Epidemiología Molecular de Enfermedades Infecciosas

Aislamiento y producción de anticuerpos

• Obtención de antisueros (anticuerpos policlonales). Cuando un animal de experimentación es estimulado con un inmunógeno, éste responde produciendo gran variedad de Ac contra distintos componentes del Ag (polipéptidos, polisacáridos), y epitopos de cada uno de ellos. El conjunto de estos Ac es el antisuero (mezcla heterogénea de Ac) formado por Ac monoclonales. Dicha mezcla es heterogénea e irreproducible.
• Síntesis de anticuerpos monoclonales. Para obtener una solución que contenga un sólo Ac, y siempre el mismo, es necesario lograr la proliferación de un sólo LB. Algunos investigadores intentaron obtener Ac homogéneos (monoclonales) mediante transformación (inmortalización) de LB con el virus de Epstein Barr (VEB), estableciendo algunas líneas productoras, pero en poca cantidad.

8.1. OBTENCIÓN DE ANTISUEROS (ANTICUERPOS POLICLONALES).

Para la obtención de inmunosueros es necesario inocular varios animales con el mismo inmunógeno para seleccionar el mejor. El Ag se administra junto un adyuvante al menos en la inmunización primaria.

El antisuero se obtiene mediante el sangrado de los animales y después se comprueba el nivel de Ac mediante ELISA o Western-blot.

El antisuero se puede purificar por fraccionamiento proteico:

– Precipitación de gamma-globulinas con sulfato amónico al 30-50%.

– Filtración en gel para obtener moléculas de tamaño correcto.

– Cromatografía de intercambio iónico a pH 7: aísla las moléculas con carga positiva (Ac).

– Cromatografía de afinidad sobre ligandos naturales, como la proteína A estafilococica, que se une a Fc de los Ac.

– Cromatografía de afinidad mediante Ag fijado al soporte de la columna. Eluir y obtenemos los Ac puros.

8.2. PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS. TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN DE CÉLULAS SOMÁTICAS o HIBRIDOMAS (Kohler y Milstein).

La manera de hacerlo consiste en fusionar una célula plasmática específica para el Ag deseado, con otra célula que posee una capacidad indefinida de división. Por tanto, la célula fusionada será capaz de vivir en cultivo, dividirse y producir Ac.

Las células parentales responsables de la proliferación del hibridoma, son de una línea de mieloma. Son células capaces de vivir y dividirse in vitro, seleccionadas por carecer de la enzima HG PRT (hipoxantil-guanil-fosforribosil-transferasa); este defecto enzimático resulta necesario para la selección post-fusional de híbridos. La HG PRT es una enzima que utiliza guanina ó hipoxantina para producir purinas, lo que permite la reutilización de las bases cuando la síntesis de novo se ve interrumpida, por ejemplo por la aminopterina que bloquea la síntesis de purinas y timidinas. La adición de timidina al medio permite a la célula sintetizar timidina monofosfato, vía timidina quinasa, pero al no poder utilizar bases púricas, la célula muere, aun en presencia del precursor de hipoxantina.

El medio selectivo HAT contiene:

– Hipoxantina y timidina para enriquecer el cultivo.

– Aminopterina como inhibidor de la síntesis de novo.

En presencia de aminopterina sólo podrán sobrevivir aquellas células que expresan HG PRT, como los hibridomas; las células de mieloma morirán (son HG PRT -) y las células plasmáticas de bazo no se desarrollan en cultivo (no son inmortales). Otra característica de las células de mieloma es la de ser células no secretoras de Ac.

La obtención de Ac monoclonales sigue el siguiente esquema:

1) Inmunización de ratones con Ag soluble disuelto en adyuvante incompleto de Freund por vía intraperitoneal o intramuscular, administrando finalmente una dosis de recuerdo de Ag no emulsionado por vía intravenosa, 3 días antes de la fusión.

2) Fusión: se realiza 3 días después de la dosis de recuerdo del Ag, momento de máxima presencia de blastos en el bazo. Como agente fusionante se usa el polietilenglicol (PEG).

3) Selección de los híbridos linfocito-mieloma en medio HAT.

4) Cultivo de hibridomas en un medio que favorezca la división celular y la producción y secreción de Ac (RPMI 1640). El cultivo se realiza en placa de 96 pocillos a 37ºC, en estufa con un 5% de CO₂.

5) Monitorización de la producción de Ac: la detección de Ac específicos en el medio de cultivo donde crecen los hibridomas es el punto más importante. Las técnicas deben ser de alta sensibilidad, capaces de detectar mgr/ml y rápidas para descartar cultivos inútiles. El método más utilizado es el ELISA.

6) Clonado: los cultivos que dan reacción positiva específica deben ser clonados lo más rápidamente posible para lograr el establecimiento de clones productores de Ac. El método más utilizado es la dilución en medio líquido o método de la dilución límite. Consiste en realizar diluciones de la población original para obtener cultivos que contengan una sola célula capaz de originar el clon correspondiente.

7) Producción de Ac monoclonales en grandes cantidades. Se puede realizar:

· “In vivo”: se inocula intraperitonealmente en ratones histocompatibles con la línea celular y se obtiene el líquido ascítico del animal en el que se pueden obtener concentraciones de Ac de mgr/ml.

· “In vitro”: realizar cultivos celulares de los híbridos a gran escala, obteniéndose concentraciones de mgr/ml en los sobrenadantes.

8.3. REDUCCIÓN DE SU INMUNOGENICIDAD. SÍNTESIS DE ANTICUERPOS QUIMÉRICOS

8.3.1. Disminución de la Inmunogenicidad de los anticuerpos

1. Anticuerpos xenogénicos

– Estimulan la formación de antianticuerpos.

1. Anticuerpos quiméricos (70% h +30% murino)

– Regiones variables murinas.

– Regiones constantes humanas funciones efectoras.

1. Anticuerpos humanizados (90%h+10% murino)

– Reemplazo de regiones armazón originales del domino variable por otras humanas para disminuir todavía más la inmunogenicidad.

8.3.2. Variantes biotecnológicas

A) Quimeras con región Fc. alargan vida media de la molécula asociada

• Anticuerpos biespecíficos.

• Inmunopartículas biespecíficas

• Inmunoliposomas liposomas recubiertos de anticuerpos monoclonales letales como transportadores de sustancias toxicas intracelulares ej. RNAasas

B) El “toque humano” ha permitido el uso clínico

• Anticuerpos quiméricos (1995-) V murina C humana

– Simulect rechazo

– Remicade Infliximab Crohn, AR

• Humanizados HVR murina FR humana C humana

– Zenapax (1997) (CD25)

– Herceptin (1998) cáncer de mama metastático que expresa EGF receptor

– Campath (2001) antiCD52

– Xolair Omalizumab(2003) anti IgE asma alérgica

– Efalizumab (2004) psoriasis

– 200 tipos más están actualmente utilizándose en ensayos clínicos en humanos.

Citometría de Flujo

FUNDAMENTO

La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma célula.

En el momento de realizar las mediciones en el citómetro de flujo, las células pueden estar vivas o fijadas, pero obligadamente en suspensión celular y en forma de célula única. Al obligarlas a pasar alineadas una a una frente a un haz láser mediante un flujo continuo, cada célula, a la vez que dispersa la luz, emite luz fluorescente como consecuencia de la excitación láser a la que es sometida. Los parámetros que típicamente se miden de forma simultánea por cada célula son:

1. Dispersión frontal de la luz a 2º (forward scatter), valor proporcional al tamaño celular.

2. Dispersión de la luz ortogonal (side scatter), proporcional a la cantidad de estructuras granulares o complejidad de la célula.

3. Intensidades de fluorescencia a diferentes longitudes de onda.

7.2. ESTRUCTURA BÁSICA DE UN CITÓMETRO DE FLUJO

Los citómetros de flujo están formados por complejos sistemas:

A) El sistema fluídico permite un enfoque hidrodinámico del flujo celular hasta conseguir el alineamiento de las partículas o células, y en los separadores celulares o “cell sorters”, se produce una rotura del flujo en gotas de tamaño uniforme para conseguir la separación de células individuales.

B) Los sistemas ópticos permiten el enfoque láser en un haz con un diámetro reducido para impactar sobre el menor número de partículas posibles simultáneamente.

Este sistema se compone de dos tipos de ópticas:

– La óptica de excitación, compuesta de el láser y las lentes apra enfocar y dirigir el haz de luz;

– La óptica de lectura, compuesta por las lentes de recolección de luz emitida luego de la interacción entre el haz del láser y las partículas y el sistema de espejos y filtros para direccionar longitudes de onda específicas hacia los detectores correspondientes.

Los FILTROS OPTICOS son aquellos que seleccionan las longitudes de onda que deja pasar hacia el detector. Estos pueden ser:

– DE INTERFERENCIA (Dicroicos que reflejan las long de onda no deseadas);

– DE ABSORCION (absorben las long de onda no deseadas). De éstos hay tres tipos:

– Filtros Band Pass : Dejan pasar un rango de longitudes de onda (Por ej: 620 – 640 nm)

– Filtros Short Pass: Dejan pasar por debajo de una longitud de onda determinada ( Por ej: < 575 nm)

– Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima de una longitud de onda determinada (Por ej: > 520 nm)

C) El sistema electrónico se encarga de la cuantificación de los destellos de fluorescencia y de la luz dispersada y, bajo el control del ordenador, se consigue la carga electrónica de las gotas que contienen las células de interés para poder someterlas a deflección y recogerlas en tubos específicos para tal fin, o sobre pocillos de cultivo de tejidos. El ordenador permite almacenar datos de miles de células por cada muestra, y representar los resultados gráficamente.

7.3. INFORMACION OBTENIDA POR CITOMETRIA DE FLUJO

Básicamente podemos obtener los siguientes datos:

– El tamaño celular relativo ( Forward Scatter o FSC)

– La complejidad interna o granularidad relativa (Side Scatter o SSC)

– Intensidades relativas de emisión de fluorescencia ( FL1, FL2, FL3 ,FL4…..etc..)

A través de dos tipos de señales:

A) Señales de dispersión.

La dispersión resulta de la interacción de la luz con una partícula que produce un cambio de dirección (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del espacio. Las características morfológicas que determinan la dispersión de la luz son fundamentalmente el tamaño celular, la membrana, el núcleo y el material granular del interior de la célula, llamado complejidad. En los Citómetros de Flujo se miden dos fracciones de dispersión:

-La luz dispersada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la dirección de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida proporcional al tamaño de la partícula que produce la dispersión.

-La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es proporcional a la complejidad de la estructura interna de la partícula. (WWW.CITOMETRIADEFLUJO.COM)

B) Señales de Fluorescencia.

Los citómetros de flujo permiten detectar señales de fluorescencia procedentes de complejos Antigeno/Anticuerpo marcados con un fluorocromo y situados en una célula, siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida igual a la proporción de la cantidad de componentes fluorescentes de la partícula.

7.4. ANÁLISIS DE DATOS

En general todos los citómetros presentan los datos en algunos formatos standard.

– Histograma: según un parámetro.

– Gráficos de puntos: Cualquier combinación de dos parámetros de los datos obtenidos para la población de células.

7.5. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Debido a la necesidad de utilizar una suspensión de partículas (células, núcleos, cromosomas, etc), para ser leídos de una en una hace que se pierda información sobre la arquitectura de los tejidos que componen las células o de las propias células, así como la ineracción entre estas y el medio que las rodea (patrones nodulares o difusos de los linfomas). Frente a este inconveniente la CMF presenta múltiples ventajas frente al microscópio de fluorescencia y las técnicas citoquímicas, como:

– Posibilidad de empleo de multiples frente a un solo marcaje de la citoquímica y la microscopia de fluorescencia.

– Posibilidad de analizar un elevado número de partículas en un corto período de tiempo (5000 partículas/segundo).

– Posibilidad de cuantificar la por medio de los canales medios de fluorescencia.

– Mayor sensibilidad y objetividad que le permiten detectar enfermedad mínima residual y caracterizar poblaciones celulares poco abundantes en condiciones normales como los basófilos.

– Posibilidad de analizar poblaciones celulares y epitopos celulares.

– Permite almacenar informáticamente la información del análisis para poderla utilizar en cualquier momento y reanalizar análisis hechos con anterioridad.

– Posibilidad de cuantificar las moléculas antigénicas presentes en un grupo celular.

7.6. QUÉ DATOS PODEMOS OBTENER DE LAS CÉLULAS UTILIZANDO UN CITÓMETRO DE FLUJO? A QUÉ VELOCIDAD?

La iluminación de las células con luz LASER nos permite conocer el tamaño y la complejidad de los diferentes tipos de células. Si agregamos el uso de moléculas fluorescentes para marcar estructuras celulares (por ej. ácido desoxirribonucleico o ADN, ácido ribonucleico o ARN, antígenos, etc.) se amplía enormemente sus posibilidades de detección. Dichas sustancias fluorescentes, al ser iluminadas por la luz LASER, emiten señales lumínicas en diferentes longitudes de onda (que son captadas por diferentes detectores) con lo cual podemos obtener valiosa información de las propiedades de una población celular. En un citómetro convencional logramos información sobre al menos 5 parámetros (por ejemplo tamaño, complejidad, contenido de ADN, viabilidad celular y presencia o ausencia de antígenos). Lo interesante de esta metodología es que no sólo aporta muchos datos en forma simultánea, sino que lo realiza a velocidades que parecen asombrosas porque es capaz de analizar al menos 1000 células en solamente un segundo!

Los citómetros de flujo de mayor complejidad son también capaces de clasificar a las células que resulten de interés para el investigador. Entendemos por clasificar la posibilidad de separar del resto a un conjunto de células que comparten una o varias propiedades y recolectarlas en un tubo, placa de cultivo o portaobjeto. Esto permite llevar a cabo estudios más sofisticados de una población de células similares, iniciar cultivos de un mismo tipo celular, etc. Para dar una idea de la especificidad del mecanismo de separación de los citómetros de flujo cabe mencionar que se emplean para separar los distintos tipos de cromosomas de la especie humana u otras especies. La obtención de suspensiones cromosómicas de elevada pureza mediante citometría de flujo ha permitido formidables avances en el conocimiento del genoma humano y en la obtención de sondas moleculares aplicables a diagnóstico citogenético de diversas patologías.

Explicar en detalle el mecanismo que se utiliza para clasificar los diferentes tipos de células o cromosomas excede los objetivos de esta introducción. Basta mencionar que para lograrlo se fragmenta la columna líquida en pequeñas gotitas haciendo vibrar la boquilla a más de 20.000 veces por segundo!. Luego de ajustes apropiados, se logra que cada gotita contenga una célula o cromosoma. Cuando el citómetro detecta una célula o cromosoma de interés para clasificar, el aparato carga eléctricamente la columna liquida de forma tal que sólo la gota que contiene el evento de interés (célula) queda cargada. Finalmente, el sistema direcciona dicha gota con la célula hacia un tubo recolector al ser desviada por un intenso campo eléctrico.

7.7. QUÉ APLICACIONES TIENEN LOS CITÓMETROS DE FLUJO EN LA INVESTIGACIÓN BÁSICA Y APLICADA?

El campo de aplicación de este tipo de instrumentos crece rápidamente día a día ya que son numerosas las áreas de la biología y medicina que se benefician de su uso. Entre otras aplicaciones, se encuentra la tipificación de las leucemias y los linfomas que permite alcanzar un diagnóstico preciso, permitiendo un tratamiento y seguimiento más adecuado y eficaz. Otra aplicación muy importante es el estudio de las poblaciones linfocitarias afectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) causante del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) que permite conocer en los individuos afectados su capacidad de respuesta inmunitaria, de capital importancia para el seguimiento de la evolución de la infección y el tratamiento adecuado para el paciente.

El estudio de la cantidad de material hereditario (ADN) posee numerosas aplicaciones. En medicina, se emplea para evaluar si existen cambios genéticos en poblaciones de células tumorales. La presencia de estos cambios tiene importancia en el prónostico de la enfermedad maligna. Dado el elevado número de células a analizar para realizar estos diagnósticos, el citómetro de flujo es la herramienta indicada para este tipo de estudios. También es posible estimar si las células han sufrido cambios relevantes en el ADN, así como evaluar su nivel de proliferación ya que con frecuencia las células malignas crecen con mayor rapidez que las normales. El citómetro es capaz de cuantificar el grado de proliferación celular, es decir la tasa con que las células se multiplican. En el campo de la biología, la citometría de flujo se ha tornado el método más empleado para determinar el contenido exacto de ADN de cada especie, lo cuál es de suma importancia para estudios genéticos, evolutivos y biotecnológicos. A su vez, se pueden realizar estudios del nivel de ploidia, análisis cromosómicos y estudios del daño del ADN.