Neurobioquímica

Esclerosis multiple
    La esclerosis múltiple es una enfermedad del sistema nervioso central que afecta al cerebro y la médula espinal. Las fibras nerviosas están envueltas y protegidas con mielina, una sustancia compuesta por proteínas y grasas, que facilita la conducción de los impulsos eléctricos entre ellas. Si la mielina es destruida o dañada, la habilidad de los nervios para conducir los impulsos eléctricos, desde y al cerebro, se interrumpe y este hecho produce la aparición de los síntomas de la enfermedad: la esclerosis múltiple.
    La esclerosis múltiple (EM), hace referencia a la aparición de placas o parches de desmielinización esparcidos por todo el Sistema Nervioso Central, se considera una enfermedad desmielinizante  por compartir dos características importantes con estas; Lesiones limitadas a la sustancia blanca del Sistema Nervioso Central y pérdida de mielina en las lesiones, se denomina Esclerosis múltiple por la multiplicidad de las lesiones y de su aspecto estático,  en las secciones de las muestras microscópicas del SNC. El efecto principal de la desmielinización es impedir la conducción eléctrica saltatoria desde un nodo de Ranvier, en el que se concentran los canales de sodio, hacia el siguiente nodo.

Patología
    Placas o parches de desmielinización esparcidos por todo el SNC, observables en cortes de diencéfalo y médula, por la presencia de color sonrosado grisáceo  (a causa de la pérdida de mielina) que sobresale de la sustancia blanca circundante, presenta una delimitación precisa, pues no afecta más allá de las zonas de entrada de las raíces de los nervios craneales y raquídeos, las lesiones se distribuyen al azar a lo largo del tallo encefálico.
    Se ha observado remielinización ineficaz de los parches en Esclerosis múltiple, pues cuando esta ocurre, se producen capas de mielina muy delgadas creando las llamadas placas de sombra. Por medio de pruebas histologicas se ha demostrado que en las zonas desmielinizadas no solo se destruyen algunos oligodendrocitos, sino que los restantes tienen poca  capacidad para proliferar, lo que sucede es que hay entrada de células oligodendrogliales precursoras que maduran hasta convertirse en oligodendrocitos y proporcionan a  los axones residuales nueva mielina.Sintomatología
    Los síntomas de la esclerosis múltiple varían en función de la parte del sistema nervioso central afectada. Al inicio de la enfermedad son habitualmente leves y desaparecen sin tratamiento. Pero con el tiempo pueden llegar a ser más numerosos y severos.
 Los síntomas más frecuentes son: debilidad muscular o falta de fuerza, hormigueo, poca coordinación, fatiga, trastornos del equilibrio, alteraciones visuales, temblor, espasticidad o rigidez muscular, trastornos del habla, trastornos intestinales o urinarios, deambulación inestable (ataxia), trastornos de la función sexual, sensibilidad al calor, trastornos de memoria y trastornos cognitivos entre otros. Hay que remarcar que la mayoría de personas con esclerosis múltiple no tienen todos estos síntomas.
Existen varias formas de evolución de la esclerosis múltiple: Remitente-recurrente: la enfermedad evoluciona con síntomas o signos de instauración aguda o subaguda que mejoran total o parcialmente (brotes) y Secundaria Progresiva: su evolución es progresiva desde su inicio.
    Síntomas y signos tempranos: En la mayoría, los síntomas iniciales son debilidad, adormecimiento o ambos, en una o más extremidades. A menudo se produce también hormigueo de las extremidades y sensaciones de una banda apretada alrededor del tronco o las extremidades. Los síndromes clínicos resultantes varían entre el simple arrastre o el mal control de una o ambas piernas hasta paraparesia espástica o atáxica, puede haber además desaparición de los reflejos abdominales y grados variables de pérdida sensitiva profunda y superficial, una queja frecuente es dolor sordo  en al parte baja de la espalda, aunque no es clara su relación con las lesiones de la esclerosis múltiple, es poco frecuente el dolor agudo, quemante, mal localizado en una extremidad o parte definida del tronco; son dos síndromes particulares, entre los modos más típicos de iniciación de la EM, a menudo característicos de la enfermedad; la neuritis óptica y la llamada mielitis transversal, aunque éstas en un momento dado podrían representar a una enfermedad distinta a la esclerosis múltiple.
Neuritis óptica. Consiste en perdida parcial o total de la visión en un ojo, de evolución rápida durante un periodo de varias horas o unos días, rara vez es sostenida durante varios meses, algunos pacientes experimentan antes de la pérdida visual dolor dentro de la órbita. Cerca de la tercera parte de pacientes que experimentan este síndrome, se recuperan completamente, y la mayoría de los restantes mejoran en grado importante. La mayoría de los pacientes que presentan Neuritis óptica, terminan  desarrollando esclerosis múltiple, este riesgo es mucho más bajo si se produce en la infancia. Otros trastornos oftálmicos que tienen una incidencia mayor que la esperada en estos pacientes son la uveítis y la formación de vainas de los vasos retinianos.
Mielitis transversal aguda. Esta es la designación frecuente para una lesión desmielinizante inflamatoria de evolución aguda en la médula espinal, que resulta ser en la mayoría de los casos una expresión de EM, desde el punto de vista clínico, la enfermedad se caracteriza por paraparesia de evolución rápida, nivel sensorial en el tronco, disfunción esfinteriana y signos de Babinsky bilaterales.
    Otras manifestaciones  iniciales de EM en orden decreciente de frecuencia, son inestabilidad de la marcha, síntomas del tallo cerebral (diplopía, vértigos, vómitos) y trastornos de la  micción. En una pequeña proporción de los casos se producen manifestaciones definidas, como hemiplejía, neuralgia del trigémino u otros síndromes dolorosos, parálisis facial, sordera o convulsiones. No es raro que la enfermedad se inicie con nistagmo y ataxia, con debilidad y espasticidad de las extremidades, lo cual demuestra afección de las vías cerebelosas y corticoespinales. Ocurren a menudo síntomas de disfunción vesical, la fatiga a menudo transitoria es otro síntoma peculiar de la EM.
Síntomas posteriores de la enfermedad.
Manifiestan síntomas que señalan afección de nervios ópticos, tallo cerebral, cerebelo y médula espinal, paraparésia espástica asimétrica, hay un numero grande de pacientes que presentan depresión, irritabilidad y mal humor, pérdida de la memoria de retención, demencia global.
    Esta sintomatología, va apareciendo a medida que la lesión se disemina a lo largo del SNC, dado que al inicio la lesión es leve el diagnóstico puede ser incierto. Entre algunas manifestaciones secundarias se consideran; infecciones del tracto urinario, alteraciones nutricionales, trastornos emocionales, contracturas articulares, inestabilidad.
    Pueden presentarse síntomas por inducción temporal, por el calor o el ejercicio, como visión borrosa unilateral o de hormigueo y debilidad de una extremidad. Se ha demostrado desde el punto de vista experimental que estos fenómenos representan sensibilidad extrema de la conducción en las fibras nerviosas desmielinizantes a la elevación de la temperatura.
Causales
    Hasta 1988 en algunos textos se atribuía como causante de esta alteración neurológica un virus, o una respuesta inmunitaria anormal (por la presencia de agrupación de linfocitos y células plasmáticas alrededor de las venas), o por anormalidad en las células productoras de mielina.
    A partir de entonces, se han desarrollado múltiples estudios para obtener información acerca de factores que participan en el desarrollo de la enfermedad, como son rangos de edad más frecuente en los cuales se presenta, encontrando que en niños es muy baja, llegando a un nivel máximo de desarrollo a  los 30 años; en mujeres  es más elevada la frecuencia que en varones , algunos estudios  afirman que el desarrollo de la enfermedad es mas alto en habitantes rurales que en urbanos.
    Actualmente se habla del riesgo de desarrollar la esclerosis múltiple al incrementar la latitud. Estudios realizados, demuestran que la EM se relaciona con localidades particulares más que con un grupo étnico determinado, poniendo de relieve la importancia de los factores ambientales en la génesis de la enfermedad. En cuanto al riesgo familiar, aún no está muy claro, pero se sabe que el más alto se presenta en los hermanos. El aspecto de la herencia se encuentra apoyado con estudios realizados en gemelos  de los cuales se sabe que uno de ellos tiene EM, aunque no ha surgido ningún patrón de herencia mendeliana sostenido dentro de las familias que tienen más de un miembro afectado, otro factor que apoya la participación de un factor genético en la causación de EM es el descubrimiento de que ciertos antígenos de Histocompatibilidad (HLA) son más frecuentes en los pacientes con EM que en los sujetos testigos.
    Con respecto a los factores celulares, la atención se ha centrado en los últimos años en la función patogenética de los Linfocitos T que regulan las reacciones inmunológicas ya sea como potencializadores (células T auxiliares) o como inhibidores (células T supresoras) de la producción de inmunoglobulina por los Linfocitos B. Las llamadas células t auxiliares se encuentran en abundancia en las placas de EM y rodeando a las venulas. Se ha demostrado que los receptores de las células T reaccionan a los antígenos de presentados por las moléculas del complejo mayor de Histocompatibilidad II. Se cree que esta reacción estimula la proliferación de células T, activación de células B y secreción de citocinas (interferon beta e interferon gama), estos sucesos celulares se encargan de destrucción de la barrera hematocerebral, y si son de intensidad suficiente de destrucción de oligodendrocitos y la mielina.
    Aún no han podido definirse por completo los mecanismos inmunológicos que operan en la génesis de la esclerosis múltiple, es más, no se ha podido identificar un autoantígeno.
Tratamiento
    Todavía no se dispone de ningún medicamento capaz de "curar" la EM, aunque esto no significa que no exista tratamiento. Debido a que cada paciente afectado de EM evoluciona de manera distinta existen diferentes tratamientos.
A grandes rasgos se puede hablar de:
- Tratamientos dirigidos a modificar la evolución natural de la enfermedad.
- Tratamientos que se destinan a paliar la presencia de síntomas que interfieren en las actividades cotidianas o las complicaciones.
- Tratamiento rehabilitador.
    Simplificar el tratamiento farmacológico es muy difícil, dado que cada enfermo es diferente. Cada paciente debe ponerse en contacto con su neurólogo, que es la persona que mejor conoce su caso y tipo de enfermedad y puede informarle sobre los tratamientos que podrían ser eficaces en su caso.
    Se han propuesto numerosos tratamientos, de los cuales ninguno ha mostrados total eficacia, dado que disminuyen algunas de los síntomas, más no erradican la enfermedad por completo, la mayoría incluyen fármacos antinflamatorios como metilpresdnosilona seguida por dosis orales elevadas de prednisona, para abortar o acortar las exacerbaciones agudas o subagudas de EM o la neuritis óptica e inmunosupresores, los cuales modifican la reactividad inmunitaria, entre estos se encuentran fármacos como azatioprina y ciclofosfamida. Para tratar el problema de la fatiga en pacientes con EM se emplea Amantadina y Pemolina.
    Hay dos nuevas formas de tratamiento que parecen promisorias para alterar en grado modesto la evolución natural de la enfermedad, como son el interferón beta inyectado por vía subcutánea el cual disminuye la frecuencia y la gravedad de los ataques y el número de lesiones de la EM, en este hay pruebas de que disminuye la desmielinización, pero, presenta otras complicaciones que recientemente han sido demostradas con el estudio realizado por Bramanti 1998, quien plantea que se ha demostrado el aumento de la espasticidad durante el tratamiento con interferon beta, pues en su estudio, 15 de 19 pacientes tratados, aumentaron la espasticidad después de dos meses,  sin embargo al retirar el interferon  esta persiste poco tiempo mientras se estabiliza, sugiriendo que este tratamiento no puede ser usado en todos los pacientes con esclerosis múltiple.
    Otro inconveniente se presenta con el tratamiento con Azatioprine, pues en el estudio realizado por Confaureux 1996, se plantea el incremento en el riesgo de desarrollar cáncer en pacientes que presentan EM y son tratados con esta droga durante más de diez años.

Encefalopatía hepática (coma hepático).
    Es un conjunto de síntomas que se pueden producir cuando se presenta un daño cerebral y del sistema nervioso como complicación una enfermedad hepática y se caracterizan por varios síntomas neurológicos como cambios en el estado de conciencia, cambios en el comportamiento y cambios de personalidad.

Causas, incidencia y factores de riesgo.
    La encefalopatía hepática se produce por problemas que afectan el hígado como aquellos que reducen la función hepática (tales como la cirrosis o la hepatitis) y por condiciones en las cuales la circulación sanguínea se desvía y y no irriga el hígado. La causa exacta del problema se desconoce. El hígado no puede metabolizar y destoxificar las sustancias en el cuerpo, por lo tanto la acumulación de sustancias tóxicas produce anomalías metabólicas que conducen a un daño en el sistema nervioso central (el cerebro y la médula espinal). La sustancia tóxica más común es el amoníaco, el cual se produce en el cuerpo cuando las proteínas son digeridas y por lo general es destoxificado por el hígado; además muchas otras sustancias también se acumulan en el cuerpo y dañan el sistema nervioso.
    Por otra parte, en los pacientes que presenten problemas hepáticos estables, la encefalopatía hepática se puede desencadenar debido a episodios de sangrado gastrointestinal, consumo excesivo de proteína dietética o anomalías electrolíticas (especialmente la reducción de potasio, que puede ser consecuencia del vómito o de tratamientos como los diuréticos o la paracentesis). El problema también puede ser provocado por cualquier condición que produzca alcalosis (pH alcalino de la sangre), los niveles bajos de oxígeno en el cuerpo, el uso de medicamentos que deprimen el sistema nervioso central (tales como los barbitúricos o los tranquilizantes como la benzodiazepina, las infecciones como la hepátitis viral, la obstrucción del conducto biliar, la cirugía o cualquier enfermedad coincidente.
    Los problemas que imitan o enmascaran los síntomas de la encefalopatía hepática son entre otros el síndrome de Reye, la intoxicación con alcohol, una sobredosis de sedantes, el síndrome de deprivación del alcohol , el síndrome de Wernicke-Korsakoff, un hematoma subdural, la meningitis, las anomalías metabólicas tales como la glucosa en sangre baja y la enfermedad de Wilson.
    La encefalopatía hepática afecta a aproximadamente 4 de cada 100.000 personas y puede presentarse como un problema agudo y potencialmente reversible o como un problema progresivo y crónico.

Prevención
    El tratamiento de los problemas hepáticos puede prevenir algunos casos de encefalopatía hepática, ya que éste tratamiento incluye especialmente la restricción de proteína dietética (fuente principal de amoníaco). Si se sabe o se sospecha que una persona padece enfermedad hepática y presenta algunos síntomas neurológicos, debe ser remitida al médico inmediatamente.

Síntomas

• Cambios en el estado mental (estado de conciencia, el comportamiento y la personalidad olvido ; confusión, desorientación ; delirio (confusión aguda con un nivel fluctuante del estado de conciencia) ; demencia (pérdida de memoria, del intelecto, del razonamiento y de otras funciones); cambios en el temperamento ; disminución de la agudeza mental, somnolencia durante el día; disminución de la comprensión, estupor progresivo; coma).

• Reducción de la capacidad del autocuidado.
• Deterioro de la escritura o pérdida de otros movimientos finos de la mano.
• Temblor muscular brusco.
• Espasticidad o rigidez muscular.
• Convulsiones (raro).
• Deterioro del lenguaje.
• Movimiento incontrolable.
• Movimiento disfuncional.
• Agitación

Signos y exámenes. 
    Los síntomas neurológicos pueden variar. El asterixis (temblor muscular brusco como de aleteo) se puede observar durante los movimientos voluntarios, como cuando la persona intenta sostener sus brazos al frente de su cuerpo (que se muestra como un signo de Babinski positivo). Se puede sospechar o conocer la presencia de la enfermedad del hígado debido a la piel ictérica (ojos y piel amarillos) y por la ascitis (acumulación de líquidos en el abdomen) que se reconoce por el aumento del peso corporal, el agrandamiento abdominal y el examen que muestra líquido libre en el abdomen. Algunas veces, hay un olor rancio característico del aliento y la orina. 

 

    Los exámenes de sangre pueden ser inespecíficos o pueden revelar una insuficiencia hepática.

• La química sanguínea puede mostrar un nivel bajo de albúmina, aumento de bilirrubina u otras anomalías.
• Los niveles de amoníaco en el suero por lo general son altos.
• El tiempo de protrombina se puede prolongar y no es corregible con vitamina K.
• Una tomografía computarizada de la cabeza puede mostrar resultados normales o puede revelar una atrofia general (pérdida de tejido).
• Un EEG (electroencefalograma que es una lectura de la actividad eléctrica del cerebro) revela anomalías características.

Ictericia 
    La ictericia es una pigmentación amarillenta de la piel y del blanco de los ojos (esclerótica), producida por valores anormalmente elevados de pigmentos biliares (bilirrubina) en la sangre. Los glóbulos rojos antiguos o con alteraciones se eliminan de la circulación sanguínea, principalmente a través del bazo. Durante este proceso, la hemoglobina (sustancia contenida en los glóbulos rojos que transporta el oxígeno) se transforma en bilirrubina. Ésta llega al hígado y se excreta al intestino como un componente de la bilis. Si se obstaculiza la excreción de bilirrubina, el exceso de ésta vuelve a la sangre provocando ictericia. Las altas concentraciones de bilirrubina en la sangre pueden aparecer cuando una inflamación u otras irregularidades de las células hepáticas impiden su excreción a la bilis. 
    Por otro lado, los conductos biliares que se hallan fuera del hígado pueden ser obstruidos por un cálculo biliar o por un tumor. También, aunque es menos frecuente, esta alta concentración de bilirrubina en la sangre puede ser el resultado de la destrucción de un gran número de glóbulos rojos, como a veces es el caso de los recién nacidos con ictericia.
    En el síndrome de Gilbert, los valores de bilirrubina aumentan ligeramente, pero no lo suficiente como para provocar ictericia. Esta afección, a veces hereditaria, suele descubrirse casualmente con un análisis de función hepática, pero no se acompaña de otros síntomas ni causa mayores problemas. 

Tratamiento. 
    La encefalopatía hepática es una condición médica aguda, que puede llegar a representar una emergencia médica y requerir de hospitalización. 
    Los objetivos del tratamiento son, entre otros, brindar una terapia de soporte para mantener la vida, eliminar o tratar los factores precipitantes y eliminar o neutralizar el amoníaco y otras toxinas. La terapia de soporte para mantener la vida puede incluir soporte respiratorio o circulatorio, especialmente cuando se presenta coma. Ademas, se puede desarrollar un edema cerebral (hinchazón del cerebro) que puede ser mortal. 
    Se deben identificar y tratar los factores precipitantes: el sangrado gastrointestinal debe detenerse por medio de una endoscopia, de una cauterización o de otros medios utilizados para controlar los sangrados y la sangre que está en los intestinos debe extraerse, ya que ésta se descompone en sustancias proteínicas que posteriormente se convierten en amoníaco. Es muy importante tratar las infecciones, la insuficiencia renal y las anormalidades en los niveles de electrolitos (especialmente potasio) . 
    Para reducir la producción de amoníaco se recomienda disminuir o suspender el consumo de proteína en la dieta; además son más tolerables las proteínas de origen vegetal que las de origen animal y puede ser necesaria la alimentación con fórmulas especiales por vía intravenosa o entérica (alimentación por sonda) 
    La lactulosa previene la absorción de amoníaco de los intestinos y actúa como un laxante que facilita la evacuación de sangre intestinal. La neomicina se puede suministrar por vía oral para disminuir la cantidad de amoníaco que producen las bacterias intestinales. Por otra parte, se deben evitar los sedantes, los tranquilizantes o cualquier otro medicamento que sea metabolizado o excretado por el hígado, al igual que los medicamentos que contengan amoníaco (como ciertos antiácidos). Finalmente, se pueden recomendar otros medicamentos y tratamientos que ofrecen resultados variables

Expectativas (pronóstico).
    La encefalopatía hepática aguda puede ser reversible, mientras que las formas crónicas de la enfermedad son a menudo progresivas; ambas pueden ocasionar un coma irreversible y la muerte, con una tasa de mortalidad de aproximadamente el 80 % si el coma se desarrolla. La recuperación y la recurrencia de esta condición son variables.

Complicaciones.

• Edema cerebral (hinchazón del cerebro).
• Herniación cerebral
• Coma progresivo irreversible.
• Pérdidas neurológicas permanentes (motricidad, sensibilidad o estado mental).
• Aumento del riesgo de:
• sepsis
• insuficiencia respiratoria
• colapso cardiovascular
• insuficiencia renal
• Efectos secundarios de los medicamentos.

Situaciones que requieren asistencia médica. 
    Se debe buscar asisntencia médica si se presenta cualquier cambio en el estado mental o en cualquier otra función neurológica, especialmente si la persona tiene o presume que tiene una enfermedad hepática. La encefalopatía hepática puede progresar rápidamente y convertirse en una condición crítica.



Discinesias (Diskinesias). 
    Alteración de los movimientos voluntarios, incluyendo ciertos tipos de movimientos involuntarios anómalos o hipercinesias, producidos especialmente por el consumo de fármacos. Las discinesias pueden ser coreiformes (no repetitivas, rápidas, espasmódicas y cuasi intencionadas), atetoides (continuas, lentas, sinuosas, anárquicas) o movimientos rítmicos en determinadas regiones corporales que disminuyen con los movimientos voluntarios de la parte afectada y aumentan con los movimientos voluntarios de la zona intacta. Las discinesias son conocidos efectos secundarios de los neurolépticos y, aunque no se ha establecido una clara relación causa-efecto, también se han descrito con muchos otros fármacos, tales como levodopa, anfetaminas, apomorfina, metilfenidato, fenfluramina, amantadina, inhibidores de la monoaminoxidasa, metoclopramida, antidepresivos tricíclicos, fluoxetina y otros inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina, antihistamínicos, anticonvulsivos, sales de litio y estrógenos. Las discinesias producidas por la mayoría de estos fármacos casi siempre son reversibles. La intensidad de la discinesia depende principalmente del estado de vigilia del sujeto: así, cuanto más alerta está el individuo, más pronunciada es la discinesia y cuanto más somnoliento está, menos pronunciada. Los síntomas de discinesia tardía desaparecen durante el sueño. Los movimientos que no se consideran discinesias son las crisis epilépticas parciales continuas, amaneramiento, mioclonías, estereotipias y temblores, así como también se excluyen los tics yatrógenos, las distonías crónicas y la acatisia debido a que su anatomopatología, fenomenología, evolución y tratamiento son diferentes de los de la discinesia tardía. Aunque pueden aparecer discinesias en ancianos de forma espontánea, en ausencia de enfermedad médica o fármacos, son infrecuentes y explican sólo algunos casos aislados de discinesias bucofaciales.

Diskinesias tardías y GABA.
        Los estudios farmacológicos y bioquímicos en el hombre y en animales, sugieren que la hiperkinesia tardía reversible, depende de una disminución primaria de la neurotransmisión dopaminérgica causada por el tratamiento neuroléptico y secundariamente una actividad dopaminérgica relativa, debida a: hipersensibilidad del receptor sináptico, de un trastorno del equilibrio entre las funciones de los transmisores dopaminérgicos y colinérgicos y disfunciones eventuales de los neurotransmisores.
    La hiperkinesia tardía irreversible se desarrolla aparentemente como la continuación  de una hiperkinesia tardía reversible, si no se toman las debidas precauciones. Parece depender de los mismos factores mencionados, así como tambien está asociada en el aspecto fisiopatológico a una reducción de la capacidad biológica compensatoria o buffer, llevando a una labilidad diskinética. Los mecanismos subyacentes a esta capacidad regulatoria disminuída, podrían deberse a una actividad disminuída de las neuronas dopaminérgicas y quizás GABAérgicas.
        La hiperkinesia tardía inducida por la sulpirida, es reducida, así como produce un parkinsonismo mínimo. Lo que aún se ignora, son los efectos a largo término con ésta droga: induciría menos hiperkinesias tardías, que aquella producida por los neurolépticos tradicionales. 

        El efecto de los agonistas del GABA sobre la hiperkinesia tardía es muy variable, pero podría acentuar los efectos parkinsonígenos y antihiperkinéticos de las sustancias antidopaminérgicas. A causa de los efectos secundarios de sedación, confusión, vértigos, náuseas y algunas veces convulsiones clónicas, así como una agravación de las hiperkinesias tardías, parecen tener poco lugar en el armamentario antipsicótico.


Modelos experimentales para el estudio del metabolismo cerebro.

7.1. Neuronas y glía en cultivos celulares.
    El cultivo celular o cultivo de tejidos, como también se le llama, tiene su origen en el siglo XIX, como un método para el estudio del comportamiento de las células animales libres de las variaciones sistémicas ocurridas dentro del organismo durante su normal homeostasis y bajo el estrés de un experimento. Estas técnicas iniciaron con el cultivo de fragmentos no disgregados de tejidos, los cuales restringían la mitosis de las células cultivadas y por tanto su crecimiento. Después se realizaron cultivos con fragmentos disgregados de tejidos, los cuales aumentaban el crecimiento celular en cultivo ya que se utilizaban células dispersas; esto fue un gran avance y provocó una explosiva expansión en esta área desde los años 50s.
    En la actualidad, pueden cultivarse en el laboratorio células procedentes de una amplia gama de tejidos y organismos diferentes. En un principio, el objetivo principal era el estudio de las propias células, cómo crecen, qué necesitan para su crecimiento, cómo y cuando dejan de crecer. Este tipo de estudios tiene hoy un gran interés científico, por ejemplo, en relación con investigaciones sobre el ciclo celular, el control del crecimiento de células tumorales y la modulación de la expresión genética. Otra área de gran interés se centra en la biología del desarrollo. Los esfuerzos para explicar cómo el gran número de células presentes en organismo maduro derivan de una sola célula a partir de la fertilización han llevado a la búsqueda de modelos experimentales.
El cultivo celular es muy adecuado como modelo para el estudio del desarrollo y la diferenciación, por lo que las líneas celulares que conservan la capacidad de diferenciarse in vitro son objeto de un intenso estudio. Por último, hay cierto tipo de investigaciones que no pueden realizarse sin el cultivo de células, por ejemplo, el trabajo con animales transgénicos, conduce a que organismos maduros expresen genes nuevos, se basa totalmente en las técnicas de cultivo celular para la inserción de genes extraños en las células receptoras. Así mismo, la tecnología de la fusión celular y los ensayos de citotoxicidad son técnicas de cultivo celular que, en cierto modo, han sido diseñadas para sustituir a la metodología in vivo.

7.1.1.  Biología del cultivo celular,
    La validez de un cultivo celular como modelo de función fisiológica in vivo ha sido criticado, ya que se presentan problemas de caracterización por la alteración del desarrollo celular; la proliferación in vitro no se presenta de igual manera a la de in vivo, debido a la reducción de la relación célula-célula y la interacción matriz-célula por la no presencia de la heterogeneidad y la estructura tridimensional de las células hallada in vivo, además porque el medio hormonal y nutricional se ve alterado. Esto crea un ambiente que favorece la difusión, migración y proliferación de células no especializadas, pero no a la expresión de funciones diferenciadas. La provisión de un ambiente apropiado, nutriente, hormonas y sustratos son fundamentales para la expresión de funciones especializadas.
    En un cultivo celular la mayoría de las células crecidas a partir de un tejido sólido disgregado o de un subcultivo tienen la capacidad de adherirse en monocapa, transformarse o anclarse independientemente. Esta adherencia celular es mediada por receptores celulares específicos de superficie en la matriz extracelular  y la dispersión celular podría ser precedida por la secreción de proteínas de matriz extracelular y proteoglicanos por parte de la célula. Las células se pueden anclar y difundir en el vidrio donde se cultivan por medio de ligeras cargas negativas y al plástico, como el poliestireno, si tienen una propiedad o tratamiento con descargas eléctricas o con radiación ionizante de alta energía. El cultivo en vidrio o plástico provee condiciones favorables para el crecimiento y anclaje celular.
    El crecimiento de las células en un cultivo celular primario depende de la supervivencia de éstas a las diferentes técnicas de disgregación y a la capacidad de adherirse al sustrato o de sobrevivir en suspensión. Si el cultivo primario es mantenido por pocas horas podría ocurrir un paso de selección futuro. Las células capaces de proliferar podrían aumentar, otros tipos de células podrían sobrevivir pero no aumentar y otras podrían ser capaces de sobrevivir en condiciones especiales. Además el crecimiento celular va ligado al espacio del cultivo, ya que unas células detienen  su crecimiento, mientras que otras lo incrementan.

7.1.2. Tipos de cultivo celular.
    El cultivo de órganos  permite la ampliación de un cultivo de células de tejido no disgregadas a un cultivo tridimensional que muestre en algo o en todo las características histológicas de los tejidos in vivo, para esto se utiliza un medio con interfase líquido gaseosa.
    El cultivo de cortes de tejido el cual utiliza fragmentos de tejidos colocados en vasos de vidrio o plástico con un medio con interfase líquida que va a promover la migración de las células cultivadas hacia un plano sólido provisto de un sustrato específico para cada célula.
    El cultivo de células dispersas en suspensión se refiere al cultivo de células tomadas del tejido original, de cultivos primarios de células o de una línea o cadena celular por disgregación enzimática, mecánica o química, este cultivo necesita de una monocapa adherente o un sustrato sólido que le provea a las células un medio adecuado para desarrollarse.
    Se realiza también el cultivo primario en el cual las células han sido reasociadas para recrear la estructura tridimensional del tejido; esto realizado por perfusión y por el crecimiento de una monocapa, la reagregación en suspensión, o la infiltración de una matriz tridimensional como el colágeno. Derivado del cultivo anterior encontramos el cultivo secundario en el cual se cultivan  diferentes provenientes de una misma, es el caso de los cultivos de astrocitos donde se puede obtener, en un mismo cultivo, crecimiento de los tipos I y II de éstas células.
    En la actualidad se están realizando cultivos que permiten la recombinación de células de diferentes linajes como los queratinocitos de la epidermis en combinación con los fibroblastos de la dermis; a estos cultivos se les denomina cocultivos. Dentro de estos cultivos encontramos  los cultivos de neuronas y astrocitos en conjunto, en los cuales  se ha confirmado el ciclo de la glutamina-glutamate por medio de análisis de los isótopos del glutamato y la glutamina, donde la glutamina es producto de los astrocitos y el glutamato y el aspartato producto de las neuronas. Además, se ha estudiado el acetato en estas células, el cual es metabolizado por ambas células, neuronas y astrocitos.
    El cultivo de células transformadas generalmente se obtiene por la inyección de un carcinógeno, después de una serie de cultivos alternados y pasaje por animales. Estas líneas celulares son capaces de desempeñar sus funciones órgano específicas generalmente durante el período de un año. La forma de estas células depende en gran parte, de las condiciones del cultivo utilizadas. Las células que crecen en cultivos en suspensión son casi siempre redondas con pocas prolongaciones. Sin embargo, cuando las células de origen cerebral crecen sobre superficies planas muestran una diversidad morfológica notable, con prolongaciones celulares y neuritas, que se forman con facilidad, mientras que los cuerpos celulares adoptan una forma alargada.

7.1.3. Ventajas del cultivo celular.
 Las dos mayores ventajas cuando se utilizan los cultivos celulares son: el control del medio fisicoquímico, a saber, pH, temperatura, presión osmótica, tensión de oxígeno (O2) y gas carbónico (CO2) de las células cultivadas y, las condiciones fisiológicas que deben ser constantes. La mayoría de las líneas celulares requieren para su buen desarrollo de suplementos en el medio en que se cultivan, ejemplo de esto es el suero, el cual provee infinidad de elementos como hormonas y otras sustancias reguladoras.
    Los cultivos celulares son realizados con diferentes replicaciones para permitir la conversión de experimentos heterogéneos, cuando se realiza un solo cultivo, en experimentos homogéneos o uniformes, cuando se realizan varios cultivos  cada uno con muestra y características de cultivos idénticos. Cuando las replicaciones experimentales sean virtualmente idénticas, la necesidad del análisis de varianza como estadística se reduce.
    Los cultivos de células permiten someter a las mismas a una baja y definida concentración de reactivos asegurando un acceso directo en ellas, lo que ahorra en un 90% lo requerido para la inyección del reactivo in vivo, su excreción y su posterior distribución a los tejidos en estudio. Aunque los estudios in vivo resulten más económicos  que los in vitro  son descartados porque el uso de la experimentación en animales resulta cuestionado en aspectos legales, morales y éticos (Freshney, 1995).

7.1.4. Desventajas del cultivo celular.
    Las técnicas de cultivo celular necesitan unas estrictas condiciones de asepsia porque las células animales crecen menos rápido que la mayoría de los contaminantes comunes como  las bacterias, los mohos y las levaduras. Además las células precedentes de animales  no pueden desarrollarse en medios de cultivo, por lo que es necesario agregar a los medios  suplementos como suero, plasma y fluidos intersticiales, entre otros para de una manera u otra proveer a las células cultivadas un medio semejante al  in vivo (Freshney, 1995).
    Una mayor limitación en el cultivo de células es el gasto de esfuerzo y materiales para la producción de una pequeña cantidad de células o de tejido. Los costos de producir células en cultivo son diez veces más que el uso de tejido animal, ya que se invierte bastante en ensayos o procedimientos preparativos que pueden ayudar en la estandarización del proceso reduciendo tiempo de manipulación, volúmenes de muestra, tiempos de centrifugación, etc. . 

    En los cultivos celulares se dificulta relacionar las células cultivadas con las células funcionales ubicadas en el tejido del cual son derivadas, esto por que en la mayoría de los casos presentan propiedades muy diferentes;  para esto es necesario utilizar marcadores de células los cuales van a ser de gran ayuda en el momento de caracterizarlas en  cultivo porque van a garantizar que las células crecidas en cultivo son las mismas que se sembraron y no otras. Además, suelen presentarse problemas de inestabilidad genética cuando se realizan varios pases de  cultivos de células no transformadas, lo que va a originar una gran heterogeneidad en  el crecimiento de las células y en su diferenciación.



Cultivo de neuronas.
    La complejidad de la microarquitectura del cerebro, compuesta por varios tipos de células, cada con diferentes procesos compactamente relacionados, habían hecho difícil el aislamiento de células puras. El primer esfuerzo en este sentido fue hecho en 1.958 por Korey y colaboradores, al aislar células de la glia de la materia blanca del cerebro. Sólo hasta 1967 se desarrollaron los principales procedimientos para el aislamiento de células del cerebro y posteriormente se han desarrollado otras técnicas para separar células de cerebelo  y otros tejidos del SNC y SNP. 
    Usando células en cultivo, las neuronas son capaces de diferenciarse morfológicamente y asemejarse a las células del tejido original. Las neuronas en cultivo pueden desarrollar propiedades fisiológicas similares a las observadas en células comparables in situ pudiendo contar contactos sinápticos con otras o con pequeños agregados celulares. 
    Las células nerviosas (neuronas) son unas de las células más difíciles de cultivar debido a los grandes requerimientos de sustratos que necesitan para su desarrollo. Lo primero que necesitan son recipientes de vidrio o plástico muy bien tratados contra la contaminación porque de lo contrario esta clase de células no sobrevive. Aún no ha sido encontrada la excelente proliferación de neuronas en cultivos celulares, aunque se utilicen para estas células nerviosas de embriones donde la mitosis es evidenciada in vivo. Mucho del trabajo en diferenciación celular nerviosa se ha enfocado hacia el cultivo de la línea celular del neuroblasto o híbridos de las células gliales del sistema nervioso. 
    Los cultivos de células de cerebro de feto han sido extensamente utilizados  para el estudio de la diferenciación de las células nerviosas. La agregación de las células seguidas de la secuencia del desarrollo observada in vivo origina una estructura compuesta de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.  Para el  cultivo de neuronas se utilizan células de cerebros de ratas de 17 a 18 días de gestación que son removidas y preparadas como una simple suspensión. Las células agregadas a los medios de cultivo formarán una estructura similar a la observada en el cerebro in vivo  durante un período de 20 días aproximadamente. El paso siguiente al cultivo es el reconocimiento de las células crecidas en cultivo para esto se utiliza la microscopía electrónica o la localización inmunohistoquímica de la proteína básica de mielina contenida en los axones de las neuronas o de proteínas contenidas en los neurofilamentos. 
    También se pueden aislar neuronas procedentes de cerebelo, las cuales proveen una buena caracterización de la población celular neuronal, mediante estudios morfológicos y  bioquímicos. Las células son obtenidas del cerebelo de ratas de 5 a 7 días de nacidas y la inhibición del crecimiento inicial de células es obtenida mediante una pequeña adición de b-arabinósido de citosina a los cultivos.