Epidemiología Molecular de Enfermedades Infecciosas

HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA

Histoquímica es el estudio químico de los tejidos independientemente del método de análisis empleado. En la práctica se emplea la palabra para designar el método junto con el auxilio de los microscopios ópticos (MO) y electrónico (ME).

Esta técnica permite la identificación y localización de compuestos o radicales químicos en las células y tejidos. Esto se consigue provocando reacciones que dan productos insolubles que son coloreados o electrodensos y visibles por el MO y el ME .

A. PRINCIPIOS BÁSICOS.

1. QUE LOS COMPUESTOS QUE DEBEN SER ANALIZADOS NO SEAN DIFUSIBLES.

Este problema se resuelve insolubilizando los compuestos que van a ser estudiados por medio de la fijación del tejido.

– Se recomienda el uso de fijadores con alcohol para el estudio de sustancias hidrosolubles como el glucógeno.

– Hay que evitar los fijadores ácidos en las técnicas de visualización del fosfato cálcico.

Los fijadores más utilizados son:

– Formaldehído para el MO .

– Glutaraldehído para el ME.

2. EL PRODUCTO DE LA REACCIÓN DEBE SER INSOLUBLE para evitar la difusión .

3 .EL MÉTODO UTILIZADO DEBE SER ESPECÍFICO PARA LA SUSTANCIA O GRUPO QUÍMICO QUE SE ESTA ANALIZANDO. En algunas reacciones la intensidad del color producido es proporcional a la concentración de la sustancia analizada.En este caso se puede medir dicha sustancia con un histofotómetro.

B. PRINCIPALES SUSTANCIAS DE INTERÉS BIOLÓGICO DEMOSTRABLE HISTOQUÍMICAMENTE.

1. IONES

IÓN	DETERMINACIÓN
HIERRO	– EL ión férrico se demuestra por la reacción con la mezcla de FERRO- CIANURO POTÁSICO Y ÁCIDO CLORHÍDRICO que forma un precipitado azul oscuro de ferrocianuro férrico. – Esta reacción se usa para localizar los macrófagos del SRE y diagnosticar enfermedades en las cuales hay depósitos de hierro en los tejidos .
FOSFATO	Reaccionan con NITRATO DE PLATA y se forma fosfato de plata que es reducido por hidroquinona y forma un precipitado negro. Esta reacción se usa para el estudio del hueso.

2. LÍPIDOS.

Se usan colorantes que se disuelven en las grasas como el SUDAN IV y el SUDAN NEGRO.Los tejidos se sumergen en soluciones alcohólicas saturadas de colorantes muy liposolubles y debilmente solubles en alcohol. Se usa para el diagnostico de enfermedades metabólicas que producen depósitos intracelulares.

3. ÁCIDOS NUCLÉICOS.

ÁCIDO NUCLÉICO	DETERMINACIÓN
DNA	Se usa la reacción de FEULGEN que consiste : – Hidrólisis del DNA con ácido clorhídrico para extraer las bases púricas y dejar en libertad los grupos aldehídicos del azucar. – El reactivo de SCHIFF (fuchsina básica con anhídrido sulfuroso) reacciona con el aldehído y forma un precipitado rojo. Esta reacción presenta proporcionalidad entre la intensidad del color producido y el contenido en DNA del núcleo.
RNA	Tiene gran afinidad por los colorantes básicos (basofília) lo que hace que se tiña intensamente con el AZUL DE TOLUIDINA o de METILENO.

4. PROTEÍNAS.

Su identificación se basa en métodos de detección de aminoácidos.

– Reacción de aminobenceno.

– Reacción de Sakaguchi que detecta la arginina de las proteínas básicas como las histonas y protaminas.

5. POLISACÁRIDOS.

Se encuentran unidos a proteínas o en forma libre. En el caso de ser un polímero, antes hay que tratar la muestra con un enzima glucogenolítico para que libere los azucares.

La reacción más usada es la del PAS (ácido periódico-schiff). El ácido oxida a los azucares en posición 1-2 y deja grupos aldehídos libres que reaccionan con el reactivo de SCHIFF dando un compuesto insoluble y coloreado. De este modo se demuestra la presencia de:

– Glucógeno en el hígado y músculo.

– Depósito intracelular de glucógeno en enfermedades congénitas.

– Glucosaminoglicano o mucopolisacárido que forman parte de los proteoglicanos.

– Glucoproteínas.

Los azucares ácidos también reaccionan con el colorante AZUL DE ALCIAN.

6. CATECOLAMINAS. El formoaldehído reacciona con las catecolaminas produciendo compuestos fluorescentes.

7. ENZIMAS. Su localización se basa en la producción de un precipitado fuertemente coloreado o electrodenso en el sitio de actividad enzimática.

ENZIMA	DETERMINACIÓN
FOSFATASA ÁCIDA	Se usa el método de GOMORI que consiste en incubar cortes de tejidos en una solución que contengan GLICEROL FOSFATO SÓDICO y NITRATO DE PLOMO a pH 5 . La enzima libera el fosfato que reacciona con el plomo y da un precipitado insoluble.Después se añade sulfito de amonio que da color negro y electro denso al precipitado. Se usa para localizar lisosomas.
DESHIDROGENASAS	Se usan cortes no fijados junto con un compuesto químico soluble y debilmente coloreado del tipo TETRAZOL.El tetrazol es reducido y forma un precipitado coloreado llamado FORMAZAN. Se usa para detectar mitocondrias.
PEROXIDASA	Promueve la reducción de ciertos sustratos, transfiriendo iones hidrógenos desde el peróxido de hidrógeno al sustrato que se reduce. Como sustratos se usa el peróxido de hidrógeno y el tetraclorato 3,3-diamino-bencidina que cuando se reduce forma un compuesto coloreado, insoluble y electrodenso.

B. FLUORESCENCIA.

Sustancia fluorescente es la que absorbe luz de una longitud de onda determinada y emite luz en otra longitud de onda mayor. En microscopía se suele usar la excitación con luz ultravioleta.

1. COMPUESTOS FLUORESCENTES.

– Compuestos naturales constituyentes de las células: vitamina A, riboflavina(B2) y las porfirinas.

– Colorantes con afinidad por las estructuras celulares como el Naranja de acridina que se une a los ácidos nucléicos:

– DNA: fluorescencia verde amarillenta.

– RNA: fluorescencia roja amarillenta.

Esta prueba se usa en el diagnostico precoz del cáncer (células ricas en RNA).

2. INMUNOCITOQUÍMICA (INMUNOFLUORESCENCIA).

Sirve para identificar proteínas especificas. Se basa en la reacción Ag-Ac. Al Ac se le puede marcar con un compuesto fluorescente. Es la método más usado para la detección de auto-anticuerpos en enfermedades autoinmunes.

PREPARACIONES PERMANENTES

Describiremos primero las preparaciones histológicas permanentes (laminas) para el estudio al microscopio óptico. Con este instrumento los objetos se examinan por transparencia, siendo pocas las estructuras que se examinan directamente (mesenterio, cola de renacuajo) y que pueden ser observadas “in vivo”, sin fijar y teñir, como sucede en las preparaciones permanentes.

Los pasos que se siguen para obtener una preparación permanente son:

1º. Fijación

2º. Inclusión

3º. Corte con microtomo

4º. Coloración

A. FIJACIÓN.

– Se hace a fin de evitar la autolisis y destrucción celular.

– Los tejidos deben ser tratados inmediatamente después de ser cortados.

– Tiene por fin endurecer los tejidos, volviéndolos mas resistentes a las etapas subsiguientes de la técnica histológica.Hay que conservar la morfología y la composición química de los componentes de los tejidos.

– Suele durar unas 12 horas.

La fijación puede ser realizada por procesos:

MÉTODO	CARACTERÍSTICAS
FÍSICO	– Calor, como en bacterilogía. – Frió, como en el criostato.
QUÍMICO (uso de fijadores que inmovilizan las proteínas de los tejidos).Es la más usada en Histología.	Fijadores: – Cloruro de mercurio y ácido pícrico precipitan proteínas. – Formaldehído, tetraóxido de osmio y glutaraldehído apenas causan coagulación y se usan en ME. Mezclas fijadoras: – Liquido de BOUIN: pícrico/formol/acético glacial – Liquido de HELLY: dicromato potásico/cloruro de mercurio/formol

Este paso es ESENCIAL, puesto que las proteínas son las principales responsables de la estructura celular y se degrada después de la muerte celular.

Habitualmente se hace una doble fijación con una solución tamponada de:

– Glutaraldehído.

– Tetraóxido de osmio.

B. INCLUSIÓN.

– Da consistencia firme a los tejidos para que se puedan obtener cortes suficientemente finos.

– Las sustancias más usadas para este fin son:

– GELATINA, CELOIDINA, PARAFINA para la MO.

– RESINA EPOXI para la ME.

Hay una serie de tratamientos a los que hay que someter a una pieza antes de la inclusión:

TRATAMIENTO	CARACTERÍSTICAS
DESHIDRATACIÓN	Se extrae el agua de los tejidos con baños de concentraciones crecientes de etanol ( de 70% a 100%).
ACLARAMIENTO O DIAFANIZACIÓN	Sustitución del etanol por un liquido miscible en etanol y parafina.Se usa xilol, benzol o toluol que dejan a la pieza translúcida.
INCLUSIÓN O IMPREGNACIÓN	– Se colocan las piezas en parafina fundida a 60 ºC en el interior de una estufa. – Debido al calor , el xilol o toluol se evaporan y los espacios que dejan libre son ocupados por la parafina. – Se lleva la pieza a un recipiente rectangular y se deja solidificar. – Inconvenientes: – Destruyen muchas enzimas – Eliminan compuestos liposolubles

C. CORTE CON MICROTOMO.

– Los bloques de parafina son seccionados por la cuchilla del microtomo, obteniéndose cortes de 3 a 8 micras de espesor. Estos cortes son extendidos en agua caliente y después se llevan a un portaobjetos.

– Para el microscopio electrónico se requieren cortes de 0.02 a 0.1 micra. El material se incluye en plásticos bastante duros del tipo epoxi y para cortarlos se usa un ultramicrotomo equipado con navaja de cristal o diamante.

– El microtomo de CONGELACIÓN SE USA PARA ESTUDIAR LOS LÍPIDOS DE LAS ESTRUCTURAS CELULARES, ya que los solventes orgánicos los eliminan. Usa nieve carbónica para congelar el tejido.

– CRIOSTATO es un microtomo de congelación más elaborado que permite la obtención rápida de cortes sin pasar por todas las etapas anteriores, cuando se usa parafina.Son muy utilizados en hospitales cuando se requiere un diagnostico rápido de un material patológico.

El criostato es también muy útil en histoquímica , pues no inactiva las enzimas, pero dificulta la difusión de las moléculas.

– MÉTODO DE CONGELACIÓN-DESECACIÓN: Se mantiene la actividad enzimática. Se congela a -150 ºC y después se deshidrata lentamente a vació.

D. COLORACIÓN.

– Aumenta el contraste de las estructuras y hace a los tejidos visibles y diferenciables unos de otros.

– Se realiza normalmente con MEZCLAS QUÍMICAS DE COLORANTES.

– La mayoría de los colorantes se comportan como ácidos o como bases y tienden a formar sales con los radicales ionizables de los tejidos.

– Los componentes de los tejidos pueden ser:

SUSTRATO	COLORANTE	EJEMPLOS
BASÓFILO (tejidos que se tiñen fácilmente con colorantes básicos).	BÁSICO (azul de toluidina y azul de metileno, hematoxilina).	Nucleoproteínas y glicoproteínas ácidas.
ACIDÓFILO (tejidos que se tiñen fácilmente con colorantes ácidos).	ÁQCIDO (orange G, eosina y la fuschina ácida).	Proteínas básicas del citoplasma.

La doble coloración por la hematoxilina y la eosina es la más utilizada en la técnica histológica.

OJO: Los colorantes no proporcionan datos sobre la naturaleza química de los componentes a los que se unen.

TÉCNICA	COMPONENTES	NÚCLEO	CITOPLASMA	FIBRAS COLÁGENAS	FIBRAS ELÁSTICAS	RETICULINA
Hematoxilina-eosina	Hematoxilina	Azul	–	–	Irregular	–
	Eosina	–	Rosa	Rosa	Irregular	–
	Hematoxilina férrica	Negro	–	–	–	–
Tricromo Masson	Fuchina-ácida y Panceau	–	Rojo	–	–	–
	Verde luz	–	–	Verde	–	–
Fuchina-resorcina	Fuchina y resorcina	–	–	–	Púrpura	–
Impregnación argéntica	Sales de plata	–	–	Castaño	–	Negro

Los factores que influyen en la tinción son:

– Pureza y concentración del colorante.

– pH y temperatura.

– Tiempo.

E. METACROMASIA.

Hay ciertos tejidos, como la matriz cartilaginosa, que al usar colorantes como el azul de toluidina, se modifica el color azul por unión al tejido, pasando a púrpura. A este fenómeno se le denomina metacromasia.

Los colorantes metacromáticos suelen ser básicos, como el azul de toluidina y tionina. Los componentes tisulares que pueden colorearse metacromáticamente, denominados cromotropos, son principalmente:

– Glucosaminoglicanos sulfatados, fuertemente ácidos de la matriz cartilaginosa y los mastocitos del tejido conectivo.

– Nucleoproteínas.

F. MANIPULACIÓN EXPERIMENTALES DE CÉLULAS VIVAS.

Las técnicas de tinción pueden ser:

– VITALES: no provocan la muerte. Se usan colorantes relativamente no venenosos que son retenidos selectivamente por algunas células del organismo. Se inyecta al animal vivo.

– SUPRAVITALES: se agrega el colorante a las células o tejidos que permanecen vivos después de ser separados del organismo.

Ejemplos:

– El carmín y azul tripán se usan para el estudio de la fagocitosis.

– El rojo neutro para identificar los distintos tipos de leucocitos.

– El verde jano tiñe las mitocondrias.

– La alizarina se une a la matriz ósea recién formada y se ha usado para el estudio de la formación del hueso.

G. CRIOFRACTURA.

Permite el estudio de la ultraestructura de las células sin los posibles artefactos producidos por la fijación y la inclusión (ej: membrana plasmática). Sirve para el examen de cortes ultrafinos.

Fases: 1º. Congelar el tejido a temperatura muy baja. 2º. Fracturar con una cuchilla de metal afilada. El tejido fracturado se mantiene a muy baja temperatura y en alto vacío, así se elimina el agua por sublimación. La superficie fracturada muestra elevaciones y depresiones correspondientes a las diversas estructuras de los tejidos. 3º. Hacer una réplica al molde de la superficie fracturada depositando una capa de carbono. 4º. Depositar una capa de metal pesado sobre la superficie de carbono para dar un aspecto sombreado. 5º. Llevar la muestra a presión atmosférica normal y destruir el tejido por una sustancia que no ataque el molde (ácido fuerte, hipoclorito sódico). 6º. Colocar la réplica en una rejilla de cobre y llevarla al ME.

RADIOAUTOGRAFIA

Se basa en el efecto de las radiaciones sobre las emulsiones fotográficas que contienen bromuro de plata (microdetectores de radiactividad). Los cationes de plata que son alcanzados por la radiación se transforman en plata metálica que aparece negra al microscopio óptico (MO).

Fases: 1º. Inyectar el isótopo radiactivo al órgano en estudio. 2º. Poner un corte de órgano en contacto con la película de emulsión fotográfica. 3º. Dejar un período de exposición y revelar la película. Los puntos negros que aparecen corresponden a los sitios del órgano que contienen el isótopo.

La cantidad de gránulos de plata es proporcional a la radiactividad presente y así permite también la medida de la cantidad relativa de dicha sustancia.

a) Técnica de emulsión liquida:

– Se sumergen las preparaciones biológicas en la emulsión calentada y fundida.

– Retirar las láminas y queda sobre su superficie una fina película de emulsión.

– Secar y guardar al abrigo de la luz, generalmente a baja temperatura.

– Proceso de revelado semejante al usado para placas fotográficas en una cámara oscura.

– Llevar al microscopio (ME ó MO).

b) Aplicaciones: con el uso de isótopos radiactivos de C, H, N, S, P, es posible marcar las moléculas de numerosos compuestos que intervienen en el metabolismo. De esta forma se localiza el proceso metabólico y su velocidad, como la secreción de gránulos de zimógeno.

Incluiremos dentro de las técnicas histoquímicas a aquellas que supongan una reacción química en la que intervienen moléculas pertenecientes al propio tejido (trataremos la detección de glúcidos mediante lectinas y la inmunohistoquímica en apartados diferentes a éste, aunque algunos autores las incluyen como ténicas histoquímicas). El objetivo de la histoquímica es poner de manifiesto una molécula o familia de moléculas presentes en una sección histológica y estudiar su distribución tisular "in situ". Estas moléculas son difícilmente discernibles con colorantes generales. Durante el procesamiento del tejido previo a la reacción histoquímica, como la fijación o la inclusión, hay queevitar dañar a la molécula que queremos detectar porque de otra manera resultaría en falsos negativos, es decir, no tener tinción cuando en realidad la molécula de interés sí está presente en el tejido, aunque deteriorada. En algunas ocasiones es necesario realizar pasos previos a la reacción histoquímica para descubrir la molécula que queremos detectar, por ejemplo usando un fijador adecuado, ya que de otra manera no reaccionaría con los reactivos químicos. Vamos a dividir las técnicas histoquímicas en dos grupos: reacciones químicas e histoquímica enzimática.

Las reacciones químicas consisten en la modificación química de moléculas del tejido para posteriormente poder colorearlas. Existen técnicas histoquímicas para detectar glúcidos, proteínas y nucleótidos. La técnica histoquímica más empleada es la reacción de PAS (Periodic Acid Schiff). Se utiliza para la detección de hidratos de carbono, libres o conjugados, cuando están en cantidades relativamente grandes en los tejidos. La modificación química del tejido consiste en la oxidación mediante el ácido periódico de los enlaces entre los carbonos próximos que contienen grupos hidroxilos. Esto provoca la formación de grupos aldehídos que serán reconocidos por el reactivo de Schiff, el cual se combinará con ellos para dar un color rojizo brillante. Entre los componentes del reactivo de Schiff está la pararosanilina (un componente de la fucsina básica) tratada con ácido sulfúrico. Una gran ventaja de la tinción histoquímica PAS es su capacidad de discriminación de tipos de glúcidos con pequeñas modificaciones de la técnica.

Tinción con hematoxilina-eosina (imagen de la izquierda) y PAS-hematoxilina (imagen de la derecha) de las vellosidades del intestino de humano cortadas transversalmente. Se puede apreciar a las células caliciformes teñidas de rosado con la ténica de PAS por su alto contenido en mucopolisacáridos, mientras que en una tición general aparecen transparentes, sin teñir.

Pasos de la tinción histoquímica PAS-Hemtaoxilina sobre cortes de parafina. Los pasos con letras en color verde son los específicos para esta tinción.

La histoquímica enzimática o histoenzimología se basa en la capacidad que tienen algunos enzimas del tejido de mantener funcional su centro activo tras el proceso de fijación. Estos enzimas y las células que los poseen se ponen de manifiesto mediante una reacción enzimática que convierte a unos sustratos solubles e incoloros en productos insolubles y coloreados. Los sustratos son específicos para el enzima y los productos se depositan en el lugar preciso donde se produjo la reacción, es decir, donde se localiza el enzima. Las enzimas que se pueden detectar son variadas como las peroxidasas, fosfatasas, deshidrogenasas, diaforasas, acetilcolinesterasa, etcétera. Hay que tener en cuenta que cuando queremos detectar una actividad enzimática es recomendable no incluir el material en medios como la parafina puesto que la deshidratación y la temperatura elevada pueden dañar la conformación de la enzima y por tanto la actividad de su centro activo. Por ello estas técnicas se realizan normalmente en secciones obtenidas por congelación o con el vibratomo.

La actividad NADPH diaforasa se asocia a la enzimas sintasas del óxido nítrico en sistema nervioso y vascular. A estos enzimas se les ha relacionado con el control del flujo sanguíneo y con ciertos aspectos de la fisiología del sistema nervioso. Esta técnica permite detectar neuronas que expresan la enzima sintasa del óxido nítrico de una forma sencilla y rápida. La reacción es NADPH + tetrazolio = NADP⁺ + formazán. Es el formazán el producto coloreado e insoluble que se puede observar con el microscopio óptico, incluso con el electrónico.

Imagen de un corte de 60 µm de grosor de cerebro obtenida con un criostato y procesada para histoquímica enzimática que pone de manifiesto una actividad diaforasa perteneciente a la enzima óxido nítrico sintasa neuronal que aparece en algunas neuronas (células con un color azul intenso).

Los pasos para la detección histoquímica de la actividad diaforasa es muy sencilla. Tras una fijación, preferentemente por perfusión, hay que permeabilizar el tejido con un disolvente de lípidos como el Triton-X100. El revelado se produce a 37 ^oC y el final de la reacción se controla mediante observaciones periódicas. La concentración de los sustratos (NADPH y azul de tetrazolio) varía según el tejido o el proceso de fijación.