La fluorescencia de la clorofila es la luz reemitida por las moléculas de clorofila durante el retorno de estados excitados a no excitados . Se utiliza como indicador de la conversión de energía fotosintética en plantas superiores , algas y bacterias . La clorofila excitada disipa la energía luminosa absorbida al conducir la fotosíntesis (conversión de energía fotoquímica), como calor en el enfriamiento no fotoquímico o por emisión como radiación de fluorescencia. Dado que estos procesos son procesos complementarios, el análisis de la fluorescencia de la clorofila es una herramienta importante en la investigación de plantas con un amplio espectro de aplicaciones.
El efecto Kautsky [ editar ]
Tras la iluminación de una hoja adaptada a la oscuridad, hay un rápido aumento de la fluorescencia del fotosistema II (PSII), seguido de un lento descenso. Primero observado por Kautsky et al., 1960 , esto se llama el Efecto Kautsky. Este aumento variable en el aumento de la fluorescencia de la clorofila se debe al fotosistema II. [2] La fluorescencia del fotosistema I no es variable, sino constante. [3]
El aumento de la fluorescencia se debe a que los centros de reacción delPSII se encuentran en un estado "cerrado" o químicamente reducido. [4]Los centros de reacción están "cerrados" cuando no se pueden aceptar más electrones. Esto ocurre cuando los aceptadores de electronesAguas abajo de PSII aún no han pasado sus electrones a un portador de electrones posterior, por lo que no pueden aceptar otro electrón. Los centros de reacción cerrados reducen la eficiencia fotoquímica general y, por lo tanto, aumentan el nivel de fluorescencia. La transferencia de una hoja de la oscuridad a la luz aumenta la proporción de centros de reacción cerrados del PSII, por lo que los niveles de fluorescencia aumentan durante 1-2 segundos. Posteriormente, la fluorescencia disminuye en unos pocos minutos. Esto es debido a; 1. más "enfriamiento fotoquímico" en el que los electrones se transportan fuera del PSII debido a las enzimas involucradas en la fijación de carbono; y 2. más "enfriamiento no fotoquímico" en el que más energía se convierte en calor.
Medición de fluorescencia [ editar ]
Por lo general, la medición inicial es el nivel mínimo de fluorescencia, . Esta es la fluorescencia en ausencia de luz fotosintética. [5]
Para usar las mediciones de la fluorescencia de la clorofila para analizar la fotosíntesis, los investigadores deben distinguir entre la extinción fotoquímica y la extinción no fotoquímica (disipación de calor). Esto se logra al detener la fotoquímica, lo que permite a los investigadores medir la fluorescencia en presencia de extinción no fotoquímica solo. Para reducir el enfriamiento fotoquímico a niveles insignificantes, se aplica un destello de luz corto y de alta intensidad a la hoja. Esto cierra de forma transitoria todos los centros de reacción del PSII, lo que evita que la energía del PSII pase a los portadores de electrones en sentido descendente. La extinción no fotoquímica no se verá afectada si el flash es corto. Durante el flash, la fluorescencia alcanza el nivel alcanzado en ausencia de cualquier enfriamiento fotoquímico, conocido como máxima fluorescencia. [5]
La eficiencia del enfriamiento fotoquímico (que es un proxy de la eficiencia del PSII) se puede estimar comparando A la producción constante de fluorescencia en la luz. y el rendimiento de la fluorescencia en ausencia de luz fotosintética. . La eficiencia del enfriamiento no fotoquímico se ve alterada por diversos factores internos y externos. Las alteraciones en la disipación de calor significan cambios en. La disipación de calor no se puede detener totalmente, por lo que no se puede medir el rendimiento de la fluorescencia de la clorofila en ausencia de enfriamiento no fotoquímico. Por lo tanto, los investigadores utilizan un punto adaptado a la oscuridad () con la que comparar estimaciones de extinción no fotoquímica. [5]
Parámetros de fluorescencia comunes [ editar ]
: Mínima fluorescencia (unidades arbitrarias). Nivel de fluorescencia de la muestra adaptada a la oscuridad cuando todos los centros de reacción del fotosistema II están abiertos.
: Máxima fluorescencia (unidades arbitrarias). Nivel de fluorescencia de la muestra adaptada a la oscuridad cuando se ha aplicado un pulso de alta intensidad. Todos los centros de reacción del fotosistema II están cerrados.
: Mínima fluorescencia (unidades arbitrarias). Nivel de fluorescencia de la muestra adaptada a la luz cuando todos los centros de reacción del fotosistema II están abiertos; se baja con respecto a por enfriamiento no fotoquímico.
: Máxima fluorescencia (unidades arbitrarias). Nivel de fluorescencia de la muestra adaptada a la luz cuando se ha aplicado un pulso de alta intensidad. Todos los centros de reacción del fotosistema II están cerrados.
: Fluorescencia terminal en estado estacionario (unidades arbitrarias). El nivel de fluorescencia en estado estable disminuyó (= se detuvo) por procesos fotoquímicos y no fotoquímicos.
: Medio tiempo de subida desde a .
Parámetros calculados [ editar ]
Es la relación de fluorescencia variable a fluorescencia máxima. Calculado como. [7] Esta es una medida de la eficiencia máxima de PSII (la eficiencia si todos los centros de PSII estuvieran abiertos). se puede utilizar para estimar la eficiencia potencial de PSII tomando medidas adaptadas a la oscuridad.
Mide la eficiencia del fotosistema II. Calculado como = . [8] Este parámetro mide la proporción de luz absorbida por el PSII que se utiliza en la fotoquímica. Como tal, puede dar una medida de la tasa de transporte de electrones lineal y, por lo tanto, indica la fotosíntesis general.
(extinción fotoquímica). Calculado como. [9] Este parámetro aproxima la proporción de centros de reacción PSII que están abiertos.
Mientras que da una estimación de la eficiencia, y Indícanos qué procesos han alterado la eficiencia. El cierre de los centros de reacción como resultado de una luz de alta intensidad alterará el valor de. Los cambios en la eficiencia del enfriamiento no fotoquímico alterarán la relación.
Aplicaciones de la teoría [ editar ]
Rendimiento PSII como una medida de la fotosíntesis [ editar ]
La fluorescencia de la clorofila parece ser una medida de la fotosíntesis, pero esto es una simplificación excesiva. La fluorescencia puede medir la eficiencia de la fotoquímica PSII, que se puede utilizar para estimar la velocidad del transporte de electrones lineal mediante la multiplicación de la intensidad de la luz. Sin embargo, los investigadores generalmente se refieren a la fijación de carbono cuando se refieren a la fotosíntesis. El transporte de electrones y la fijación de CO 2 pueden correlacionarse bien, pero pueden no correlacionarse en el campo debido a procesos como la fotorrespiración, el metabolismo del nitrógeno y la reacción de Mehler .
Relacionando el transporte de electrones a la fijación de carbono [ editar ]
Una poderosa técnica de investigación es medir simultáneamente la fluorescencia de la clorofila y el intercambio de gases para obtener un panorama completo de la respuesta de las plantas a su entorno. Una técnica consiste en medir simultáneamente la fijación de CO 2 y la fotoquímica PSII a diferentes intensidades de luz, en condiciones no fotorrespiratorias. Una parcela de CO 2 de fijación y la fotoquímica PSII indica el requisito de electrones por molécula de CO 2 fijo. A partir de esta estimación, se puede estimar la extensión de la fotorrespiración . Esto se ha utilizado para explorar el significado de la fotorrespiración como un mecanismo fotoprotector durante la sequía.
El análisis de fluorescencia también se puede aplicar para comprender los efectos de temperaturas bajas y altas.
- Sobrado (2008) [10] investigó el intercambio de gases y la clorofila a las respuestas de fluorescencia de luz de alta intensidad, de especies pioneras y especies forestales. El intercambio de gases de la hoja del mediodía se midió utilizando un sistema de fotosíntesis , que mide la tasa de fotosíntesis neta, gs y la concentración de CO 2 intercelular (). En las mismas hojas utilizadas para las mediciones de intercambio de gases, la clorofila y los parámetros de fluorescencia (inicial,; máximo,; y variable,) se midieron utilizando un fluorómetro. Los resultados mostraron que, a pesar de que las especies pioneras y las especies forestales que ocupan hábitats diferentes, ambas mostraron una vulnerabilidad similar a la fotoinhibición del mediodía en las hojas expuestas al sol.
Medición de estrés y tolerancia al estrés [ editar ]
La fluorescencia de clorofila puede medir la mayoría de los tipos de estrés de las plantas . La fluorescencia de clorofila se puede usar como un proxy del estrés de la planta porque las tensiones ambientales, por ejemplo, temperaturas extremas, disponibilidad de luz y agua, pueden reducir la capacidad de una planta para metabolizar normalmente. Esto puede significar un desequilibrio entre la absorción de energía luminosa por la clorofila y el uso de energía en la fotosíntesis. [11]
- Favaretto et al. (2010) [12] investigaron la adaptación a un entorno de luz fuerte en las especies pioneras y tardías de la sucesión, cultivadas en 100% y 10% de luz. Se midieron numerosos parámetros, incluida la clorofila y la fluorescencia. Una mayor disminución enbajo luz solar plena en las especies de sucesión tardía que en las especies pioneras se observó. En general, sus resultados muestran que las especies pioneras se desempeñan mejor bajo la luz solar alta que las especies de sucesión tardía, lo que sugiere que las plantas pioneras tienen una mayor tolerancia potencial al daño fotooxidativo.
- Neocleous y Vasilakakis (2009) [6] investigaron la respuesta de la frambuesa al boro y al estrés salino . Se utilizó un fluorómetro de clorofila para medir., y . La fluorescencia de la clorofila de la hoja no se vio afectada significativamente por la concentración de NaCl cuando la concentración de B fue baja. Cuando se incrementó B, la fluorescencia de la clorofila de la hoja se redujo en condiciones salinas. Se podría concluir que el efecto combinado de B y NaCl en las frambuesas induce un efecto tóxico en los parámetros fotoquímicos.
- Lu y Zhang (1999) estudiaron el estrés por calor en las plantas de trigo y encontraron que la estabilidad de la temperatura en el fotosistema II de las hojas con estrés hídrico se correlaciona positivamente con la resistencia en el metabolismo durante la fotosíntesis. [13]
Índice de Equilibrio de Nitrógeno [ editar ]
Debido a la relación entre el contenido de clorofila y el contenido de nitrógeno en las hojas, los fluorómetros de clorofila se pueden usar para detectar la deficiencia de nitrógeno en las plantas, por varios métodos .
Sobre la base de varios años de investigación y experimentación, los polifenoles pueden ser los indicadores del estado de nitrógeno de una planta. Por ejemplo, cuando una planta está en condiciones óptimas, favorece su metabolismo primario y sintetiza las proteínas (moléculas de nitrógeno) que contienen clorofila y pocos flavonoles (compuestos secundarios basados en el carbono). Por otro lado, en caso de falta de nitrógeno, observaremos una mayor producción de flavonoles por parte de la planta. [14]
El NBI (Nitrogen Balance Index) de Force-A permite evaluar las condiciones de nitrógeno de un cultivo calculando la proporción entre clorofila y flavonoles (relacionada con la asignación de nitrógeno / carbono).
Medir contenido de clorofila [ editar ]
Gitelson (1999) declara: "Se encontró que la relación entre la fluorescencia de la clorofila a 735 nm y el rango de longitud de onda de 700 nm a 710 nm, F735 / F700 es linealmente proporcional al contenido de clorofila (con coeficiente de determinación, r2, más de 0.95) y, por lo tanto, esta relación se puede utilizar como un indicador preciso del contenido de clorofila en las hojas de las plantas ". [15]
Fluorómetros de clorofila [ editar ]
El desarrollo de fluorómetros permitió que el análisis de fluorescencia de clorofila se convirtiera en un método común en la investigación de plantas. El análisis de fluorescencia de clorofila ha sido revolucionado por la invención de la técnica de modulación de amplitud de pulso (PAM) [16] [17] y la disponibilidad del primer fluorómetro de clorofila modulado comercial PAM-101 (Walz, Alemania). Mediante la modulación del haz de luz de medición (pulsos de microsegundos) y la detección paralela de la fluorescencia excitada, el rendimiento relativo de fluorescencia (Ft) se puede determinar en presencia de luz ambiental. De manera crucial, esto significa que la fluorescencia de la clorofila se puede medir en el campo incluso a plena luz solar. [5]
Hoy en día, los fluorómetros de clorofila están diseñados para medir muchos mecanismos de plantas diferentes. Los protocolos de medición: F V / F M y OJIP miden la eficiencia de las muestras del fotosistema II en un estado común y conocido, adaptado a la oscuridad. Estos protocolos son útiles para medir muchos tipos de estrés de la planta. [18] El protocolo de medición adaptado a la luz de Bernard Genty ΔF / F M ', o Y (II), es una forma efectiva y sensible de medir muestras de plantas en condiciones de iluminación ambiental o artificial. [19] Sin embargo, dado que los valores de Y (II) también cambian con la intensidad de la luz, se deben comparar las muestras a la misma intensidad de luz, a menos que el enfoque de la medición sea el estrés de la luz. Y (II) puede ser más sensible a algunos tipos de estrés de las plantas que FV / F M , como el estrés por calor. [20]
También se han desarrollado otros protocolos de medición de mecanismos de plantas. Cuando un cloroplasto absorbe luz, parte de la energía de la luz se destina a la fotoquímica, otra parte a la disipación de calor regulada y otra a la disipación de calor no regulada. [21] Existen varios parámetros de medición de fluorescencia de clorofila para medir todos estos eventos. En el modelo de lago, q L mide el enfriamiento fotoquímico, Y (NYO) mide la disipación de calor regulada por la planta, y Y (NO) mide la disipación de calor no regulada. [21] Un protocolo de enfriamiento más antiguo, llamado modelo de charco, usa q P para el enfriamiento fotoquímico, q Npara la extinción no fotoquímica de la disipación de calor tanto regulada como no regulada y NPQ para una estimación de la extinción no fotoquímica. [22] NPQ también ha sido resucitado al modelo de lago matemáticamente. [23]
Además, los parámetros q E y pNPQ se han desarrollado para medir el ciclo fotoprotector de la xantofila. [24] [25] q T es una medida de las transiciones de estado. [26] q M es una medida de la migración del cloroplasto, [27] y q I es una medida de la fotoinhibición de la planta. [28]
A niveles de luz actínica más bajos NPQ = qE + qT + qI [24]
A altos niveles de luz actínica NPQ = qE + qM = qI [27]
Algunos fluorómetros están diseñados para ser portátiles y operados en una mano.
El desarrollo ulterior constante en fluorómetros de imágenes facilita la visualización de las heterogeneidades espaciales en la actividad fotosintética de las muestras. Estas heterogeneidades ocurren naturalmente en las hojas de las plantas, por ejemplo, durante los crecimientos, diversos estreses ambientales o la infección por patógenos. Por lo tanto, el conocimiento sobre las heterogeneidades de la muestra es importante para la correcta interpretación del rendimiento fotosintético de la muestra de la planta. Los sistemas de fluorómetro de imágenes de alto rendimiento ofrecen opciones para analizar células individuales / cloroplastos individuales, así como áreas de muestra que cubren hojas enteras o plantas.
Los enfoques alternativos [ editar ]
Sensores LIF [ editar ]
Las técnicas basadas en el efecto Kautsky no agotan la variedad de métodos de detección y evaluación basados en la fluorescencia de la clorofila. En particular, los avances recientes en el área de la fluorescencia inducida por láser (LIF) también brindan la oportunidad de desarrollar sensores suficientemente compactos y eficientes para el estado fotofisiológico y las evaluaciones de biomasa. En lugar de medir la evolución del flujo de fluorescencia total, tales sensores registran la densidad espectral de este flujo excitado por fuertes pulsos de luz de láser monocromático de duración de nanosegundos. No requiere un período de adaptación a la oscuridad de 15-20 minutos (como es el caso de los métodos de efecto Kautsky [29] ) y es capaz de excitar la muestra desde una distancia considerable, los sensores LIF pueden proporcionar una evaluación rápida y remota.
- La aplicación de la técnica LIF a la evaluación del estrés por sequía en el alcornoque ( Quercus suber ) y el pino marítimo ( Pinus pinaster ) sobre la base de la relación de emisión de clorofila I 685 / I 740 se describe en la Ref. [30] Recientemente, la técnica de detección de LIF se aprovechó para abordar el papel de la proteína pPLAIIα en la protección del metabolismo fotosintético durante el estrés por sequía utilizando plantas de Arabidopsis modificadas genéticamente. [31]
- En 2011, Vieira et al. se aplicó un sensor LIF de bajo costo compacto [32] (construido alrededor de un láser Nd: YAG de estado sólido con conmutación de Q con frecuencia duplicada y un espectrómetro de fibra óptica en miniatura comercial especialmente modificado Optica USB4000) para estudiar las comunidades de microfitobentos intermareal. La emisión de clorofila permitió a los investigadores evaluar adecuadamente la biomasa de la superficie y rastrear los ritmos migratorios de las microalgas epénticas bentónicas en sedimentos fangosos.
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