuenciación de ADN.

DESARROLLO DE UN BIOSENSOR ELECTROQUÍMICO PARA LA DETECCIÓN DE MUTACIONES DE ADN

El desarrollo de estrategias para la detección de secuencias específicas de ADN tiene un gran interés para el diagnóstico de enfermedades causadas por alteraciones genéticas. El diagnóstico molecular basado en el análisis de secuencias cortas de ADN ofrece métodos sensibles y selectivos para la detección temprana de estas enfermedades. La hibridación del ADN es el proceso más común para analizar y detectar un gen particular o un segmento de un ácido nucleico. Entre los métodos basados en hibridación se encuentran aquellos basados en resonancias de plasmón superficial, fluorescencia, gravimetría o marcaje con radioisótopos, y en los últimos años ha tenido un gran auge el desarrollo de los biosensores de ADN. De entre estos biosensores, los electroquímicos se presentan como métodos muy sensibles, que permiten también desarrollar dispositivos portátiles, simples y económicos para la realización de diagnósticos clínicos.

Como el ADN tiene propiedades electroactivas, se han desarrollado sistemas electroquímicos de detección sacando partido de esta característica para detectar directamente el ADN hibridado. De manera general, el ADN se inmoviliza sobre un electrodo, y la diferencia de corriente eléctrica medida antes y después de la hibridación está relacionada con la cantidad de ADN fijado sobre el electrodo. Sin embargo, esta detección directa sin marcador no es muy selectiva. Con la finalidad de mejorar la sensibilidad, se han desarrollado diferentes aproximaciones que emplean un marcador electroactivo. Existen distintos compuestos electroactivos que pueden asociarse con el ADN y así ser detectados por oxidación-reducción aplicando un potencial al electrodo. Como estos marcadores electroactivos poseen mejores propiedades de oxidorreducción que el ADN, su utilización permite obtener una relación señal/ruido superior y una mejor sensibilidad. La interacción de estos compuestos electroactivos con el ADN puede ser electrostática (poco específica), colocándose en los surcos de la doble hélice (unión débil) o mediante un proceso de intercalación (unión mas específica y fuerte).

En este proyecto se ha desarrollado una nueva molécula como indicador de hibridación en biosensores electroquímicos, preparada “in situ”, y formada por la unión entre el complejo pentamin rutenio (Ru) y el ligando 3-(2-fenantren-9-ilvinil) piridina (L). Se le ha llamado complejo de pentamin rutenio [3-(2-fenantren-9-il-vinil)piridina] “RuL”.

Este complejo tiene una doble función. Por un lado, la estructura planar de los grupos aromáticos del ligando 3-(2-fenantren-9-il-vinil) piridina (L) confiere un carácter intercalativo al complejo y le permite unirse a ácidos nucleicos de doble cadena de una manera muy específica. Por otro lado, el centro redox del metal (Ru) sirve de indicador electroquímico para detectar el evento de hibridación.

Los biosensores electroquímicos de ADN desarrollados en este proyecto están constituidos por una sonda de ADN de cadena sencilla, derivatizada en su extremo 5` con un alquiltiol que permite la quimiadsorción de la sonda al electrodo. Así se obtiene una monocapa de moléculas de ADN organizada sobre la superficie de dicho electrodo. En las condiciones experimentales adecuadas, esta sonda reaccionará específicamente con hebras de ADN que presenten un alto grado de complementariedad con ella. Posteriormente se realiza la acumulación del indicador electroquímico RuL mediante la aplicación de una serie de barridos cíclicos de potencial. El RuL se intercala únicamente donde se ha producido hibridación, a razón de aproximadamente una molécula de RuL cada cuatro pares de bases. El último paso es transformar el proceso de hibridación en una señal electroquímica, aplicando sobre el electrodo un potencial eléctrico que produce la oxidación del centro redox del rutenio. Esta oxidación da lugar a una corriente eléctrica que se mide mediante Voltamperimetría Diferencial de Pulsos (DPV). En las mediciones se obtienen gráficas como las siguientes:

Figura 1. Voltamogramas diferenciales de pulsos (DPVs) de RuL después de la hibridación con una secuencia totalmente complementaria (WT), después de la hibridación con una secuencia desapareada en una única base (MUT), y antes de la hibridación (WT-SH). La señal obtenida en WT-SH es semejante a la obtenida después de la hibridación con una secuencia no complementaria.

El soporte físico de los biosensores de este proyecto es una celda electroquímica en la que se integran tres electrodos: un electrodo de trabajo de oro (WE) donde está fijada la sonda de ADN, un contraelectrodo (CE) de platino, y un electrodo de referencia (RE) de plata.

La alta sensibilidad y especificidad conseguidas con este método, gracias al empleo del complejo RuL como indicador de la hibridación, permiten la detección de una secuencia determinada de ADN y su cuantificación. Así mismo, permite la detección de una base desapareada en una secuencia de ADN de doble hélice, así como la posición de dicho desapareamiento dentro de la secuencia. Todo esto confiere a este biosensor electroquímico un gran potencial de aplicación en el diagnóstico clínico.