Reacciones inmunoenzimáticas
RADIOINMUNOENSAYO (RIA).
El principio general del RIA es la INHIBICIÓN COMPETITIVA de la unión de un Ag radioactivo, conocido como trazador, a sus Ac específicos por parte del Ag no marcado:
Ac + Ag* <—————> Ac-Ag*
Ac + Ag <—————> Ac-Ag
Cuanto mayor sea la cantidad de Ag no marcado presente, menor será la cantidad de trazador que se une al Ac. La cantidad de trazador libre se determina mediante recuento en un contador de centelleo líquido o en un contador gamma, que mide el tipo y la cantidad de radiación emitida. 
Se puede determinar la concentración de un Ag en el suero con suficiente especificidad y sensibilidad, si el marcador es lo suficientemente radiactivo, y se puede colocar en concentraciones infinitesimales, y si el Ac es altamente específico. Se usa para determinar hormonas, Ac anti DNA, etc.
4.1.1. RIA EN FASE LÍQUIDA.
Hay que hacer dos ensayos fundamentales:
– Titulación del antisuero: incubar diferentes concentraciones de Ac con el Ag* marcado y valorado (trazador) para seleccionar la concentración de Ac óptima (mediante la elaboración de una curva patrón) para el desarrollo posterior de la prueba.
– Ensayo de desplazamiento: incubación conjunta del Ag* marcado y valorado, el antisuero previamente titulado (Ac valorado) y la muestra problema que contiene el Ag a determinar. El Ag compite con el Ag* en su unión al Ac titulado.
A mayor concentración de Ag en el suero problema, mayor concentración de Ag* libre. Para medir el Ag* libre, se elimina el Ag* unido mediante precipitación de los IC.
4.1.2. RIA EN FASE SÓLIDA.
Se han desarrollado para facilitar la separación entre los Ag* libres y los Ag* unidos a los IC. Los pasos son los siguientes:
– Fijación del Ag sobre un soporte (tubo o placa de plástico). Lavar para eliminar el exceso el exceso de Ag.
– Bloqueo o postapizado de la placa con ovoalbúmina, que tapa las zonas libres de la placa para que no fijen Ac o Ag (esta técnica también se usa en el ELISA).
– Adición de la muestra problema donde se quieren determinar los Ac. Lavar para eliminar los Ac no unidos.
– Adición de anti-Ac radiomarcados (conjugado) y lavar para eliminar el exceso.
– Medir la radiactividad de la placa en un contador.
4.2. DETECCIÓN DE PROTEÍNAS SOBRE SOPORTES.
El método se basa en detectar proteínas (Ag en solución) tras su fijación sobre membranas de nitrocelulosa (NC), y posterior revelado mediante la adición de Ac mercados con enzimas.
4.2.1. DOT-ELISA.
La fijación de las proteínas a la membrana se lleva a cabo a cabo a partir de soluciones proteicas complejas: método de manchas o DOT-ELISA.
Permite la fijación de gran cantidad de proteínas y, por tanto, la detección de componentes que se encuentran en pequeña cantidad en una mezcla compleja.
Procedimiento:
– Depositar sobre la lamina de NC una pequeña gota de Ag y dejar secar bajo una lámpara.
– Bloquear la lamina de NC con un posttapizado.
– Sumergir las muestras problemas en las soluciones de Ac, y lavar tras incubación.
– Incubar en la solución de Ac marcado con enzima, y lavar tras incubación.
– Incubar con el sustrato adecuado. En la zona de sembrado del Ag se deposita el precipitado coloreado.
4.2.2. WESTERN BLOT (WB)
Se basa en la separación de los antígenos virales mediante una electroforesis en gel de SDS-PAGE (lo cual proporciona una carga negativa a la proteínas).
– Las proteínas son sometidas a una electroforesis en un gel de poliacrilamida. Como las proteínas están cargadas negativamente se separan con base en su peso molecular (las más grandes permanecen en la parte superior del gel y las menores migran hacia la base). 
– Las proteínas se transfieren a un soporte sólido (papel de nitrocelulosa, nylon), lo cual da una copia exacta del patrón del gel en la matriz.
– La identificación de las proteínas a estudiar se realiza usando un ELISA indirecto (INMUNOBLOTTING). Las reacciones se leen como positivas cuando una línea de precipitación o color se forma en el peso molecular correcto para una proteína particular.
El marcaje puede ser por:
A) Tinción no específica de proteínas totales:
– GEL: Azul de Comassie.
– MEMBRANA: Rojo Ponceau, Tinta china, Negro Amido.
B) Tinción específica de proteínas (membrana): uso de Ab.
– Ab unidos a enzimas: la enzima cataliza una reacción dando lugar a un precipitado coloreado o que emite luz.
- – Enzimas: HRP (peroxidasa de rábano) / Fostatasa alcalina.
- – Sustratos: Quimioluminiscentes: Luminol
- – Colorimétricos: DAB, TMB, CNF.
– Ab que emiten radiaciones ionizantes.
– Ab unidos a prot. A o G asociada a oro coloidal.
Tipos de marcaje.
4.2.3. ELISPOT
· La técnica de ELISPOT es un ensayo que se utiliza en inmunología para detectar las células que secretan un anticuerpo, una granzima o una citocina específico.
· ELISPOT es una herramienta muy potente para el análisis de funciones inmunológicas de células linfoides de sangre periférica. Este técnica permite la detección, enumeración y caracterización de células secretoras de Anticuerpos y citocinas a nivel individual
· ELISPOT fue derivada del sandwich enzyme-linked immunosorbent assay ELISA, e incorpora el ensayo inmunoenzimático en fase sólida ELISA
· Esta técnica fue desarrollada por la BD Biosciences utiliza Anticuerpos purificados NA/LE (en sodium azide/low endotoxin) adsorbidos en placas com pozos cubiertos por una membrana de Polyvinylidene difluoride (PVDF)
· – Prueba diseñada originalmente para la detección de células B secretoras de anticuerpos antígeno específicos. Ahora, se ha adaptado para la detección de células secretoras de citocinas específicas u otros antígenos.
· Es un método sensible y selectivo para el estudio de citocinas, no requiere estimulación previa para reflejar la situación in vivo. Para células T, por ejemplo, el IFN-? secretado por las células en cultivo, es capturado en las inmediaciones de la células por un anticuerpo específico anti- IFN-? adsorbido en el fondo del pozo.
· Las células se retiran mediante lavados sucesivos y se adiciona un segundo anticuerpo específico anti-IFN-?, marcado con una enzima, el cual va a adherirse al interferón inmovilizado por el primer anticuerpo; al adicionar el sustrato de la enzima, se forma un producto colorido insoluble que permite ver el sitio en donde se encontraba la célula secretora de IFN-? como una mancha de color.
REACCIONES INMUNOENZIMÁTICAS.
Revelan la presencia de Ag o Ac mediante una reacción Ag-Ac específica, en la que el complejo inmune formado se mide por una reacción colorimétrica catalizada por una enzima acoplada químicamente a uno de los reactivos, en presencia del sustrato adecuado.
El ELISA se basa en dos supuestos:
– El Ag o el Ac se pueden unir a un soporte en fase sólida reteniendo su actividad inmunológica.
– Tanto el Ag como el Ac pueden unirse a una enzima, y el conjugado mantiene tanto su actividad inmunológica como enzimática.
Los métodos inmunoenzimáticos (ELISA) se han desarrollado en tres direcciones:
– Localizar los constituyentes celulares.
– Medición de pequeñas cantidades de componentes en los líquidos biológicos.
– Detección de precipitados inmunes inmovilizados sobre papeles de nitrocelulosa.
3.1. ENZIMOINMUNOANÁLISIS
El ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) se basa en la reacción de un Ac o de un Ag acoplado de forma covalente a una enzima, con un Ag o un Ac inmovilizado (fijado sobre un soporte), para detectar finalmente la actividad enzimática con ayuda de sustratos específicos. Tipos de ELISAs:
A) HOMOGÉNEOS: son en medio líquido y no se requiere la separación de los reactivos . La reacción sigue la ley de acción de las masas.
A1) Ventajas:
Más precisos
En general automatizados, se llevan a cabo sin entrenamiento especial
A2) Desventajas:
Son más costosos en reactivos
En general sólo sirven para fármacos
B) HETEROGÉNEOS: se requiere separación entre el reactivo libre y el unido. Para ello, el Ag o el Ac están inmovilizados. El reactivo complementario difunde hacia él y se le une específicamente.
B1) Ventajas :
Menos interferencias, más específicos y sensibles
Instrumentación menos costosa
Admiten mayor tamaño de muestra, así disminuye el límite de detección.
Más versátiles en cuanto a tipo de analito
B2) Desventajas :
Más difíciles de automatizar
Mayor tiempo de análisis
Los métodos de ELISA HETEROGÉNEOS dependiendo de la actividad enzimática se dividen en dos tipos:
– – Competitivos: En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.
– – No competitivos: Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en la fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color.
Dentro de los no competitivos tenemos:
– – Los directos que detectan antígenos
– – Los indirectos que detectan anticuerpos.
3.2. PASOS GENERALES DE UN ELISA
1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo
2. Todas las placas son sometidas a un tapizado con gelatina o albúmina sérica bovina, que recubre las zonas en las que no se ha fijado el primer componente de la reacción (Ag o Ac).
3. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos
4. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el posillo.
5. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o antígeno no unido
6. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
7. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
8. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
9. Adición del sustrato
10. Unión del sustrato a la enzima
11. Generación de la señal. La última parte de un inmunoensayo en que la marca es enzimática es la cuantificación de la enzima. Métodos de detección:
a) Espectrofotométrico o colorimétrico. Se mide la aparición de un cromóforo.
b) Fluorométrico- Se mide la aparición de un producto fluorescente
c) Quimioluminiscente- Se mide la aparición de un producto luminiscente.
12. Lectura del color en un lector de placas.
13. Cuantificación en ELISA: curvas standard
3.2.1. REACTIVOS QUE GENERAN COLOR.
Los reactivos utilizados suelen ser los mismos (peroxidasa, fosfatasa alcalina, beta-glucosidasa, glucosa oxidasa) para todos los ELIASAs, con la diferencia del sustrato de la enzima utilizada:
d) Puede generar productos coloreados y solubles que se miden por espectrofotometría.
– En presencia de agua oxigenada, los cromógenos usados para la peroxidasa se reducen y dan productos solubles y coloreados. Los sustratos son la o-dianazina, o-fenilenodiamina (OPD), tetrametilbencidina (TMB), ácido- 2,2-acino-di-(3-etil)benzatiazolina-6- sulfónico (ABTS).
– Cuando queremos un precipitado, se usa para revelar la reacción a la peroxidasa y diaminobenzidina, que generan un precipitado de color café.
– La glucosa oxidasa reacciona con la glucosa y libera agua oxigenada que se detecta por una mezcla de peroxidasa y un cromógeno. Sí queremos un precipitado, podemos usar una sal de tetrazolio.
– La fosfatasa alcalina y la beta-glucosidasa utilizan como sustrato a el paranitrofenilfosfato y el ortonitrofenil-beta–D-galactopiranosido, los cuales son hidrolizados por la enzima y se libera el nitrofenol soluble.
– Puede generar precipitados coloreados insolubles y estables en el mismo lugar de la enzima (ELISA-DOT y Western-blot sobre papel de nitrocelulosa) y localizar constituyentes celulares (inmunohitoquímica).
3.3. TIPOS DE ELISAs
3.3.1. ELISA DIRECTO
Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina, …) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido).
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
3.3.2. ELISA INDIRECTO
Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos : uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señál debida a la unión de dos o más anticuerpo secunadarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
3.3.3. ELISA SANDWICH
Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
A) ELISA Sándwich “DAS” (Double Antibody Sandwich).
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
B) ELISA Sándwich “HADAS”.
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionado.
• Adición de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
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