Microbiología

Bacteriófagos

El fago Φ29 o bacteriófago Φ29 (phi29) es un virus de la familia Podoviridae¹ que infecta a la bacteria Bacillus subtilis y otras bacterias del género Bacillus.

Presenta un ADN bicatenario de unos 20 genes, por lo que resulta muy útil en estudios de biología molecular.- ............................................:https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Fago_%CE%A629&printable=yes

Los experimentos pertenecientes al campo de la biotecnología, llevados a cabo por el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) en relación a la amplificación del ADN le han permitido concluir en la siguiente invención: Quimera de ADN polimerasa del fago φ29.

La ADN polimerasa del fago φ29 presenta varias características de gran interés para la amplificación de ADN como son; una elevada procesividad sin necesidad del concurso de ninguna proteína accesoria y una alta capacidad de desplazamiento de cadena que le permiten replicar el genoma de dicho bacteriófago en un solo evento de unión al ADN, así como una alta fidelidad en la inserción de nucleótidos en la nueva cadena.

Estas características han conducido al desarrollo de una gran variedad de protocolos para la amplificación isotérmica de ADN, basados en el uso de esta polimerasa que permiten la obtención de productos de alta calidad que pueden digerirse o ser secuenciados directamente sin necesidad de purificación previa. Sin embargo, existe una necesidad de protocolos que permitan la amplificación de ADN a partir de cantidades menores del mismo.

Los experimentos realizados responden a esta necesidad mediante dos enfoques:

1) Desarrollo de una composición que mejora significativamente la especificidad y el rendimiento de la reacción.

2) Formación de quimeras entre la ADN polimerasa de φ29 y motivos que unen ADN de manera no específica que aumentan la capacidad de unión al ADN de la enzima.

Con estos experimentos se muestra que la adición simultánea de monolaurato de sorbitán polioxietilenado (Tween® 20) y una sal de amonio al tampón usado habitualmente para la amplificación con la ADN polimerasa de φ29, por un lado, evita la amplificación inespecífica de ADN y, por otro, permite la amplificación detectable y específica a partir de cantidades límite de 0,1 femtogramos (fg) de ADN plasmídico y 10 fg de ADN genómico como molde.

Respecto al aumento de la capacidad de unión al ADN, en la presente invención se han fusionado motivos HhH de la topoisomerasa V de Methanopyrus kandleri al extremo carboxilo de la ADN polimerasa de φ29 a través de una secuencia conectora o linker, originando 4 quimeras diferentes. Estas quimeras son capaces de amplificar el ADN molde a partir de una cantidad menor que la requerida por la ADN polimerasa de φ29 natural.

• Un primer aspecto de la presente invención, se refiere a una quimera de ADN polimerasa que comprende:

a) una secuencia aminoacídica que codifica para una ADN polimerasa del tipo φ29, unida por su extremo Cterminal a

b) una secuencia aminoacídica conectora, unida por su extremo C-terminal a

c) una secuencia aminoacídica que comprende, al menos, un dominio hélice-gancho-hélice (HhH).

• Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de replicación, amplificación o secuenciación de un

ADN molde que comprende poner en contacto dicho ADN con una mezcla de reacción que comprende, al menos:

a) la quimera de ADN polimerasa de la invención,

b) un tampón,

c) cloruro magnésico,

d) un cebador, y

e) nucleósidos trifosfato.

Un fago filamentoso es un tipo de bacteriófago que tiene la forma de una barra filamentosa. Los fagos filamentosos por lo general contienen un genoma de una sola hebra de ADN y son capaces de infectar a las bacterias gram-negativas.

• Fagos Ff - estos infectan al E. coli que llevan el episoma F.
  • Bacteriófago M13
  • Fago F1
  • Fago Fd
  • Fago Ike
• Fago N1

Introducción: Las causas de la resistencia a antibióticos son complejas. La tecnología de presentación sobre fagos filamentosos (TPFF) ha sido utilizada principalmente para obtener anticuerpos monoclonales (MAbs) y péptidos dirigidos contra dianas de cáncer o enfermedades inflamatorias. Hoy la tecnología se reconoce como una herramienta poderosa para seleccionar nuevos péptidos y anticuerpos que se pueden unir a una amplia gama de antígenos, que van desde células enteras, hasta proteínas y lípidos. En esta revisión, resaltamos artículos que utilizan esta tecnología  para descubrir nuevos fármacos en contra de las enfermedades infecciosas, concentrándonos en péptidos y anticuerpos de acción antimicrobianos.
Métodos: Se hizo una revisión de la literatura básica y actualizada sobre aspectos generales de la tecnología de presentación sobre fagos filamentosos y la aplicación de la misma en la búsqueda de nuevos péptidos o anticuerpos  de uso farmacéutico para combatir las enfermedades infecciosas trasmitidas por bacterias y virus.
Resultados: Se muestra información actualizada sobre los temas escogidos, con un enfoque orientador y práctico, dirigido a investigadores en el campo de la biología molecular con vistas a continuar profundizando y aplicando la tecnología de presentación sobre fagos filamentosos, con énfasis especial en las aplicaciones que se  han realizado en Cuba.
Conclusiones: Los avances en los métodos de selección, producción, y las tecnologías de humanización muestran que la tecnología de presentación sobre fagos filamentosos puede hacer una contribución significativa en la lucha  contra  patógenos clínicamente importantes.