Desarrollo del metabolismo del glutamato
El glutamato es el principal neurotransmisor excitatorio del sistema nervioso central y se sintetiza principalmente por transaminación a aspartato, vía aspartato aminotransferasa (ASAT). Otras posibles rutas sintéticas, a saber, la desaminación oxidativa, vía glutamato deshidrogenasa (GDH) y descarboxilación del GABA, vía GABA a-cetoglutarato transaminasa (GABA-T) son mucho menos activas. Esto se refleja en que el antiporte glutamato-aspartato es más rápido que el sistema glutamato-OH-. También explica la cinética observada para la oxidación del glutamato en presencia de malato.La actividad de las enzimas relacionadas con el metabolismo de glutamato, es decir, aspartato aminotransferasa (ASAT) (EC 2.6.1.1), la glutamato deshidrogenasa (GDH) (EC 1.4.1.3) y la glutamina sintetasa (GS) (EC 6.3.1.2), aumenta en el cerebro en desarrollo, no muestran una correlación directa con las enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos.
La aspartato aminotransferasa (ASAT) ha sido propuesta como una enzima marcadora de neuronas que utilizan aminoácidos como neurotransmisores, especialmente las glutaminérgicas. La principal ruta del catabolismo de la glutamina incluye la ASAT, la cual genera a-cetoglutarato.Esta reacción aumenta con la omisión de glucosa del medio de incubación de sinaptosomas aislados de cerebro de rata. La presencia de b-metilen-DL-aspartato (b-MA), un inhibidor irreversible de la ASAT, inhibe el metabolismo energético de astrocitos y neuronas en cultivo primario. Estos resultados señalan que la ASAT esta presente en neuronas y astrocitos en cultivo primario, y que por lo tanto no puede ser utilizada como enzima marcadora de neuronas. Por otro lado, la inhibición de la ASAT en cultivos primarios de astrocitos de cerebro de ratón con aminooxiacetato (AOA) no afecta la formación de a-cetoglutarato, lo que indica que este sustrato no utiliza la vía de la transaminación sino que se forma por desaminación oxidativa a través de la GDH.
La glutamato deshidrogenasa (GDH), enzima reversible cataliza la conversión de a-cetoglutatato en glutamato se habia considerado una enzima marcadora de mitocondrias. Sin embargo, se ha demostrado su presencia en el núcleo de cerebro de rata. La enzima se desarrolla desde los 8 días antes del parto hasta los 21 días de vida postnatal, cuando se alcanza la actividad del adulto. Las mitocondrias no sinápticas sintetizan glutamato a través de la GDH, al doble de velocidad que las mitocondrias sinápticas siempre y cuando el precursor del a-cetoglutarato endógeno sea piruvato para pero con velocidades similares cuando el a-cetoglutarato es exógeno. Esto a pesar que la máxima actividad de la GDH (70%) en las mitocondrias sinápticas. GDH es una enzima altamente reguladora y su actividad in situ puede ser controlada por muchos factores. La actividad de la GDH es 2-5 veces más baja en neuronas que en astrocitos.
En contraste, la actividad de la glutaminasa (PAG) (EC 3.5.1.2), enzima que cataliza la conversión de la glutamina en glutamato y amonio, es 3-12 veces más alta en neuronas que en astrocitos, siendo propuesta como marcadora de neuronas. La glutaminasa (PAG) ha sido localizada en las mitocondrias, es inhibida por altas concentraciones de glutamato y ión amonio y activada por la presencia de fosfato. La actividad de la enzima incrementa ligeramente en función de la edad. La actividad de la PAG en astrocitos es similar en el neonato que en el cerebro adulto.
La glutamina sintetasa (GS) esta implicada en la destoxificación del amonio en el cerebro. Esta enzima se encuentra exclusivamente en los astrocitos y, en estos, específicamente en el citosol. La actividad de la enzima aumenta hasta las dos primeras semanas de vida postnatal. Los niveles de la actividad de la GS estan relacionados con la maduración de los astrocitos por lo que se ha propuesto que la GS puede ser utilizada como una enzima marcadora de la maduración de los astrocitos. Sin embargo, no hay un apreciable incremento de la actividad de esta enzima en cultivos primarios de astrocitos, indicando que la diferenciación de estas células está seriamente limitada en cultivo. No obstante, la magnitud de este efecto se disminuye en cocultivos con neuronas, que inducen la actividad de la GS en los astrocitos. Estos resultados sugieren que, durante el desarrollo, las neuronas juegan un papel importante en la diferenciación de los astrocitos. Por otro lado, experimentos de resonancia magnetica nuclear (NMR) con [1-13C]-glucosa, han puesto de manifiesto que los astrocitos en cultivo liberan glutamina al medio , lo que indica que in vitro existe actividad de la GS.
La GABA a-cetoglutarato transaminasa (GABA-T) (EC 2.6.1.19), es la única enzima que degrada el GABA para formar glutamato y semialdehído succínico. La enzima ha sido localizada en mitocondrias de neuronas y más concentrada en mitocondrias de astrocitos. La actividad de esta enzima, al igual que las enzimas relacionadas con el ciclo del GABA, es alta en el momento del nacimiento y disminuye progresivamente hasta la vida adulta.
La glutamato descarboxilasa (GAD) (EC 4.1.1.15), convierte el glutamato en GABA. La GAD sido localizada en el citosol y la presencia de Ca+2 hace que se una facilmente a las membranas. La enzima esta más concentrada en neuronas GABAérgicas, las más comunes en el cerebro y en cultivos primarios, por lo tanto, es utilizada como una enzima marcadora de neuronas.
Desarrollo del metabolismo de ácidos grasos.
La incapacidad del cerebro adulto para oxidar los ácidos grasos con fines energéticos se debe en parte a la ausencia de la maquinaria enzimática de traslocación, así como a sus bajos niveles mitocondriales de carnitina. Sin embargo, se ha demostrado que dichos sustratos son oxidados tanto por el cerebro fetal y neonatal de rata, como por el fetal humano y neonatal canino. En esta última especie incluso se ha evaluado la importancia cuantitativa de los ácidos grasos como suministro de energía al cerebro. Recientemente, se ha encontrado en varias regiones del cerebro de rata, la carnitina palmitoiltransferasa (CPT) (EC 2.3.1.21), enzima que tendría como función principal la regulación de la oxidación de los ácidos grasos en las neuronas.
La capacidad de los sistemas de activación de ácidos grasos de cadena corta en mitocondrias de cerebro de rata aumenta durante el desarrollo postnatal. Así, la acil-CoA sintetasa (EC 6.2.1.2) mitocondrial del cerebro presenta un máximo de actividad en el nacimiento, para disminuir paralelamente a la carnitina acetiltransferasa (EC 2.3.1.7) durante la mitad de la lactancia. En este sentido, el sistema de traslocación de carnitina, constituido por la acil-CoA carnitina aciltransferasa, alcanza un máximo de actividad a los 10 días de vida, mientras que antes del nacimiento la actividad es muy inferior. Estos cambios son paralelos a los de la oxidación de palmitato en cerebro. La vía de oxidación de los ácidos grasos parece estar inducida alrededor del nacimiento, a través de los propios sustratos o por inducción hormonal. La a-fetoproteina es la principal glicoproteína del plasma embrionário y fetal, encontrandose en todos los vertebrados, lo cual sugiere un papel importante de esta proteína durante el desarrollo. Se ha demostrado que la a-fetoproteina, al igual que la albúmina, se unen a ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados. Durante el desarrollo, la habilidad del feto para sintetizar ácidos grasos es bastante limitada, así que ellos deben ser incorporados procedentes de fuentes externas. Sólo así, puede explicarse la presencia de a-fetoproteina en el interior del cerebro.
La velocidad de síntesis de fosfolípidos y esteroles a partir de L-lactato ha sido estudiada utilizando cultivos primarios de neuronas y astrocitos. Ambos típos de células utilizan activamente el lactato como precursor de lípidos, aunque la velocidad de la lipogénesis es dos veces mayor en astrocitos que en neuronas. La incorporación de este sustrato es mayor en fosfofolípidos que en esteroles en los dos tipos de células, encontrandose que la fosfatidilcolina es el principal fosfolípido sintetizado en ambos cultivos, seguido por la fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina y el fosfatidilinositol. En neuronas se encontró que el principal esterol sintetizado fue el lanosterol seguido del desmosterol. En astrocitos, sin embargo, se observó lo contrario, es decir, el esterol más sintetizado es el desmosterol seguido del lanosterol. Esto puede deberse a las diferencias en la funcionalidad de la membrana de ambos tipos de células. Por otro lado, la actividad total de la fosfocolina transferasa aumenta durante el desarrollo. Sin embargo, los cambios en la síntesis de glicerofosfolípidos durante el desarrollo pueden deberse a las actividades específicas parciales de sus enzimas como también a la cantidad de sustrato e inhibidores y a la afinidad por los sustratos.
Desarrollo de los transportadores de sustratos en cerebro
La existencia de uniones herméticas entre las membranas plasmáticas de las células endoteliales que rodean a los capilares sanguíneos del cerebro, determina que la entrada y salida de sustancias al cerebro requiera sistemas específicos de transporte, que constituirán la barrera hematoencefálica (BHE). El desarrollo de la BHE está ligada al cierre de las uniones intercelulares (tight junction) y a la inducción de sistemas de transporte específicos de las células del endotelio capilar. Ambos procesos son postnatales en la rata, mientras que en el cobaya suceden prenatalmente. En la rata, la membrana basal es a los 14 días de gestación, filamentosa y discontinua, formando una lámina densa y continua adaptada a las membranas plasmáticas perivasculares en el momento del nacimiento. La definición y terminación de la membrana sólo tendra lugar después del nacimiento.
Dos transportadores de glucosa, los GLU1 y GLU3, han sido detectados en el cerebro. El GLU1 se concentra en las células endotelíales de la barrera hematoencefálica aunque está presente en neuronas y en glía. El GLU3 es, probablemente, el principal transportador de glucosa en neuronas. Los niveles de GLU1, en cerebro de neonato de rata de 14 días son bajos, duplicandose a los 21 días y de nuevo, duplicandose a los 30 días para alcanzar los niveles del adulto. Los niveles de GLU3 son bajos durante la primera semana de vida postnatal, incrementando sus niveles continuamente hasta los niveles del adulto, que se alcanzan entre los 21-30 días. Estos resultados demuestran que estos dos transportadores son regulados durante el desarrollo. Así, GLU1 parece estar relacionado con el suplemento de nutrientes y crecimiento del cerebro, mientras que el GLU3 esta más relacionado con la madurez y actividad funcional de las neuronas. El GLU1 se expresa en cultivos de neuronas y astrocitos, mientras GLU3 solo se expresa en cultivos primarios de neuronas.El transporte de glucosa a través de la BHE es saturable y estereoespecífico, con una KM entre 6-9 mM. No se ha detectado diferencias con la edad en lo que a la KM se refiere, aunque sí variaciones de la VMAX, que es un 60% más baja en el neonato que en el adulto. Otras hexosas inhiben competitivamente el transporte de glucosa: 2-deoxiglucosa (Ki=6 mM), o-metilglucosa (Ki=10 mM), manosa (Ki=21 mM) y la galactosa (Ki=40 mM). Se ha propuesto que la disminución del transporte de glucosa a través de la barrera hematoencefálica durante el período neonatal, respecto al adulto, se debe a la baja glucemia del neonato (3-4 mM) en relación a la KM de 9 mM, así como a la baja velocidad de metabolización de la glucosa por el cerebro neonatal. La insulina no estimula la entrada de glucosa en el cerebro, pero sí influye en la velocidad con que se metaboliza. Así, se ha demostrado que la insulina aumenta los niveles de glucógeno en los astrocitos.
El sistema de transporte para el lactato, acetato y cuerpos cetónicos es mucho más activo en el cerebro en desarrollo, mientras que para la glucosa su actividad es mucho menor. Por otro lado el transporte de aminoácidos no sufre cambios marcados durante el desarrollo. El transporte de todos los sustratos mencionados a las células nerviosas exige la existencia de sistemas de transporte específicos que se desarrollen con independencia a la formación de la BHE. El transporte de ácidos monocarboxílicos incluye acetato, piruvato y butirato, cuerpos cetónicos y a-cetoácidos. Se ha demostrado la presencia de transportadores saturables para lactato y piruvato a través de la BHE.
A pH fisiológico, más del 99% de los ácidos monocarboxílicos estan ionizados, necesitando, por lo tanto, la mediación de un transportador para atravesar las membranas celulares. La KM del transportador de piruvato a través de la BHE es de 0.4 mM, mientras que la KM del transportador de L-lactato es 1.9 mM, ambas indican una afinidad relativamente alta. El transportador de lactato es pH-dependiente, de forma que el transporte aumenta 2.5 veces cuando el pH baja de 8.4 a 6.1.
Se ha detectado recientemente que las mitocondrias aisladas de cerebro de rata poseen una traslocasa específica para el transporte del piruvato. Además, el 3-hidroxibutirato y el acetoacetato parecen ser transportados por el mismo sistema que piruvato. Así, el ?-ciano-4-hidroxicinnamato inhibe el transportador y utilización de piruvato y cuerpos cetónicos en mitocondrias de cerebro de rata. Se ha sugerido que la habilidad de las mitocondrias para acumular piruvato contra un gradiente de concentración puede permitir que proceda la oxidación del piruvato a una velocidad suficiente para dar cuenta de la observada para la glucólisis en cerebro de rata. Asimismo, este sistema permitiría la oxidación de los cuerpos cetónicos cuando la concentración del piruvato sea limitante.
En el cerebro en desarrollo tanto los cuerpos cetónicos como el piruvato contribuyen a la provisión de energía. Se ha demostrado, sin embargo, que la utilización de piruvato puede inhibirse por la presencia de 3-hidroxibutirato, un fenomeno que puede ser mediado, en parte, por la competencia por la traslocasa. El fenilpiruvato y el a-cetoiscaproato (cetoácidos que se acumulan en la fenilcetonuria) son inhibidores esta la traslocasa, a concentraciones tan bajas que no tienen un efecto directo sobre la actividad del complejo piruvato deshidrogenasa.
En experimentos con liposomas se ha demostrado que el piruvato se puede intercambiar con otros carboxilatos,lo que abre la posibilidad de que este sustrato se mueva a través de la bicapa de fosfolípidos de la membrana mitocondrial, contribuyendo significativamente al transporte de piruvato in vitro.
Los cuerpos cetónicos son los mejores sustratos capaces de ser oxidados en el cerebro del neonato. Durante la lactancia, aumenta siete veces la permeabilidad cerebral a dichos ácidos con respecto al nacimiento, siendo el lactato y el acetoacetato los más permeables. Además, se ha descrito que la salida neta de lactato desde el cerebro iba acompañada de una entrada neta de 3-hidroxibutirato y acetoacetato, sugiriendo un sistema de antiporte a través de la BHE. Dicho mecanismo sería más activo en neonato que en adulto.
El transporte de ácidos monocarboxílicos, piruvato y lactato, incluye también, como para la glucosa, una combinación de difusión pasiva y facilitada, estando determinada la dirección del flujo por las concentraciones respectivas en el fluido extracelular cerebral y en el plasma. Se ha visto que también sucede con el 3-hidroxibutirato, puesto que en el cerebro neonatal el transporte no es saturable en el rango de concentraciones plasmáticas normales; de este modo, se asegura la entrada del 3-hidroxibutirato dependiendo de sus concentraciones en plasma.
En adulto, el transporte de lactato y cuerpos cetónicos se induce con el ayuno y con una dieta rica en grasas. Por otro lado, el cerebro del neonato de rata en condiciones de hipoxia capta lactato de la sangre.
La concentración intracelular de lactato en células glíales es aproximadamente de 23 mM y los excesos de lactato son liberados al espacio extracelular a través de un cotransportador de H+-lactato. Este transportador puede ser importante en situaciones patológicas como isquemia y epilepsia.
La absorción de L-lactato ha sido investigada en neuronas en cultivo primario derivadas de cerebro de rata, se ha demostrado que la absorción es acelerada con una disminución del pH y que es inhibida considerablemente por el piruvato, lo que demuestra que las neuronas estan dotadas de un sistema de transporte es cual se parece en sus propieades al transportador de monocarboxilatos.
4.8.3. Transporte de aminoácidos
La velocidad de entrada de los aminoácidos en el cerebro no varía durante el desarrollo, aunque sí es muy distinta para cada aminoácido. Se han descrito tres sistemas de transporte de aminoácidos, a saber, A, ASC y L, segun sean estos de caracter ácido, básico o neutro. La mayoría de los aminoácidos utilizan el sistema de transporte de tipo L, el único independiente del ión sodio. Dicho sistema interviene en el movimiento bidireccional pasivo de los aminoácidos manteniendo el equilibrio a ambos lados de la membrana. La entrada neta de aminoácidos neutros, excepto para aminoácidos de cadena ramificada, es prácticamente nula. Así, la alanina, serina, glicina y prolina, entran muy lentamente y algunos presentan una leve inhibición cruzada. No se ha podido demostrar una competencia entre ellos por el transportador, como tampoco inhibición por sustrato, lo que sugiere la existencia de distintos sistemas de transporte. Recientemente, se ha reportado que los sistemas A y ASC de neuronas tienen alta afinidad en absorber alanina mientras que el sistema L tenga baja afinidad por ella. Los aminoácidos utilizan un sistema de transporte de baja actividad y alta afinidad, que está totalmente saturado a los niveles plasmáticos normales de aminoácidos. De esta manera se transportan aspártico y glutámico, a diferencia de los aminoácidos esenciales no neurotransmisores que no tienen limitada su entrada al cerebro. Sin embargo, la entrada de glutámico parece ser paralela al desarrollo de la actividad ATPasa de las membranas plasmáticas de las células nerviosas.
Se ha observado que la KM del transportador de glutamina es similar a la KM para la g-glutamil transpeptidasa sugiriendo que el ciclo de Meister puede estar implicado en el transporte de baja afinidad de la glutamina. Esta observación se apoya por el hecho de que la g-glutamil transpeptidasa (EC 2.3.2.1) tiene una alta actividad en astrocitos y en células de astrocitoma que en células de neuroblastoma.
El N-acetil-L-aspartil-L-glutamato (NAAG), es el péptido más abundante en el sistema nervioso de los vertebrados y ha sido detectado exclusivamente en las neuronas, aunque, en cultivos de células glíales también se expresa. El NAAG que está codistribuido con una gran variedad de neurotrasmisores, es liberado por las neuronas como consecuencia de una despolarización de la membrana. El péptido, una vez liberado, es degradado por una peptidasa (NAALA dipeptidasa) que hidroliza el NAAG a N-acetil-L-aspartato y a glutamato. La peptidasa esta localizada en el exterior de la membrana plasmática. Sin embargo, el péptido puede ser reabsorbido por un sistema de transporte de alta afinidad e inactivado. La hidrólisis del NAAG da glutamato y N-acetil-L-aspartato. Sin embargo, no se puede considerar este péptido, como un sustrato intermediario en el metabolismo intercelular del glutamato sino que el NAAG puede ser un modulador de la exitabilidad o un autoregulador de la liberación sináptica.
GABA es captado y metabolizado en astrocitos, gracias a la presencia de eficientes transportadores de alta afinidad. En este sentido, se han descrito cuatro transportadores de alta afinidad para el GABA, a saber, GAT-1, GAT-3, GAT-B y XT1, todos Na+/Cl--dependientes, asociados con terminaciones nerviosas del SNC o asociados a células glíales. En condiciones normales la concentración intraglíal de GABA es aproximadamente 1 mM mientras que en el exterior es 1 µM. Esto quiere decir que estas células toman activamente el exceso de GABA. Parece ser que la afinidad del transportador del GABA es dependiente de la maduración cerebral, tanto en neuronas como en glía. Se ha observado que la KM del transportador de GABA es de 5.5 µM en neuronas y de 13 µM en astrocitos. Aunque se pensó que el transportador neuronal del GABA estaba localizado exclusivamente en las terminaciones axónicas, se ha demostrado que dicho transportador se encuentra también en el pericarion neural. Tanto en neuronas como en astrocitos el aumento de las concentraciones de potasio extracelular estimula la liberación de GABA al medio, lo que establece un modelo bidireccional para el transportador de GABA. Una absorción óptima de GABA requiere de concentraciones intra y extracelulares de sodio y potasio las cuales dependen del potencial de membrana.
Se han propuesto varios traslocadores mitocondriales de glutamato, de los cuales el glutamato-OH- antiporte, el glutamato-aspartato antiporte y la glutamina-glutamato antiporte son los más importantes. Inicialmente se pensaba que en las mitocondrias solamente poseian el traslocador glutamato-aspartato. Estudios posteriores han demostrado la existencia del glutamato-OH- antiporte en mitocondrias de cerebro aunque etse sitema tiene una velocidad mucho menor que el sistema del traslocador glutamato-aspartato. También se ha encontrado la existencamina-glutamato.
Lanzaderas de carbono.
Mientras que la membrana externa mitocondrial no presenta barrera de permeabilidad alguna, o muy poca, a los sustratos o moléculas de interés en el metabolismo energético, la membrana interna tiene unas limitaciones muy estricta sobre los tipos de sustratos e intermediarios que puedan ser transportados a través de la misma. En este sentido, se han descrito traslocasas mitocondriales de piruvato, cuerpos cetónicos y aminoácidos. No obstante, en cerebro son muy importantes las lanzaderas mitocondriales de carbonos que se encargan de la exportación de esqueletos carbonados al citosol o al exterior de la propia célula. Este último hecho, el de la exportación extracelular, es muy importante en cerebro en donde neuronas y glía colaboran en un metabolismo pero que integra los diferentes tipos de células en un sólo tejido.
4.1.2.9.1. Lanzadera del citrato/piruvato.
El acetil-CoA no atraviesa per se la membrana interna mitocondrial. Sin embargo, el cerebro en desarrollo presenta mecanismos de transferencia de este sustrato al citosol. Uno de los sistemas de transferencia de acetil-CoA y, posiblemente el mayoritario en el cerebro, es el transporte de citrato a través de la membrana mitocondrial y posterior regeneración del acetil-CoA en el citosol mediante la ATP-citrato liasa (EC 4.1.3.8). Esta enzima cataliza la siguiente reacción:
El acetil-CoA no atraviesa per se la membrana interna mitocondrial. Sin embargo, el cerebro en desarrollo presenta mecanismos de transferencia de este sustrato al citosol. Uno de los sistemas de transferencia de acetil-CoA y, posiblemente el mayoritario en el cerebro, es el transporte de citrato a través de la membrana mitocondrial y posterior regeneración del acetil-CoA en el citosol mediante la ATP-citrato liasa (EC 4.1.3.8). Esta enzima cataliza la siguiente reacción:
Aunque la enzima ha generado acetil-CoA en el compartimento citosólico, el proceso de transferencia de acetil-CoA no termina hasta que el oxalacetato vuelve a entrar a la mitocondria. Debido a que el oxalacetato no se transporta directamente a través de la membrana mitocondrial, necesita otro mecanismo que le permita realizar este proceso. En este sentido, el oxalacetato puede convertirse en malato en el citosol mediante la acción de la NAD-malato deshidrogenasa (EC 1.1.1.37) citosólica:
Posteriormente, el malato se oxida a piruvato gracias a la actividad de la enzima málica (EC 1.1.1.40):
El piruvato es transportado a la mitocondria y completa la recuperación del oxalacetato mediante la acción de la piruvato carboxilasa (EC 6.4.1.1). La secuencia completa no sólo sirve para el transporte de acetil-CoA al citosol, sino también para generar el NADPH requerido para la síntesis de lípidos. Sin embargo, se ha sugerido que este último paso no tiene lugar sino que el malato entra a la mitocondria directamente sin convertirse en piruvato. Esto es evidente en neuronas, donde la enzima málica no ha sido localizada y la piruvato carboxilasa tiene baja actividad. En neuronas, pues, la lanzadera es citrato/malato, en vez de citrato/piruvato. La entrada directa de malato en la mitocondria privaría de la sintesis de NADPH, impresindible para la conversión de acetil-CoA en lípidos. Sin embargo, se ha detectado la presencia de isocitrato deshidrogenasa-NADP (EC 1.1.1.42) en el citosol de la neurona, lo que podría estar destinado al suministro de NADPH. En efecto, parte de citrato exportado al citosol se convierte en ?-cetoglutarato aportando el NADPH.
4.1.2.9.2. Lanzadera de N-acetil-L-aspartato
La L-aspartato N-acetiltransferasa (EC 2.3.1.17), enzima específica del sistema nervioso, sintetisa N-acetil-L-aspartato a partir de aspartato y acetil-CoA en la mitocondria. El N-acetil-L-aspartato se transporta a través de la membrana mitocondrial gracias al transportador de dicarboxilatos y, una vez en el citosol, se hidroliza mediante la N-acetil-L-aspartato amidohidrolasa (EC 3.5.1.15) para dar aspartato y acetato. Este último se convierte en acetil-CoA por la acción de la enzima acetil-CoA sintetasa (EC 6.2.1.1) citosólica. En este sentido, se ha demostrado que el N-acetil-L-aspartato (NAA) intramitocondrial es una fuente de grupos acetilo para la síntesis de lípidos en las neuronas. Por consiguiente el N-acetil-L-aspartato se considera como uno de los mecanismos importantes de transferencia de acetil-CoA de la mitocondria al citosol en el sistema nervioso central en desarrollo. El N-acetil-L-aspartato puede ser liberado a través de la membrana plasmática en condiciones normales, aunque, no puede atravezar la barrera hematoencefálica. Asimismo, puede ser reabsorbido gracias a un potente mecanismo de absorción celular. Por otro lado, se ha demostrado que el N-acetil-L-aspartato no actua como un neurotransmisor, ni está implicado en la liberación o reabsorción de neurotrasmisores. En este sentido, el incremento de N-acetil-L-aspartato en el fluido extracelular inmediatamente después de la estimulación con K+, puede ser el reflejo de un mecanismo de osmoregulación y/o homeostasis ácido-base.
Recientemente, se ha demostrado que los astrocitos tipo II (O-2A) crecidos in vitro, sintetizan también N-acetil-L-aspartato en concentraciones dos veces mayores que las neuronas. La concentración de NAA durante la maduración en el cerebro de rata incrementa rápidamente entre los 9 y 20 días después del nacimiento, un período activo de mielinización. El hecho que el NAA este en los O-2A sugiere que este compuesto es un donor de grupos acetilo para la síntesis de lípidos. Igualmente revela que existe una similitud entre los astrocitos tipo II y las neuronas, ya se ha reportado que expresan también algunas proteínas similares.
La L-aspartato N-acetiltransferasa (EC 2.3.1.17), enzima específica del sistema nervioso, sintetisa N-acetil-L-aspartato a partir de aspartato y acetil-CoA en la mitocondria. El N-acetil-L-aspartato se transporta a través de la membrana mitocondrial gracias al transportador de dicarboxilatos y, una vez en el citosol, se hidroliza mediante la N-acetil-L-aspartato amidohidrolasa (EC 3.5.1.15) para dar aspartato y acetato. Este último se convierte en acetil-CoA por la acción de la enzima acetil-CoA sintetasa (EC 6.2.1.1) citosólica. En este sentido, se ha demostrado que el N-acetil-L-aspartato (NAA) intramitocondrial es una fuente de grupos acetilo para la síntesis de lípidos en las neuronas. Por consiguiente el N-acetil-L-aspartato se considera como uno de los mecanismos importantes de transferencia de acetil-CoA de la mitocondria al citosol en el sistema nervioso central en desarrollo. El N-acetil-L-aspartato puede ser liberado a través de la membrana plasmática en condiciones normales, aunque, no puede atravezar la barrera hematoencefálica. Asimismo, puede ser reabsorbido gracias a un potente mecanismo de absorción celular. Por otro lado, se ha demostrado que el N-acetil-L-aspartato no actua como un neurotransmisor, ni está implicado en la liberación o reabsorción de neurotrasmisores. En este sentido, el incremento de N-acetil-L-aspartato en el fluido extracelular inmediatamente después de la estimulación con K+, puede ser el reflejo de un mecanismo de osmoregulación y/o homeostasis ácido-base.
Recientemente, se ha demostrado que los astrocitos tipo II (O-2A) crecidos in vitro, sintetizan también N-acetil-L-aspartato en concentraciones dos veces mayores que las neuronas. La concentración de NAA durante la maduración en el cerebro de rata incrementa rápidamente entre los 9 y 20 días después del nacimiento, un período activo de mielinización. El hecho que el NAA este en los O-2A sugiere que este compuesto es un donor de grupos acetilo para la síntesis de lípidos. Igualmente revela que existe una similitud entre los astrocitos tipo II y las neuronas, ya se ha reportado que expresan también algunas proteínas similares.
4.1.2.9.3. Lanzadera del acetoacetato
Otra posible vía de transferencia de acetil-CoA de la mitocondria al citosol en el cerebro de rata en desarrollo es el transporte de acetoacetato intramitocondrial al citosol. En efecto, la acetoacetil-CoA tiolasa (EC 2.3.1.9) mitocondrial puede desviar el acetil-CoA procedente del piruvato hacia la formación de acetoacetil-CoA. Este último se convierte en acetoacetato gracias a la actividad de la 3-cetoácido-CoA transferasa (EC 2.8.3.5) que atraviesa la membrana de la mitocondria utilizando el transportador de monocarboxilatos. Una vez en el citosol, el acetoacetato se convierte en acetoacetil-CoA mediante la acetoacetil-CoA sintetasa (EC 6.2.1.16) y éste en acetil-CoA por la acetoacetil-CoA tiolasa citosólica. En este sentido, se ha observado la presencia de cetogénesis a partir de ácidos grasos en astrocitos en cultivo, lo que implicaría el funcionamiento de la 3-cetoácido-CoA transferasa mitocondrial en el sentido de formación de acetoacetato. Sin embargo, esta vía parece poco probable en el cerebro en desarrollo, pues las concentraciones cerebrales de acetoacetato y 3-hidroxibutirato son muy bajas o indetectables y la reacción catalizada por la acetoacetil-CoA tiolasa está desplazada hacia la formación de acetil-CoA. Es más, la contribución de los cuerpos cetónicos a la síntesis de esteroles es mayor que a la síntesis de ácidos grasos, lo que sugiere que el acetoacetil-CoA citosólico evita parcialmente su conversión en acetil-CoA. Por tanto, la vía de acetoacetato como transferencia de acetil-CoA de la mitocondria al citosol no debe ser cuantitativamente importante en el cerebro en desarrollo.
Otra posible vía de transferencia de acetil-CoA de la mitocondria al citosol en el cerebro de rata en desarrollo es el transporte de acetoacetato intramitocondrial al citosol. En efecto, la acetoacetil-CoA tiolasa (EC 2.3.1.9) mitocondrial puede desviar el acetil-CoA procedente del piruvato hacia la formación de acetoacetil-CoA. Este último se convierte en acetoacetato gracias a la actividad de la 3-cetoácido-CoA transferasa (EC 2.8.3.5) que atraviesa la membrana de la mitocondria utilizando el transportador de monocarboxilatos. Una vez en el citosol, el acetoacetato se convierte en acetoacetil-CoA mediante la acetoacetil-CoA sintetasa (EC 6.2.1.16) y éste en acetil-CoA por la acetoacetil-CoA tiolasa citosólica. En este sentido, se ha observado la presencia de cetogénesis a partir de ácidos grasos en astrocitos en cultivo, lo que implicaría el funcionamiento de la 3-cetoácido-CoA transferasa mitocondrial en el sentido de formación de acetoacetato. Sin embargo, esta vía parece poco probable en el cerebro en desarrollo, pues las concentraciones cerebrales de acetoacetato y 3-hidroxibutirato son muy bajas o indetectables y la reacción catalizada por la acetoacetil-CoA tiolasa está desplazada hacia la formación de acetil-CoA. Es más, la contribución de los cuerpos cetónicos a la síntesis de esteroles es mayor que a la síntesis de ácidos grasos, lo que sugiere que el acetoacetil-CoA citosólico evita parcialmente su conversión en acetil-CoA. Por tanto, la vía de acetoacetato como transferencia de acetil-CoA de la mitocondria al citosol no debe ser cuantitativamente importante en el cerebro en desarrollo.
4.1.2.9.4. Lanzadera de acilcarnitinaEl acil-CoA se encuentra en equilibrio con la acetilcarnitina en una reacción catalizada por la carnitina acetiltranferasa I (EC 2.3.1.7):
4.1.2.9.5. Lanzadera malato/aspartato
Aunque la lanzadera malato/aspartato esta diseñada especialmente para la transferencia de equivalentes de reducción a través de la membrana mitocondrial, en cerebro puede servir, asimismo, a la transferencia de carbonos a través de la membrana mitocondrial.
El funcionamiento de la lanzadera aspartato-malato depende del hecho de que tanto NADH, NAD+como el oxalacetato no son permeables a través de la membrana interna mitocondrial. Este hecho obliga a que exista una distribución de la malato deshidrogenasa-NAD (EC 1.1.1.37) y aspartato aminotransferasa (EC 2.6.1.1) a ambos lados de la membrana mitocondrial. Asimismo, requiere la existencia de transportadores de membrana que permitan el intercambio del aspartato mitocondrial con el glutamato citosólico, así como el malato citosólico con el a-cetoglutarato intramitocondrial. La lanzadera aspartato-malato media, junto con la lanzadera del a-glicerolfosfato, la transferencia de equivalentes de reducción a través de la membrana interna mitocondrial. Probablemente, esta lanzadera regule el metabolismo energético en cerebro dado que se ha observado que el b-metilén-DL-aspartato (b-MA), un inhibidor específico de la enzima aspartato aminotransferasa, inhibe la oxidación de glucosa en cortes de cerebro y en sinaptosomas.
Las neuronas y los astrocitos parecen responder de distinta manera a los efectos del b-MA. Sin embargo, los resultados son contradictorios. Así, el metabolismo neuronal se afecta notablemente por la presencia de dicha sustancia y no así el de los astrocitos. Por otro lado, la oxidación de piruvato es más sensible a los niveles de aspartato en astrocitos que en neuronas. Estos resultados se pueden explicar, mediante la hipótesis de que la lanzadera aspartato/malato actua como principal mecanismo para la síntesis de aspartato y glutamato en las neuronas, mientras en los astrocitos actua en la degradación de estos dos sustratos.
Aunque la lanzadera malato/aspartato esta diseñada especialmente para la transferencia de equivalentes de reducción a través de la membrana mitocondrial, en cerebro puede servir, asimismo, a la transferencia de carbonos a través de la membrana mitocondrial.
El funcionamiento de la lanzadera aspartato-malato depende del hecho de que tanto NADH, NAD+como el oxalacetato no son permeables a través de la membrana interna mitocondrial. Este hecho obliga a que exista una distribución de la malato deshidrogenasa-NAD (EC 1.1.1.37) y aspartato aminotransferasa (EC 2.6.1.1) a ambos lados de la membrana mitocondrial. Asimismo, requiere la existencia de transportadores de membrana que permitan el intercambio del aspartato mitocondrial con el glutamato citosólico, así como el malato citosólico con el a-cetoglutarato intramitocondrial. La lanzadera aspartato-malato media, junto con la lanzadera del a-glicerolfosfato, la transferencia de equivalentes de reducción a través de la membrana interna mitocondrial. Probablemente, esta lanzadera regule el metabolismo energético en cerebro dado que se ha observado que el b-metilén-DL-aspartato (b-MA), un inhibidor específico de la enzima aspartato aminotransferasa, inhibe la oxidación de glucosa en cortes de cerebro y en sinaptosomas.Las neuronas y los astrocitos parecen responder de distinta manera a los efectos del b-MA. Sin embargo, los resultados son contradictorios. Así, el metabolismo neuronal se afecta notablemente por la presencia de dicha sustancia y no así el de los astrocitos. Por otro lado, la oxidación de piruvato es más sensible a los niveles de aspartato en astrocitos que en neuronas. Estos resultados se pueden explicar, mediante la hipótesis de que la lanzadera aspartato/malato actua como principal mecanismo para la síntesis de aspartato y glutamato en las neuronas, mientras en los astrocitos actua en la degradación de estos dos sustratos.
Desarrollo de las vías anaplerótica
Una consecuencia importante de la síntesis de neurotransmisores, especialmente aminoácidos dicarboxílicos, es la necesidad de proveer intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, para sustituir aquellos que han resultado disminuidos. El mantenimiento de los niveles de los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en el cerebro se debe, en gran medida, a las elevadas proporciones de fijación de CO2. Estas reacciones son conocidas como reacciones anapleróticas, de hecho, siete vías anapleróticas han sido descritas en cerebro. De ellas la piruvato carboxilasa (EC 6.4.1.1), la acetil-CoA carboxilasa (EC 6.4.1.2), la propionil-CoA carboxilasa (EC 6.4.1.3) y la 3-metilcrotonil-CoA carboxilasa (EC 6.4.1.4) son biotino-dependientes. La fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (EC 4.1.1.32), la malato deshidrogenasa-NADP (enzima málica) (EC 1.1.1.40), la NADP-isocitrato deshidrogenasa (EC 1.1.1.42), no son biotino-dependientes y catalizan procesos reversibles que, al menos en en teoría, pueden conducir a la fijación de CO2 .
La acetil-CoA carboxilasa se encuentra en el citosol y cataliza la carboxilación de acetil-CoA a malonil-CoA y esta considerada como el paso limitante en la biosíntesis de ácidos grados de cadena larga. La actividad de la acetil-CoA carboxilasa es mayor en cerebro de rata durante los últimos días de gestación y los 10-15 días de vida postnatal, declinando lentamente en las siguientes dos semanas, llegando a alcanzar entre un 30-50% del valor observado en el neonato.
La propionil-CoA carboxilasa ha sido localizada exclusivamente en mitocondrias. Las deficiencias de biotina causan una marcada reducción de la actividad de esta enzima en cerebro comparado con otros tejidos de rata. Esta enzima está implicada en el metabolismo del propionato y los aminoácidos ramificados.
La piruvato carboxilasa, se encuentra principalmente en mitocondrias de astrocitos y cataliza la formación de oxalacetato a partir de piruvato. La actividad de la enzima en cerebro de neonato de rata es muy baja, incrementandose 15 veces en el primer mes de vida postnatal. Posiblemente, esta enzima es la principal responsable de la fijación del CO2 en el cerebro, puesto que la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa tiene una función descarboxilante y la enzima málica carece de suficiente actividad para fijar la cantidad observada de CO2. Parece que la incorporación de CO2 a través de la piruvato carboxilasa depende de la disponibilidad de piruvato. Se ha discutido que la fijación de CO2 en cultivos primarios de neuronas es muy baja y no se afecta por el incremento extracelular de potasio, como si ocurre en cultivos de astrocitos ó fibroblastos. Por lo tanto se ha concluye que, en cerebro, la piruvato carboxilasa es una enzima exclusivamente astrocítica. La actividad anaplerótica de la piruvato carboxilasa provee a-cetoglutarato y glutamina que sirven como precursores para el restablecimiento de la reserva de neurotransmisores en los terminales presinapticos.La malato deshidrogenasa-NADP (enzíma málica) se han encontrado en citosol y en mitocondrias de astrocitos y oligodendrocitos y favorece la lipogénesis durante el desarrollo. En cultivos primarios de astrocitos ha sido localizada la enzima málica en el citosol y en la mitocondria, mientras no se ha detectado la presencia de la misma en el citosol de las neuronas. En cerebro de neonato de rata, la actividad citosólica y mitocondrial de esta enzima es muy baja alcanzando durante el destete los niveles del adulto.
La isocitrato deshidrogenasa-NADP se encuentra en citosol y mitocondria de neuronas y favorece, posiblemente, la lipogénesis. Esta enzima existe en tejidos de mamíferos como dos isoenzimas, una que se encuentra en el citosol y la otra en la mitocondria. En cerebro de rata, la actividad específica de la forma mitocondrial es tres veces superior que la forma citosólica. Durante el período postnatal, la actividad de la forma citosólica decrece, mientras la forma mitocondrial se mantiene. La participación de la forma citosólica de la isocitrato deshidrogenasa-NADP en una lanzadera con el a-cetoglutarato a sido demostrada, aunque su contribución en proveer grupos acetilo para la síntesis de ácidos grasos en el cerebro es relativamente pequeña.
Las enzimas catalizadoras de las cuatro principales reacciones anapleróticas, esto es la piruvato carboxilasa, la enzima málica, la isocitrato deshidrogenasa-NADP y la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, podrían causar la oxidación completa de los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, en el caso de que existiera una escasa producción de piruvato, o como mecanismo para la oxidación de aminoácidos. En cultivos primarios de astrocitos de cerebelo de ratón se ha detectado por inmunofluorecencia la presencia de piruvato carboxilasa. Asimismo, se ha establecido la existencia de un posible mecanismo de liberación de uno o más intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos por astrocitos, seguido por la captación de estos por las neuronas. Todos estos hechos apuntan hacia la existencia de una compartimentación intercelular. La presencia de transportadores de a-cetoglutarato y malato en los sinaptosomas soportan esta idea. Así, la piruvato carboxilasa podría mediar con su función anaplerótica a mantener las reservas entre astrocitos y neuronas.
Durante la acumulación de amonio en cerebro, circunstancia en que la formación de glutamina está muy acelerada, los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos se disminuirian drasticamente, en el curso de dos a tres minutos, sino fuera por la síntesis anaplerótica. De hecho, los volúmenes de los depósitos de estos intermediarios difícilmente cambian en estas condiciones. En la práctica parece que la piruvato carboxilasa es responsable de la mayor parte de la fijación de CO2 en el cerebro, dado que aproximadamente un 7-10% de todo el piruvato utilizado sirve para sustituir los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos durante el normal funcionamiento de este ciclo. La enzima málica y la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa contribuyen de forma poco significativa, ya que sus estados de equilibrio favorecen mucho más la descarboxilación que la carboxilación. Además, las reacciones de transaminación pueden generar intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en condiciones cinéticas favorables y, por tanto, servir como función anaplerótica.
Las enzimas catalizadoras de las cuatro principales reacciones anapleróticas, esto es la piruvato carboxilasa, la enzima málica, la isocitrato deshidrogenasa-NADP y la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, podrían causar la oxidación completa de los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, en el caso de que existiera una escasa producción de piruvato, o como mecanismo para la oxidación de aminoácidos. En cultivos primarios de astrocitos de cerebelo de ratón se ha detectado por inmunofluorecencia la presencia de piruvato carboxilasa. Asimismo, se ha establecido la existencia de un posible mecanismo de liberación de uno o más intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos por astrocitos, seguido por la captación de estos por las neuronas. Todos estos hechos apuntan hacia la existencia de una compartimentación intercelular. La presencia de transportadores de a-cetoglutarato y malato en los sinaptosomas soportan esta idea. Así, la piruvato carboxilasa podría mediar con su función anaplerótica a mantener las reservas entre astrocitos y neuronas.
Durante la acumulación de amonio en cerebro, circunstancia en que la formación de glutamina está muy acelerada, los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos se disminuirian drasticamente, en el curso de dos a tres minutos, sino fuera por la síntesis anaplerótica. De hecho, los volúmenes de los depósitos de estos intermediarios difícilmente cambian en estas condiciones. En la práctica parece que la piruvato carboxilasa es responsable de la mayor parte de la fijación de CO2 en el cerebro, dado que aproximadamente un 7-10% de todo el piruvato utilizado sirve para sustituir los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos durante el normal funcionamiento de este ciclo. La enzima málica y la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa contribuyen de forma poco significativa, ya que sus estados de equilibrio favorecen mucho más la descarboxilación que la carboxilación. Además, las reacciones de transaminación pueden generar intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en condiciones cinéticas favorables y, por tanto, servir como función anaplerótica.
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