Bunyaviridae
'Punta Toro virus' Es una especie de virus perteneciente a la familia Bunyaviridae y algénero Phlebovirus.1
Los viriones poseen envoltura nuclear y nucleocápside. La envoltura nuclear es de una sola capa. Los viriones son de apariencia esférica y pleomórfica, sin protusiones aparentes y con unas dimensiones entre 80-20 nm. Esta envoltura rodea a tres nucleocápsides con proyecciones de superficie que consisten en espículas conspicuas. No se advierten ribosomas del hospedador en el interior de esta envuelta. La nucleocapside tiene estructura circular y helicoidal.
Su genoma está formado por tres segmentos de ARN monocatenario circular con sentido negativo y ambisense.
Un miembro de un grupo de virus de ARN que causan la fiebre hemorrágica, virus de la fiebre de Rift Valley (RVFV) afecta principalmente a animales de granja domesticados y seres humanos. Ha sido la causa de varias epidemias recientes en Africa y el Medio Oriente ( CDC, 2000a , CDC, 2000b y CDC, 2007 ). La evidencia de su capacidad para causar enfermedad en las zonas geográficas fuera de África endémica subsahariana, junto con su facilidad de transporte y la falta de medidas eficaces son la base de su clasificación como categoría A patógeno por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas ( NIAID, 2002 ).
Virulencia de RVFV está al menos parcialmente atribuirse a su proteína NE, que suprime la respuesta inmune antiviral anfitrión al obstaculizar la producción de interferones de tipo I ( Billecocq et al., 2004 , Bouloy et al., 2001 y Muller et al., 1995 ). Los interferones (IFN) se producen en respuesta a la infección viral e inician una cascada de señalización que da como resultado la producción de un número de productos de genes antivirales (Haller et al., 2006 ). Las funciones RVFV Sociedades Nacionales de proteínas a través de la inhibición general de transcripción celular ( Billecocq et al., 2004 y Le May et al., 2004 ) y la represión específica de la región promotora de IFN-β ( Le May et al., 2008 ) para proporcionar un medio para el virus para evadir la respuesta inmune y por lo tanto establecer la infección.
Debido a la mejora del nivel de bioseguridad 3 (BSL-3 +) instalaciones necesarias para trabajar con RVFV, un laboratorio BSL-2 phlebovirus estrechamente relacionado, el virus de Punta Toro (PTV), se ha utilizado en los sistemas de roedores para modelar la enfermedad FVR. El oriental de Panamá cepa Adames de PTV (PTV-A) causa la enfermedad en hámsters y ratones similares a la observada en las infecciones RVFV naturales, y por lo tanto sirve como una alternativa rentable más seguro y más para estudiar la patogénesis de la enfermedad ( Anderson et al., 1990 , Fisher et al., 2003 ,Gowen et al., 2006a , Perrone et al., 2007 y Pifat y Smith, 1987 ) y desarrollo de fármacos antiviral pre-clínica ( Gowen et al., 2006b , Gowen et al., 2007a , Gowen et al., 2007b , Gowen et al., 2009 y Sidwell et al., 1988b ). Aunque estudios previos indicaron PTV-A sólo fue capaz de inducir la enfermedad en ratones de edad al destete ( Pifat y Smith, 1987 ), el trabajo reciente en nuestro laboratorio ha establecido de PTV-A capacidad de producir enfermedad letal en ratones de 7 a 8 semanas de edad, ( Gowen et al, 2006a. ); sin embargo, la histopatología de la enfermedad no se ha examinado en estos ratones más viejos.
Una segunda cepa de aislado de PTV oeste de Panamá, la cepa Balliet (PTV-B), es de baja virulencia en hámsters, como se refleja por la supervivencia de los animales desafiados con dosis de hasta 10 6 PFU ( Anderson et al., 1990 ). En un informe reciente estudio de los determinantes genéticos de patogenicidad, PTV-A fue encontrado para antagonizar el interferón β (IFN-β) respuesta en hámsters, mientras PTV-B carecía de que la capacidad ( Perrone et al., 2007 ). Similar a los hallazgos con RVFV y el clon atenuada 13, que indican que el gen de la NSS en el segmento S ARN es crítica a la virulencia ( Muller et al., 1995 ), el trabajo de Perrone y sus colegas sugiere que el PTV-A producto del gen NSs es el elemento que inhibe IFN-β inducción de genes. Estudios previos han indicado que PTV-B también es no virulento en ratones inoculados menos directamente en el cerebro ( Sidwell et al., 1988a y Sidwell et al., 1988b ). La hipótesis de que la estrategia empleada para evadir la respuesta del huésped IFN en hámsters también puede ser utilizada por PTV-A durante la infección en ratones, en última instancia, que confiere la letalidad de la infección con el Adames, pero no la cepa Balliet del virus.
Durante las infecciones virales, la vía de señalización de IFN puede regular la transcripción de cientos de factores que funcionan para inducir un estado antiviral. La primera IFN de tipo I producida es IFN-β, que desencadena la producción de múltiples subtipos de IFN-α ( Marie et al., 1998 ). Estas I IFNs de tipo inducen la transcripción de muchos genes que codifican para proteínas con diversas actividades antivirales. Por lo tanto, PTV-A NSs supresión del promotor de IFN-β puede abrogar esta cadena de señalización antiviral crítico de eventos desde el principio, la detención de gran parte de la vía de IFN y sus efectores. Aunque IFN-β juega un papel central en la conducción de la vía de IFN anfitrión respuesta, su regulación y la de moléculas efectoras aguas abajo no se ha explorado en relación a la infección por PTV en ratones.
Resultados
Susceptibilidad y enfermedad patología en adultos C57BL / 6J ratones infectados con PTV
Un experimento de titulación del virus se realizó inicialmente para determinar la dosis más adecuada para la evaluación de la enfermedad PTV en ratones adultos ( Fig. 1 ). La DL 50 s en base a las valoraciones eran ~ 630 y> 2 × 10 4 dosis infecciosas de cultivo de células 50% (CCID 50 ) para PTV-A y PTV-B, respectivamente. La dosis más alta de PTV-A resultó en un menor letalidad, posiblemente debido a un efecto de partículas de interferencia defectuoso o tal vez la estimulación del sistema inmunológico con más eficacia que la dosis más baja que era uniformemente letal. El día medio de la muerte de los animales infectados con PTV-A fue de 5,2 días, con un intervalo de 4 a 7 días. En el día 3 después de la infección (pi), los ratones infectados con PTV-A se presenta con signos claros de la enfermedad, incluyendo la pérdida de peso, piel de volantes, encorvado, y la inactividad. Por día 5, ratones supervivientes presentan con signos leves de la enfermedad, en última instancia, la recuperación por día 7. Ninguno de los animales inoculados con PTV-B mostraron ningún signo de enfermedad por examen visual o el peso perdido tras la exposición (datos no mostrados).
- Fig. 1.La supervivencia de los ratones C57BL / 6J ratones infectados con PTV-A o B-PTV. Ratones C57BL / 6J fueron desafiados por vía subcutánea con dosis múltiples de PTV-A o B-PTV (5 animales por grupo) y se observaron diariamente la mortalidad durante un período de 14 días.
A continuación longitudinalmente evaluamos histopatología y virológicos y enfermedad clínica parámetros en ratones desafiados con el 2 × 10 3 CCID 50 de PTV-A o PTV-B por sacrificio secuencial de grupos de animales todos los días durante el período de infección aguda. Histológicamente, los hígados de PTV-A-ratones infectados parecían normales hasta el día 3 de la infección, por lo que las zonas de tiempo de coalescencia de severa necrosis hepatocelular, aguda eran evidentes, y el día 4, necrosis quedaron difunden ( Figs. 2 A y C) . Necrosis hepatocelular no estaba presente en los ratones infectados con PTV-B, como secciones de hígado parecían similares a las de los animales sham-infectados ( Fig. 2 B y D), aunque no había evidencia de hipoxia en los hepatocitos centrilobulillares en el día 4 pi y hidrópica leve degeneración en día 5 pi (datos no mostrados).
- Fig. 2.La histopatología de la infección por PTV en ratones. Los hígados de (A, C) infectados por el PTV-A, (B) infectados por el PTV-B, y (D) ratones simulados infectados en el día 3 pi Día 4 bazos de infectados PTV-A-(E) y (F) infectado PTV-B-ratones. Los tejidos se tiñeron con hematoxilina y eosina. Todas las imágenes son 40 × magnificación, con la excepción de (C), que es 80 ×.
Del mismo modo, el bazo de los ratones infectados con PTV-A eran histológicamente normal hasta el día 3, cuando linfolisis estaba presente, que se caracteriza por la fragmentación celular y picnosis nuclear, dentro de vainas periarteriolares ( Fig. 2 E).Células degeneradas y macrófagos que contienen hemosiderina y restos celulares también fueron esparcidos por todo el intersticio esplénica. Los bazos de ratones infectados-PTV-B eran histológicamente normal ( Fig. 2 F). Duodenos, glándulas suprarrenales, y los cerebros de los ratones infectados con el PTV todas aparecieron histológicamente normales, independientemente de la cepa del virus desafío.
Hemos cuantificado la carga de virus sistémico y el tejido mediante la determinación de CCID 50 / ml de suero o g de tejido ( Figs. 3 AE). En todos los casos, el virus infeccioso era detectable en PTV-A en suero infectado ratón C57BL / 6J y tejidos de 1 a 3 días antes de animales infectados-PTV-B, sin evidencia de carga virus suero o el cerebro en cualquier momento después de la exposición PTV-B. No había ningún virus infeccioso detectable en el duodeno de los animales infectados con cualquiera de PTV-A o B-PTV (datos no mostrados).
- Fig. 3.La media de los títulos de virus, Alt y IFN-β en muestras de suero o tejido de infectados por el PTV ratones C57BL / 6J. Los ratones fueron desafiados por vía subcutánea con PTV-A o PTV-B y grupos de ratones ( n = 3 por cepa) fueron sacrificados a diario en los días 1-5 pi para la recogida de los sueros, hígados, bazos, las glándulas suprarrenales y el cerebro. (A-E) Tejido carga viral en el registro de 10 CCID50 / ml, se determinó g o tejido en Vero 76 células. La intersección de la x con el eje x y eje x refleja el límite de detección del ensayo. (F) Suero ALT se cuantificó usando un ensayo de actividad enzimática cinética. (G) Serum IFN-β se determinó por ELISA. Los valores representan la media y la desviación estándar de grupos de animales. Debido a la mortalidad antes del día del sacrificio, los datos para la cepa Adames en los días 4 y 5 eran de dos ratones.
Para evaluar el daño hepático, también cuantificamos las concentraciones de ALT en suero en los animales infectados por el PTV ( Fig. 3 F). El día 3, los animales inoculados con PTV-A tenían un pico pronunciado en ALT, alcanzando un máximo a una concentración media de ~ 7,000 UI / ml. Los niveles disminuyeron sustancialmente por día 4 (~ 3400 IU / ml), y volvieron a los niveles basales cerca por día 5. No hubo un aumento notable en las concentraciones de ALT en los animales infectados-PTV-B durante todo el periodo de muestreo 5-día.
Infección PTV-B en ratones no induce IFN-β sistémica
Los niveles séricos de IFN-β se determinaron durante el curso de la infección por PTV ELISA ( Fig. 3 G). En ratones infectados con PTV-A, IFN-β sistémica fue primero detectable día 2, con niveles altos detectados en 2 de 3 animales. En el día 3 de la infección, los tres animales tenían altos niveles de suero de IFN-β, un promedio de 7240 pg / ml, con niveles decrecientes 4 y 5 días pi (1990 y 2045 pg / ml, respectivamente).Serum IFN-β sólo se detectó a niveles muy bajos (~ 190 pg / ml) en el día 4 en dos de tres animales infectados con PTV-B. Un experimento similar medición de los niveles de viremia y de IFN-β se realizó con animales impugnadas por vía intraperitoneal (ip) en un intento por lograr una mayor carga viral y el IFN de tipo I de inducción en PTV-B-ratones infectados; Sin embargo, los resultados fueron similares a lo que fue visto con la inoculación del virus subcutánea (sc) (datos no mostrados).
Los resultados anteriores argumentaron contra más rápida y de mayor nivel de inducción sistémica de IFN por PTV-B que juega un papel en la resistencia a la infección por PTV-B en ratones, como se sugiere para hamsters ( Perrone et al., 2007 ). Aunque los hámsters no sucumben a la enfermedad tras la infección letal con PTV-B, presentan anterior con niveles elevados circulantes de IFN-β en comparación con PTV-A-animales infectados, que se cree que es un factor en la resistencia a PTV-B. Desde que se observó muy poca o ninguna producción de IFN por los ratones infectados con la cepa Balliet, hemos tratado de investigar si el sistema de IFN era importante para la supervivencia del ratón de infección PTV-B. Se utilizó STAT-1 knock-out (KO) los ratones para determinar si la vía de señalización de IFN desempeña un papel importante en la resistencia a murino PTV-B.
Se requiere IFN STAT-1 vía de señalización de protección contra la infección PTV-B
Los ratones desafiados con PTV-B no presentan con viremia o signos físicos de la enfermedad. Sin embargo, cuando los ratones deficientes en STAT-1 fueron infectadas con PTV-B, 100% de letalidad se logró ( Fig. 4 ). Infectado-PTV-B Moribund ratones STAT-1 KO tenía modesto a altos títulos de virus infecciosos sistémica y en el hígado y el bazo ( Tabla 1 ). No hay muestras fueron examinadas a partir de ratones 129S6 WT infectadas con PTV-B, ya que ninguno de los animales se convirtió moribundo y fácilmente despejó la infección. Debido signos de la enfermedad estaban ausentes, es probable que los títulos de virus sería muy baja o indetectable en estos animales, como fue el caso en ratones C57BL / 6J. Infectada por el PTV-B STAT-1 ratones KO también tuvieron alta ALT en suero, lo que indica que estaban plagados de enfermedades hepáticas característico de PTV-Una infección en ratones WT.
- Fig. 4.La supervivencia de los ratones KO STAT-1 infectadas con PTV. Los ratones se estimularon de forma subcutánea, ya sea con la cepa del virus y observaron diariamente para la mortalidad por una duración de 14 días. KO frente a los datos de supervivencia WT se compararon para cada cepa del virus mediante el análisis de log-rank, p = 0,0058 para el PTV-A, p = 0,0006 para el PTV-B. La supervivencia de los ratones infectados KO-PTV-A difirió significativamente de la de PTV-B infectado ratones KO ( p = 0,0026).
- Tabla 1.El análisis de parámetros de Enfermedades en moribunda STAT-1 KO vs WT ratones una .
- la
- Los animales fueron sacrificados al moribundo. El suero y tejidos (hígado, bazo y cerebro) se recogieron para análisis de virus y ALT.
- b
- Animal murió antes de que pudiera obtenerse suero.
- c
- El virus infeccioso está por debajo del límite de detección.
En los animales infectados por el PTV-A moribundos, los ratones WT mostró signos de enfermedad modestos (piel de volantes y la disminución de movimiento), con manifestaciones más graves observados en los ratones KO. Ratones WT tenido suero modesto, el hígado, el bazo y los títulos de virus, mientras que los ratones KO tenía cargas virales de 2 a 3 log 10 más alto ( Tabla 1 ). Curiosamente, los animales KO infectadas con PTV-A también tenían títulos de virus relativamente altas del cerebro en comparación con los animales WT en el que el virus era indetectable. Se observaron altos niveles similares de ALT sérica en el momento de la muerte en ratones WT y KO infectados por el PTV-A, aunque las concentraciones comparables puede haber sido debido a la saturación del ensayo ALT limitando su resolución a niveles tan altos.
PTV-B tiene una ligera ventaja de crecimiento en Vero 76 células, pero no los macrófagos primarios de ratón
En la comparación de las tasas de crecimiento de las dos cepas PTV, encontramos que PTV-A es más lenta para producir el efecto citopático (CPE) en células Vero 76-interferón incompetente ( emeny y Morgan, 1979 y Mosca y Pitha, 1986 ) con relación a PTV-B (datos no mostrados). Para determinar la eficiencia de crecimiento de las cepas PTV, se infectaron monocapas de Vero 76 con una baja multiplicidad de infección (MOI) de 0,0005 y sobrenadantes recogidos cada día a 6 días pi acuerdo con la observación de que el desarrollo CPE se retrasó en PTV-A infectadas por células, hubo una ligera pero significativa ventaja de crecimiento con PTV-B, a pesar de ambos virus que crecen aproximadamente a la misma carga pico ( Fig. 5 A). Después de haber sido aprobada una vez a través hámsters, se pensaba que nuestra PTV-Una acción a ser menos adecuado para el crecimiento in vitro en comparación con PTV-B. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre el crecimiento de la población actual y una PTV-Una acción estrictamente a pases en cultivo celular (datos no mostrados).Anteriores trabajos de Perrone et al. ( 2007 ) no informaron una diferencia tensión en el crecimiento de las células Vero; Sin embargo, las diferencias en la historia de pasaje y el MOI utilizada en el presente estudio pueden haber contribuido a la ligera ventaja de crecimiento PTV-B se observó en Vero 76 células.
- Fig. 5.Crecimiento PTV en (A) Vero 76 y (B) cultivos de macrófagos primarios. Las células fueron infectadas con PTV-A o PTV-B a una MOI de 0,0005. Los títulos de virus en el día pi indicado se resolvieron mediante CCID 50 determinación en Vero 76 células. Curvas de crecimiento en células Vero 76 diferían significativamente por ANOVA de dos vías ( p <0 76="" con="" datos="" de="" em="" experimentos="" fagos.="" independientes="" macr="" nbsp="" o="" os="" representativos="" son="" style="border: 0px; margin: 0px; padding: 0px; vertical-align: baseline;" tres="" vero="">p
En los macrófagos primarios expuestos a la misma dosis infecciosa baja (MOI 0.0005) de las cepas de PTV, la replicación viral sólo fue evidente durante los 2 primeros días de la infección, alcanzando ~ 3,7 log 10 CCID 50 / ml en el día 1 y alcanzando un máximo de ~ 4,6 log 10 CCID 50 / ml en el día 2 ( Fig. 5 B). Los títulos que van desde 4,0 hasta 4,5 log10 CCID 50 / ml fueron sostenidos por el resto del periodo de muestreo de 5 días. Los análisis estadísticos revelaron diferencias significativas en la eficiencia de crecimiento entre las dos cepas de virus en estas células de IFN-competente.
PTV-B provoca una respuesta de IFN-β potente en macrófagos primarios de ratón
Estamos próximos investigó PTV inducción de IFN-β en los macrófagos primarios. Los experimentos se llevaron a cabo de manera similar a los estudios de la curva de crecimiento, pero el uso de una dosis más alta de virus infeccioso (MOI de 0,05). Aunque se observó un patrón similar de expresión de IFN-β en las primeras 48 h de infección, las concentraciones fueron significativamente ( p <0 en="" id="bfig6" las="" mayor="" muestras="" ptv-b="" span="" style="border: 0px; margin: 0px; padding: 0px; vertical-align: baseline;">Fig. 6
). Vimos por primera vez IFN-β en los sobrenadantes a partir de las 24 h pi, en el cual las células infectadas de tiempo-PTV-B producen ~ 14 veces más IFN-β que las células PTV-A-infectadas (374 frente a 27 pg / ml, respectivamente) . Concentraciones de IFN-β alcanzó su punto máximo a las 36 h, llegando a 700 pg / ml en muestras PTV-B y 133 en muestras de PTV-B (diferencia de 5,3 veces). A las 48 h, los niveles de IFN-β en muestras de PTV-A habían disminuido y continuó disminuyendo durante el resto del experimento.- Fig. 6.Liberación de IFN-β por los macrófagos infectados por el PTV. Las células fueron infectadas con PTV-A o PTV-B a una MOI de 0,05. En los puntos de tiempo indicados, la concentración de IFN-β en sobrenadantes de cultivo de células se analizó por ELISA. Curvas de inducción de IFN-β diferían significativamente por ANOVA de dos vías ( p <0 datos="" de="" dos="" em="" en="" experimentos="" independientes.="" los="" nbsp="" obtenidos="" os="" representativos="" resultados="" son="" style="border: 0px; margin: 0px; padding: 0px; vertical-align: baseline;">p
Diferencias de las cepas PTV en la estimulación de la acogida IFN señalización y vías de respuesta
Aunque la producción de IFN-β no afectó significativamente el crecimiento en los macrófagos, los ratones STAT-1 KO son incapaces de controlar la infección por PTV-B.Esto nos llevó a examinar los genes implicados en las vías de IFN que contribuyen a la defensa del huésped y su regulación en respuesta a las infecciones PTV. Se cosecharon RNA total a partir de macrófagos infectados de ratón primario y se midió IFN y genes relacionados por arrays cuantitativos de RT-PCR para determinar diferencias en la expresión. Había un gran número de cambios de expresión génica comparando el punto de tiempo 0 h, a los otros puntos de tiempo respectivos de cada una de las infecciones PTV (de datos); Sin embargo, el foco de nuestro esfuerzo fue investigar las diferencias entre las células infectadas por el PTV-B PTV-A y. Aunque varios genes en las vías de señalización y de respuesta de IFN fueron inducidos cuando los macrófagos se infectaron con cualquiera de PTV, IFNB1 era el único que difería significativamente ( p = 0,019) entre los dos infecciones en 16 h, con macrófagos infectados-PTV-B que tiene una aumento de 4,7 veces en la expresión relativa a las células infectadas-A-PTV ( Fig. 7). La información completa respecto a los perfiles globales de expresión génica durante la infección con un virus en particular en cada momento se puede encontrar en las tablas de datos suplementarios y figuras.
- Fig. 7.Los patrones de expresión en el tiempo de los genes con diferencias significativas entre PTV-A y macrófagos peritoneales infectados por PTV-B en uno o más puntos de tiempo. Las células se infectaron con una MOI de 0,05 y el ARN total se recogieron en los puntos de tiempo indicados. Las muestras se analizaron mediante qRT-PCR arrays de expresión génica. Fold-cambio representa el cambio en la expresión de genes desde el tiempo 0 hasta el punto de tiempo indicado. ⁎ p <0 em="" nbsp="" style="border: 0px; margin: 0px; padding: 0px; vertical-align: baseline;">IFNB:
Por 24 h pi, 16 genes variaron significativam
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