Clasificación de virus

Virus a ADN

Podoviridae es una familia de virus infectivos para bacterias (bacteriófagos) pertenecientes al Grupo I de la Clasificación de Baltimore. Se caracterizan por: poseer un genoma con DNA de cadena doble como ácido nucleico y por albergar dicha información genética en una cápside carente de envoltura viral y estructuralmente definida por una simetría binal, poseyendo una cabeza icosaédrica y una cola helicoidal corta.

Podoviridae novedosa familia de bacteriófago que infecta Weissella cibariaAislado del Kimchi

INTRODUCCIÓN

Kimchi, un plato tradicional coreano, se fabrica mediante fermentación de vegetales como la col china y rábano. Cientos de variedades de kimchi son producidos por la adición de condimentos diferentes, tales como las cebolletas, pimientos de chile en polvo, el ajo, el jengibre, pescados y mariscos fermentados. El ácido láctico producido durante la fermentación contribuye a la preservación y el kimchi da su sabor amargo característico. maduración y conservación apropiadas están aseguradas por un 2 a 5% (peso / vol) contenido de sal y la fermentación anaeróbica a bajas temperaturas. Kimchi se prepara tradicionalmente por fermentación espontánea por las bacterias del ácido láctico (LAB) indígenas de los ingredientes vegetales.Sin embargo, los cultivos iniciadores se han desarrollado con el fin de controlar mejor la fermentación y por lo tanto mejorar la calidad, la seguridad y vida de almacenamiento del producto fermentado ( 15 , 16 , 20 , 24). Varias especies de laboratorio han sido identificados como posibles contribuyentes en fermentaciones kimchi, incluidas las especies de los géneros Leuconostoc, Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, yWeissella ( 6 , 18 , 19 , 32 , 35 , 36 , 38 - 41 , 51 , ​​53 , 57 ). especies Weissella aisladas de kimchi incluyenWeissella confusa, Weissella kimchii, y Weissella koreensis. Estas bacterias son abundantes tarde en el proceso de fermentación y pueden continuar creciendo durante el almacenamiento a bajas temperaturas (-1 ° C). Especies Weissella por lo tanto se han asociado con el sabor ácido excesivo de productos kimchi overripened. Las especies Weissella kimchii, descrita por primera vez en 2002 ( 19 ), fue reclasificado comocibaria Weissella en 2004 ( 9 , 23 ).

El proceso de fermentación kimchi se caracteriza por una fase inicial heterofermentativo, seguida de una fase homofermentativa, y la producción de kimchi de alta calidad se basa en la sucesión adecuada de las diferentes especies de laboratorio. Los bacteriófagos se han reportado para afectar a las sucesiones de la comunidad bacteriana en fermentación sauerkraut ( 42 ) y son aparentemente responsables de la variabilidad observada en tales fermentaciones vegetales ( 8 ). En un estudio reciente, se encontró una alta abundancia de ADN del fago en la fermentación del kimchi ( 32 ). Esto indica que los bacteriófagos muy probablemente también afectan a la producción de kimchi. La infección por bacteriófagos es un problema bien reconocido en las fermentaciones industriales de alimentos, y se emplean una amplia gama de contramedidas para su control ( 50 ). Más conocimiento sobre cómo bacteriófagos afectan a la fermentación de alimentos industrial será de gran valor para la mejora de las contramedidas de fagos.

Recientemente, se informó de un bacteriófago que infecta una cepa de cultivo iniciador Weissella cibariautilizado en la fermentación de tailandés Nham salchicha ( 54 ). Los bacteriófagos probabilidades de infectar al género Weissella También se informó en una fermentación chucrut, pero el aislado bacteriano no fue identificado de manera concluyente ( 42 ). Aquí, se presenta en una novela bacteriófago Weissella cibaria,φYS61, aislada de la fermentación del kimchi y presentamos la primera secuencia completa del genoma de un fago que infecta al género Weissella.

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MATERIALES Y MÉTODOS

aislamiento de bacteriófagos, el crecimiento y la purificación.

Bacteriófago φYS61 se aisló de una comerciales kimchi de col china comprados en un hipermercado de Corea 1 semana después de la fabricación. Para el aislamiento de bacteriófagos y determinación de los títulos de fagos, diario de fase cepa huésped de células YS61 Cibaria Weissella se inocularon (≈3 × 10 7 UFC / ml) en DeMANN-Rogosa-Sharpe ([SRA] Oxoid, Basingstoke, Hampshire, Reino Unido) suave agar suplementado con CaCl 2 5 mM (MRS-C) y mon inclinados de agar MRS-C. suspensiones de fagos fueron vistos en la parte superior, y se aislaron las placas y / o cuentan después de incubación durante la noche a 30 ° C. amplificación bacteriófago se lleva a cabo a 30 ° C en medio MRS-C. Las células se cultivaron a una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0,3 a 0,4 antes de ser infectado con un volumen 1/20 de filtrado (0,45-micras de tamaño de poro) lisado de fago y se incubaron hasta que se produjo la lisis (aproximadamente 2 h). La multiplicidad de infección (MOI) fue de aproximadamente 10. La lisis se completó mediante la adición de 0,5% de cloroformo y 1 M NaCl. La mezcla se incubó en hielo durante 1 h antes de cloroformo y los restos celulares se eliminaron por centrifugación. Las partículas de fago se precipitaron con polietilenglicol (PEG) y se purificó en cloruro de cesio (CsCl) gradientes como se describe en otra parte ( 12 ), excepto que todos los pasos de centrifugación antes de la ultracentrifugación en gradientes de CsCl se lleva a cabo a 5000 × g y 4 ° C. Partículas de fago purificados se dializaron frente a tampón TM (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 100 mM, 10 mM MgCl 2, 10 mM CaCl 2) y se almacenaron a 4 ° C. Análisis de la curva de crecimiento de una sola etapa se realizó esencialmente como se describe en otro lugar ( 31 ).

la purificación de ADN.

Phage se precipitó con PEG, se trató con 1 mg / ml de DNasa I y 10 mg / ml de RNasa A durante 1 hora a 37 ° C y después se incubó durante 1 hora a 65 ° C con EDTA 25 mM, 0,5% de dodecilsulfato de sodio (SDS) y 200 mg / ml de proteinasa K (Qiagen). Después de la eliminación de PEG residual por extracción con cloroformo, extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol estándar se utilizaron para obtener el ADN del fago.

Secuenciación y análisis de secuencias.

Una biblioteca de escopeta se realizó en pUC19 ( 62 ) después de la digestión parcial con Sau3A. Insertar tamaños variaron de 0,3 a 5 kb, con un promedio aproximado de 1,6 kb. Los clones se secuenciaron utilizando BigDye, versión 3.1, la química (Applied Biosystems, Foster City, CA) y cebadores estándar M13. Las lagunas se llenaron de paseo con cebador de ADN genómico amplificado por PCR. la secuencia de montaje, los análisis bioinformáticas, y la anotación del genoma se realizaron utilizando el CLC principal banco de trabajo, versión 6.1.1 (CLC bio, Aarhus, Dinamarca).Marcos de lectura abierta (ORFs) y sitios de unión a ribosomas (RBS) se identificaron utilizando el despilfarrador ( 30 ) herramienta en línea ( http://prodigal.ornl.org ), y búsquedas de homología se realizaron utilizando BLASTP y PSI-BLAST build 2.2.25 + ( 3 , 4 ) en www.ncbi.nlm.nih.gov (acceso en junio de 2012). Dominios conservados fueron encontrados por la búsqueda de la base de datos de dominios Conservadas (CDD) ( 44 - 46 ) en www.ncbi.nih.gov (acceso en junio de 2012). Árboles filogenéticos se producen en www.phylogeny.fr (versión 2) ( 17 , 21 , 28 ). Los promotores se predijo por la inspección manual de las regiones intergénicas y por el uso de la herramienta Prokaryote Promoter Prediction (http://bioinformatics.biol.rug.nl/websoftware/ppp ) ( 63 ). terminadores de transcripción putativo se encontraron a través de la inspección manual de ARN estructuras secundarias predichas utilizando el software CLC. La figura comparación del genoma (ver Fig. 5 ) se produjo usando Easyfig ( 60 ).

Fig 5

La comparación del genoma de φYS61 y sus dos parientes más cercanos, Bacillus fago φ29 ( NC_011048 ) y Streptococcus fago Cp-1( ...

Análisis de proteínas estructurales.

Partículas de fago purificados se desnaturalizaron a 100 ° C durante 10 min en tampón de Laemmli ( 37 ) y se analizaron por electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Las proteínas se tiñeron con azul brillante de Coomassie R250 (Bio-Rad).Bandas de proteínas visibles fueron extirpados, tripsina tratados, y se extrajeron como se ha descrito previamente ( 56 ). Péptidos extraídos se desalaron con C 18 consejos de la etapa ( 55 ). Los péptidos se eluyeron con 70% de acetonitrilo antes de ser mezclado con un volumen igual de solución de matriz (15 mg / ml de alfa-ciano-4-hidroxi ácido cinámico en etanol-acetonitrilo a 1: 1) y se aplicó a una desorción por láser asistida por matriz ionización (MALDI) tablilla de puntería (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania).toma de huellas dactilares péptido de masas (PMF) y espectrometría de masas en tándem (MS / MS) se realizaron en un tiempo Flex MALDI-Ultra tándem de vuelo (MALDI-TOF / TOF) instrumento (Bruker Daltonik). El grupo de masa MALDI-TOF / MS fue de 800 a 4.000 Da, con una exactitud de masa de 50 ppm. El rango de masas para la adquisición de datos de MALDI-TOF / MS fue de 800 a 4.000 Da, y los espectros fueron calibrados externamente utilizando una mezcla de calibración péptido (Bruker Daltonik) que van desde 757 a 3.147 Da. Identificación de proteínas se llevó a cabo utilizando el software Mascot (Matrix Science Ltd., Londres, Reino Unido) con las búsquedas contra la base de datos NCBI no redundante (nr) y una base de datos que contiene toda predijo secuencias ORF (≥ 50 aminoácidos) de la secuencia del genoma de φYS61.

Microscopio de electrones.

muestras de fagos purificados se tiñeron negativamente con 2% (vol peso /) ácido fosfotúngstico (pH 7,2) en una cuadrícula de membrana de carbono-Formvar y examinadas por microscopía electrónica de transmisión (TEM). análisis TEM se realizó en un instrumento EF-TEM Leo 912AB (Carl Zeiss Inc., Alemania) a un voltaje de aceleración de 120 kV. Las micrografías electrónicas fueron tomadas con un aumento de × 200.000 en el Instituto de Ciencias Básicas Corea en Chuneheon. Los tamaños de fago se determinaron a partir de la media de cinco mediciones independientes.

análisis de transcripción.

Setenta y dos cebadores φYS61-específicos con sitios de unión intercalados en el genoma φYS61 (véase la Tabla S1 en el material complementario) se utilizaron para identificar los límites de transcripción φYS61. Los cebadores se utilizaron para establecer la amplificación por PCR de la transcriptasa inversa de las regiones intergénicas utilizando ARN de bacterias huésped infectadas como la plantilla. La falta de amplificación indica la interrupción de la plantilla de ARN. El ADN genómico del fago se utilizó como control positivo. Iniciar y detener sitios para la transcripción se dedujeron de supuestos promotores y terminadores se encuentran en la secuencia genómica. Los métodos utilizados para sincronizar las infecciones, purificar el ARN y producir ADNc se describen a continuación.

La bacteria huésped se cultivó hasta una DO 600 de 0,3 en 50 ml de medio MRS-C, infectadas con fagos a una MOI de 1 a 2, se incubaron en hielo durante 30 min, y luego se llevó rápidamente a 30 ° C en un baño de agua. Después de 10 y 36 min, se tomaron muestras de 10 ml, y las células se lavaron dos veces en tampón enfriado con hielo Tris-EDTA (TE) (pH 7,4) y rápidamente congeladas en etanol y hielo. La disrupción celular en un batidor FP120 FastPrep talón (Bio101 / Savant) y el aislamiento de ARN total mediante el uso de un RNeasy Minikit (Qiagen) se realizaron como se describe en otro lugar ( 59 ). Para evitar el arrastre de ADN residual, un adicional de digerir con RNasa libre de DNasa I (Qiagen) en tampón RDD (Qiagen) se realizó a 37 ° C durante 30 minutos. DNasa se eliminó por extracción con fenol-cloroformo, y el ARN se precipitó con etanol a -20 ° C durante la noche. El ARN se lavó una vez en 70% (vol / vol) de etanol en pirocarbonato de dietilo (DEPC) de agua tratada y una vez en 96% de etanol, se secó durante 5 min a 45 ° C en un SpeedVac concentrador SPD 2010 (Savant) y se disolvió en agua libre de RNasa. las concentraciones de ARN se midieron en un espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop Technologies), y la integridad del ARN se evaluó utilizando un kit de ARN 600 Nano LabChip y un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) según las instrucciones del fabricante. Se sintetizó ADNc mediante el uso de cebadores hexámeros aleatorios y un kit Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.

número de secuencia de nucleótidos de adhesión.

La secuencia del genoma de fagos φYS61 ha sido depositado en la base de datos GenBank con la adhesión number JQ341413 .

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RESULTADOS

ΦYS61 bacteriófago que infecta Weissella cibaria YS61 se aisló de una kimchi vegetal 1 semanas de edad, comprados en un hipermercado de Corea. Para entender mejor los bacteriófagos que infectan el géneroWeissella y posiblemente ganar la penetración en las poblaciones microbianas dinámicos de fermentación kimchi, la virulencia, la morfología, y el genoma de φYS61 fueron exploradas.

Virulencia y desarrollo de resistencias.

Las características de infección de φYS61 se evaluaron mediante análisis de crecimiento de un solo paso. Después de un periodo de latencia de unos 40 minutos, el ciclo de vida lítico terminó con la liberación de aproximadamente 100 fagos progenie. Cuando manchado en el host cepa YS61 en MRS-C soft-agar, φYS61 produce placas pequeñas (aproximadamente 0,5 mm de diámetro) con bordes ligeramente difusas. Se observó el crecimiento de las bacterias resistentes a los fagos durante la amplificación del fago. Para investigar esto, YS61 y mezclas de YS61 y φYS61 (MOI de 0,01) se inocularon en placas MRS-C. Los recuentos de colonias para los mutantes resistentes a los fagos fueron sólo 10.000 veces menor que el recuento de células no infectadas, lo que demuestra la alta frecuencia de desarrollo de resistencia contra φYS61. Se aislaron doce colonias de fagos-insensible (YS61-R1 a -R12), fundido en agar blando, y desafiados con una serie de dilución de 10 veces de φYS61. En comparación con YS61, dos de los aislados mostraron sensibilidades de fago de tipo salvaje en este ensayo; Sin embargo, las placas producidas en estos aislados diferían de los de YS61 como estaban difusa y difícil de identificar. Siete aislamientos muestran morfologías difusa de placas similares y mostraron una reducción de 2 a 3 log en el recuento de la placa en comparación con la cepa YS61. Un aislado (YS61-R10) mostró una reducción de 3 log en el recuento de placa pero con morfología de la placa claro, similar a la mostrada por el YS61 de tipo salvaje.Dos cepas (YS61-R2 y -R3) mostraron una resistencia completa a la infección φYS61. Todos menos dos aislamientos conservaron su sensibilidad a los fagos reducida después de repetidos cultivos sin desafío del fago. YS61-R10 revertido a un fenotipo sensible a fagos de tipo salvaje, mientras que el más persistente aislado YS61-R3 sólo aparece ligera inhibición del crecimiento cuando fueron estimulados con una suspensión de fagos sin diluir (2 × 10 8 PFU / ml).

Morfología.

La microscopía electrónica ( Fig. 1 ) mostró que fagos φYS61 tiene una cápside moderadamente alargado (85 por 36 nm) y una cola no contráctil corto. Esto identificó φYS61 como miembro de laPodoviridae del morfotipo C2 ( 1 ). La placa base distinta (28 nm de ancho) tiene seis apéndices (6 nm de longitud) y un pico central. La distancia de la unión entre la cabeza-cola a la punta del punzón se midió a 29 nm.

Siphoviridae es una familia de virus infectivos para bacterias (bacteriófagos) pertenecientes al Grupo I de la Clasificación de Baltimore. Se caracterizan por: poseer un genoma con ADN de cadena doble lineal como ácido nucleico y por albergar dicha información genética en una cápside carente de envoltura viral y estructuralmente definida por una simetría binal, poseyendo una cabeza icosaédrica y una cola helicoidal larga. La cápside tiene un diámetro de 55-60 nm y la cola puede alcanzar los 570 nm.

Fago Bxb1 de Mycobacterium, un virus tipo L5.

• Género λ-like viruses; especie tipo: Fago λ de Enterobacteria
• Género T1-like viruses; especie tipo: Fago T1 de Enterobacteria
• Género T5-like viruses; especie tipo: Fago T5 de Enterobacteria
• Género c2-like viruses; especie tipo: Fago c2 de Lactococcus
• Género L5-like viruses; especie tipo: Fago L5 de Mycobacterium
• Género ψM1-like viruses; especie tipo: Fago ψM1 de Methanobacterium
• Género φC31-like viruses; especie tipo: Fago φC31 de Streptomyces
• Género N15-like viruses; especie tipo: Fago N15 de Enterobacteria

Siphoviridae son una familia de virus de ADN de doble cadena que infectan sólo las bacterias. Los rasgos característicos de esta familia es la presencia de una cabeza y una cola no contráctil.

Hay por lo menos 256 especies de esta familia.

Virología

Los viriones son sin cubierta y tienen una larga cola no contráctil filamentosas y una cápside isométrica o una cápside alargada. La cápside icosaédrica es ~ 55-60 nm de diámetro. Se compone de 72 capsómeros que aparecen en el contorno hexagonal.

La cruz filamentosa bandas cola puede llegar a 570 nm. Tiene una anchura de y una anchura de ~ 8 nm y es no contráctil. Tiene terminal de corto y fibras subterminal.

El genoma es bicatenario y lineal. Es típicamente ~ 50 kilobases de longitud y contiene ~ 70 genes. El contenido de guanina citosina es ~ 52%.

Taxonomía

La mayoría de los virus que se han caracterizado como Siphoviridae en base a su morfología no caer en cualquiera de los géneros formentioned y en la actualidad están clasificados como 'Siphoviridae sin clasificar ".

La organización de los genes en L5-, lambda-, phiC31-, psiM2-, Sfi21-, Sfi11-, géneros sk1-y TM4-como sugiere que éstos pueden formar un supergrupo lamba.

Los virus c2-como tienen cabezas achatadas.

Los siguientes virus se han clasificado en géneros:

• Género virus c2-similares; especie tipo: Lactococcus fago c2
  • Especie:
    • Lactococcus fago bIL67
    • Lactococcus fago c2

• Virus Género L5-similares; especie tipo: Mycobacterium fagos L5
  • Especie:
    • Micobacterias fago D29
    • Mycobacterium fagos L5

• Género virus Lambda-como; especie tipo: Enterobacterias fagos lambda
  • Especie:
    • Enterobacterias fagos HK022
    • Enterobacterias fagos HK97
    • Enterobacterias fago lambda

• Género virus N15-similares; especie tipo: Enterobacterias fagos N15
  • Especies
    • Enterobacterias fagos N15

• Género virus PhiC31 similares; especie tipo: Streptomyces fago PhiC31
  • Especies
    • Streptomyces fago phiC31

• Género virus PsiM1 similares; especie tipo: Methanobacterium fago psiM1
  • Especies
    • Methanobacterium fago psiM1

• Género virus sk1-como
  • Especies

• Género virus Sfi11-como
  • Especies

• Género virus R1T similares
  • Especies
    • Lactococcus fago R1T

• Género virus Sfi21-como
  • Especies
    • Lactobacillus casei fago A2
    • Streptococcus thermophilus fago 7201

• Género virus SPbeta similares; especie tipo: Bacillus fago SPbeta
  • Especies
    • Bacillus fago SPbeta

• Género virus T1-similares; especie tipo: Enterobacterias fagos T1
  • Especies
    • Fago T1 Enterobacterias

• Género virus T5-similares; especie tipo: Enterobacterias fagos T5
  • Especie:
    • Enterobacterias fagos T5
    • Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum bacteriófago My1
    • Vibrio fago 149

Sin clasificar

• Especies
• fago HF1
• fago HF2
• mycobacteriophage TM4
• mycobacteriophage Adephagia
• mycobacteriophage Anaya
• mycobacteriophage Angelica
• mycobacteriophage CrimD
• mycobacteriophage Pixie
• Staphylococcus aureus fago SAP-26