Epidemiología Molecular de Enfermedades Infecciosas

 ANTICUERPOS EN EL LABORATORIO Y LA CLÍNICA.

 ANTICUERPOS EN EL LABORATORIO Y LA CLÍNICA.

10.1. USOS DIAGNÓSTICOS Y TERAPÉUTICOS DE LOS ANTICUERPOS

Técnicas analíticas/diagnósticas: miden generalmente fuera del organismo por técnicas “in vitro” algún parámetro

• ELISA enzima inmunoensayo mediadores, seropositividad
• WESTERN inmunoelectroforesis de proteínas, inmunodetección
• IMMUNOHISTOQUIMICA, biopsias, anatomía patológica
• NEFELOMETRIA turbidometría, determinación Ig séricas
• CITOMETRIA DE FLUJO Diagnóstico de leucemias

Técnicas terapéuticas: diseñadas para curar.

• Tratamiento antineoplásico destrucción células tumorales
• Tratamientos antiinflamatorios. Neutralización de mediadores proinflamatorios
• Inmunoestimulación con citocinas o vacunación con antígenos

10.2. USO DE ANTICUERPOS EN EL LABORATORIO

• Fundamento: Pueden ser utilizados como nanoherramientas capaces de reconocer específicamente y a las que nosotros podemos sujetar, localizar o medir.
• Especificidad en el reconocimiento aportada por la región Fab del anticuerpo.
• Posibilidad de marcaje: radioactivo, enzimatico, fluorescente, con puente biotina-avidina. Detección y medida.
• Unión a soportes (magnéticos o de plástico) por región Fc. Separación y purificación molecular y celular.

10.3. TERAPIA CON ANTICUERPOS MONOCLONALES

1.- ANTITUMORAL.

a) CONJUGADOS:

– RADIOCONJUGADOS (Fósforo, Estroncio, Yodo, Ytrio)

I-antiCD45 leucemias mieloides agudas

Zevalin antiCD20 de ratón vida corta Itrio 90

Bexxar antiCD20 de ratón Iodo131

– QUIMIOCONJUGADOS.

• AntiCD33 Mylotarg conjugado con chaleomicina (CMA-676) produce especies altamente reactivas que dañan el DNA e inducen apoptosis. El antígeno CD33 se endocita al ser reconocido por el anticuerpo anti CD33. Se emplea en leucemias mieloides agudas.
• AntiCD22 Conjugados con RNAsas se experimentan en linfomas.

b) NO CONJUGADOS:

– ACCIÓN ANTITUMORAL

• AntiCD20 (Rituximab) para linfomas y Leucemias de células B.
• AntiCD52 (Campath 1H) tumores de células B, enfermedad mínima residual, rechazo de órganos e injerto contra huésped, enfermedades autoinmunes.
• AntiCD40 induce AICD en linfomas.

– SELECTIVA. Conjugados con partículas magnéticas.

• AntiCD34 para purificación de células madre hematopoiéticas (CD34+) por selección inmunomagnética.
• Permite purificar células madre a partir de sangre periférica.

– ELIMINACIÓN DE CÉLULAS.

2.- TERAPIA ANTI-INFLAMATORIA.

– Anticuerpos anticitocina Anti-TNFa Infliximab

• Neutralizan mediadores proinflamatorios
• Tienen un efecto drástico efecto antiinflamatorio
• Se usan en Enfermedad de Chron, Artritis reumatoide.

– Receptores solubles de TNF Etanercep

• También neutralizan TNF pero tienen vida más corta.

– Quimeras con región Fc. IgG. alargan vida media del receptor soluble

11. IDENTIFICACIÓN, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE CÉLULAS

11.1. FACS (FLUORESCENCE ACTIVATED CELL SORTING)

• Anticuerpos unidos a compuestos fluorescentes son reconocidos en la superficie de cada célula.

• Células de los fenotipos seleccionados son reconocidas una a una y separadas en función de las combinaciones de parámetros seleccionados.

• Aplica un campo eléctrico que desvía trayectoria de caída de la célula hacia el contenedor de fracción deseado.

• Se pueden clonar células de características específicas:

• Características Metabólicas de las Células: Nivel de pH, estado redox, nivel de calcio

• Separación de células que expresan un gen reporter (proteínas fluorescentes)

• Separación de poblaciones celulares en función de expresión de diferentes antígenos (intra o extracelulares) a los que se unen anticuerpos con marcaje fluorescente.

• Separación de poblaciones celulares en función de su tamaño y complejidad interna Contenido de ADN: Estudio de la fase de ciclo celular en la que se encuentra la célula

• Separación de células que han iniciado el proceso de muerte por apoptosis, de células viables y células necróticas

11.2. MÉTODOS DE FASE SÓLIDA

Fijación de anticuerpos por su región Fc a una fase sólida.

Panning: Se realiza la fijación de los Ab a plástico. Las células portadoras del antígeno se unen al soporte, después se realiza un lavado y por último la separación mecánica o química.

11.3. MACS (Magnetic Activated Cell Sorting)

– El sistema autoMACS (Miltenyi Biotec) permite la separación automatizada de células mediante bolas paramagnéticas adheridas a la superfície celular mediante anticuerpos monoclonales.

– Anticuerpos unidos a micropartículas magnéticas son retenidos en una matriz ferromagnética (fase sólida) cuando se aplica un campo magnético. Lavado y elución por eliminación del campo magnético.

– Tiene capacidad para separar hasta 4 x 10⁹ células en 5 minutos y realizar diferentes procesos de separación secuencialmente, con un enriquecimiento de la subpoblación inicial de hasta 10.000 veces.

11.4. CITOTOXICIDAD MEDIADA POR ANTICUERPOS.

– Este método está basado en la especificidad de la interacción de los anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos de la superficie celular.

– Posteriormente, se adiciona un suero sin descomplementar. El compelemto se activa y hay eliminación de una subpoblación que lleva un antígeno de membrana específico.

Exploración de la respuesta celular

MÉTODOS DE EXPLORACIÓN DE LA RESPUESTA CELULAR.

9.1. ESTUDIO DE LINFOCITOS T.

9.1.1. INTRADERMO-REACCIÓN o EPICUTI-REACCIONES.

Son muy útiles, como método de cribado primario, para medir el grado de sensibilización de un organismo frente a un Ag con el que supuestamente ha entrado en contacto. El ejemplo clásico es el de la prueba de la tuberculina o de Montaux.

Los Ag inyectados intradérmicamente, son reconocidos por los LTh sensibilizados, los cuales son estimulados de nuevo, producen linfocinas y activan a los macrófagos. Los macrófagos activados acuden al punto de inoculación, dando lugar, después de 24/48 horas, a:

– Inflamación e induración: prueba de la tuberculina positiva.

– Débil inflamación: prueba de la tuberculina negativa.

Estas técnicas también se emplean para determinar reacciones HPS I mediadas por IgE. Son las pruebas de la ANAFILAXIA O ALÉRGICAS (PRICK-TESTS), que se leen en 15/20 minutos.

9.1.2. TEST DE INHIBICIÓN DE LA MIGRACIÓN DE MACRÓFAGOS.

Mide la producción del factor inhibidor de macrófagos (MIF), producido por los LTh sensibilizados frente al Ag, cuando in vitro se enfrentan al mismo Ag.

Procedimiento:

– Macrófagos obtenidos mediante lavado peritoneal de ratón o cobaya, se mezclan bien con los LT problema supuestamente sensibilizados.

– Las suspensiones celulares obtenidas se introducen en tubos capilares sellados por uno de los extremos con parafina.

– Depositar los tubos sellados en cámaras llenas de medio de cultivo, al que se añade el Ag homólogo del problema (distintas cámaras con distintas concentraciones) y se incuba a 37 ºC durante la noche.

– Al día siguiente se observa el tamaño del halo presente en el extremo abierto del capilar. El grado de inhibición de la migración se calcula de acuerdo con la formula:

Diámetro del halo de células inmunes/ diámetro del halo de células normales x 100

9.1.3. TEST DE LINFOPROLIFERACIÓN O TRANSFORMACIÓN LINFOBLÁSTICA.

Es un método para medir la DTH. Cuando los LT sensibilizados se ponen en contacto frente al Ag, proliferan y se dividen. El grado de proliferación de mide con timidina tritiada unida a los nucleótidos que se van a usar para la síntesis de DNA (se añade al medio de cultivo). Es un test para LT de memoria y por lo tanto, un resultado positivo no indica inmunidad protectora.

Procedimiento:

– Los LT se obtienen a partir de sangre total, previa separación en gradiente de Ficoll-isopaque.

– Los leucocitos separados se lavan varias veces con medio de cultivo celular y se ajusta la concentración a 5 millones de células/ml.

– Los leucocitos se dispensan en placas de microtitulación de 96 pocillos, a las que se le añade la solución del Ag problema a la concentración adecuada. A algunos pocillos no se les añade Ag y se usan como controles negativos.

– Se incuban 72 horas a 37 ºC y en atmósfera de 5% de CO₂.

– Recoger las células sobre filtros de fibra de vidrio y se depositan en viales, conteniendo un líquido de centelleo. Posteriormente se determina la radiación beta emitida, que será directamente proporcional al número de células en mitosis.

– La tasa de proliferación se establece entre la radiactividad de los pocillos problema y control.

9.1.4. ANÁLISIS DE CITOTOXICIDAD POR LIBERACIÓN DE CROMO RADIACTIVO.

Detecta los LTc CD8+ que lisan células diana que han sido cultivadas en un medio con cromo radiactivo. Sí hay lisis, hay liberación de cromo radiactivo. Se retira el sobrenadante y se mide la radiactividad.

9.1.5. CUANTIFICACIÓN DE LINFOCITOS T.

SEPARACIÓN DE LINFOCITOS EN GRADIENTE DE DENSIDAD DE FICOLL-ISOPAQUE. Se basa en la diferente densidad que tienen las distintos líneas celulares. El Ficoll tiene mayor densidad que los linfocitos y monocitos, y menor que los eritrocitos y granulocitos. Los linfocitos y monocitos se quedan flotando en la interfase entre el Ficoll y el plasma, y después se recogen con una pipeta.

Para cuantificar las subpoblaciones de linfocitos T se utilizan técnicas de inmunofluorescencia directa o indirecta con Ac monoclonales dirigidos contra moléculas que se expresan en la superficie de las células T: CD3, CD4, CD8, CD2, CD45, CD28, CD25, HLA-DR. En condiciones normales, las células T son el 55-80% del total de los linfocitos de sangre periférica.

9.1.6. VALORACIÓN DE CITOCINAS TRAS ACTIVACIÓN.

En los sobrenadantes del cultivo se puede determinar si se ha producido las citocinas esperadas tras la activación celular, mediante un ELISA sandwich de dos Ac. (IL2, IL6, IL4, IFN-gamma, etc).

Si los fenómenos de activación se han producido adecuadamente, también se producirá un aumento en la concentración de calcio intracelular, y así mismo se habrán producido diversas fosforilizaciones en residuos de treonina/serina, que se pueden determinar por distintas técnicas.

9.2. ESTUDIO DE LINFOCITOS B.

9.2.1. ANÁLISIS CELULAR DE FORMACIÓN DE PLACAS: ANÁLISIS DE CÉLULAS B.

Mide las células formadoras de Ac (AFC) al exponer los linfocitos a eritrocitos con Ag. Se incuban y los LB se transforman en células plasmáticas, que producen Ac y se revisten de eritrocitos (con las Ig de membrana). Se pueden separar las que producen IgG de las IgM.

Hay distintas placas:

– Placa inversa: detecta AFC totales.

– Placas directas: detecta las IgM específicas.

– Placas indirectas: detecta las IgG específicas.

9.2.2. ANÁLISIS DE MICROPUNTOS.

Cultivo en placa de LB y las AFC se detectan por ELISA (formación de un precipitado alrededor de la célula).

9.2.3. CUANTIFICACIÓN DE LINFOCITOS B.

La cuantificación se realiza mediante técnicas de inmunofluorescencia directa o indirecta con Ac monoclonales marcados y dirigidos contra moléculas de superficie específicas de células B maduras (CD19, CD20).

9.2.4. ESTUDIOS FUNCIONALES DE CÉLULAS B (in vitro).

Las células mononucleares de sangre periférica (células T, B, monocitos, células NK) se cultivan in vitro con activadores policlonales de células B (pokeweed, PWM; proteína de S. aureus cepa Cowan A, SAC) y pasados 7-12 días de cultivo se recoge los sobrenadantes y se cuantifica la producción de Ig en ellos mediante el empleo de técnicas de ELISA.

9.2.5. ESTUDIOS FUNCIONALES DE LAS CÉLULAS B in vivo: Ac naturales y Ac inducidos tras vacunación.

Los Ac naturales son aquellos que existen a los pocos meses del nacimiento, sin que haya existido inmunización previa (ej: isohemaglutininas dirigidas contra el sistema sanguíneo ABO). En los pacientes con síndrome de Wiskott-Aldrich hay ausencia o disminución de estos Ac.

El test de Shick mide la funcionalidad de la IgG en individuos previamente inmunizados. Se realiza inyectando intradérmicamente, en el antebrazo, 0.1 ml de toxina diftérica (Ag de Shick). Pasadas 96 horas se examina esa región y se considera que la prueba es positiva si aparece edema y eritrema, lo que indica la carencia la carencia de IgG antitoxina, y es anomalo si el individuo si el individuo fue vacunado contra la difteria en los dos años anteriores. La mayoria de individuo con inmunodeficiencias tienen el test de Shick positivo.

9.3. ESTUDIO DEL SISTEMA FAGOCÍTICO.

9.3.1. NITROAZUL DE TETRAZOLIO (NBT).

El NBT es una sustancia incolora que cuando es reducida, pasa a formazán de color azul, siempre que se genera anión superóxido por el metabolismo oxidativo de los fagocitos. En esta prueba se incuban las células fagocíticas con NBT y partículas de látex (que serán fagocitadas y aumentan la velocidad del proceso) o con ésteres de forbol (que activan a fagocitos). Posteriormente, se observará al microscopio el número de células teñidas de azul.

9.3.2. TEST DE QUIMIOLUMINISCENCIA.

Mide la respuesta oxidativa de los fagocitos a una gran variedad de estímulos, solubles o particulados. Se encontrará alterada en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica o en deficientes en mieloperoxidasa. En esta prueba se mide (en espectrofotómetro de centelleo líquido) la energía luminosa producida durante la lisis del microorganismo. En condiciones normales, durante la fagocitosis se liberan radicales de oxígeno libre. Estos reaccionan con sustratos oxidables sobre los microorganismos y forman productos intermedios inestables , los cuales liberan energía luminosa cuando vuelven a su estado basal.

9.3.2.1. CAUNTIFICACIÓN DE CD18.

En los pacientes en los que se sospeche de déficit de adhesión leucocitaria se determinará la expresión de CD18 en monocitos y neutrófilos.

9.3.3. ENSAYO DE QUIMIOTAXIS.

Se mide la capacidad de movimiento en una dirección determinada de los fagocitos, atraídos por un factor quimiotáctico. Se utiliza la cámara de Boyden: las células cuya movilidad se va a analizar se colocan en la parte superior de la cámara, y están separadas de la parte inferior de la cámara por una membrana semipermeable que, donde se sitúan las sustancias quimiotácticas. Los neutrófilos entran en la membrana y se quedan retenidos ahí, la posterior tinción de la membrana nos permitirá examinar al microscopio el porcentaje de células activadas por el factor quimiotáctico.

9.3.4. TEST DE FAGOCITOSIS (ensayo para analizar la capacidad de ingestión por las células fagocíticas).

Las células fagocíticas se incuban junto con partículas o microorganismos recubiertos por opsoninas (complemento o Ac). Posteriormente se detecta el porcentaje de partículas en el interior de las células por distintos métodos como recuento al microscopio óptico o por citometría de flujo (sí las partículas fagocitadas están marcadas con un una sustancia fluorescente).

9.3.5. KILLING.

El test de killing o capacidad de producir muerte en los microorganismos fagocitados se realiza con microorganismos (C. albicans, S. aureus), que son fagocitadas y destruidas en el interior de los fagocitos. Para ver el número de microorganismos muertos se hace un cultivo y se determina el número de unidades formadoras de colonias.