sábado, 26 de marzo de 2016

Estudios de la microbiología


TRANSDUCCIÓN

PREÁMBULO: AVANCE DE CONCEPTOS SOBRE BACTERIÓFAGOS

Antes de entrar de lleno en el tema de la transducción, conviene que adelantemos algunas ideas generales sobre los virus bacterianos con genomio de ADN, que nos serán útiles para el presente capítulo.
  • El proceso de la infección comienza cuando la partícula del fago se adsorbe sobre receptores en la superficie de la bacteria.
  • Inyecta el ADN contenido en su cápsida. Entrada del ADN fágico a la célula hospedadora. Este ADN tenderá a expresar su programa genético, pero el resultado final dependerá de que el fago sea de tipo virulento o de tipo moderado:
A. Si el fago es de tipo virulento:
Se expresa el programa genético vegetativo (lítico) de su genomio, destinado a producir muchas copias de ese ADN fágico, y muchas cápsidas proteicas. En el interior de cada cápsida se introduce ("se empaqueta") una copia del genomio del fago. Las nuevas partículas (viriones), una vez completadas y ensambladas, lisan a la bacteria, quedando libres en el medio y preparadas para infectar nuevas células de la especie bacteriana hospedadora.
B. Si el fago es de tipo moderado pueden darse dos alternativas distintas:
  • El ADN inyectado expresa su información vegetativa, de modo que se produce un ciclo lítico, productivo de nuevos viriones, similar al descrito para los fagos virulentos; o bien
  • Se pueden reprimir las funciones líticas del fago. En este caso el ADN del fago establece una relación benigna con su hospedador: suele incorporarse por recombinación específica de sitio conservativa (ver tema 24), integrándose en el genóforo bacteriano. A partir de este momento, el ADN del fago (que ahora se llama profago) permanece en esta situación, como una porción más del genomio de la bacteria, replicándose como parte de éste. El profago mantiene reprimidas todas sus funciones líticas (vegetativas), expresando solamente una proteína represora de aquellas funciones (todo esto lo veremos en detalle en la sección de Virología). La célula bacteriana portadora de un profago se denomina lisogénica, y el clon derivado de ella, clon lisogénico. Este tipo de relación benigna es estable, pero de forma espontánea, en algunas de las células del clon lisogénico el profago "despierta" y se activan sus funciones vegetativas: el profago se escinde del genomio bacteriano (de nuevo por recombinación específica) y expresa su programa lítico, que conduce a la producción de nuevos viriones, con lisis de la bacteria. Este fenómeno recibe el nombre de inducción. Artificialmente se puede provocar la inducción de casi todo el cultivo lisogénico, tratándolo con determinados agentes (luz UV, mitomicina, etc.) que dañan el ADN y que inducen el sistema SOS.

2. APROXIMACIÓN HISTÓRICA Y CONCEPTOS GENERALES SOBRE LA TRANSDUCCIÓN

La transducción fue cronológicamente el último sistema de transferencia genética bacteriana que se descubrió.
En 1951 Joshua Lederberg y su colaborador Zinder estaban investigando en Salmonella la posible existencia de un sistema de conjugación al estilo del que se acababa de descubrir en su parienteEscherichia coli (ver capítulo 27). Mezclaron dos cepas de Salmonella, cada una con un juego distinto de marcadores genéticos. (Eureka! Obtuvieron recombinantes. Descartaron que se tratara de transformación, ya que los resultados eran similares si añadían DNasa al sistema. Entonces, ¿era un fenómeno de conjugación? Realizaron el experimento del tubo en "U", con una membrana separando los dos brazos de la U, en cada uno de los cuales se colocaba una de las cepas. La membrana impide el paso de bacterias y los contactos intercelulares directos entre las dos cepas. Pues bien... seguía habiendo recombinantes. Esto descartaba, pues, que se tratara de conjugación. Se postuló que debía de existir un "agente filtrable" resistente a las nucleasas, responsable último de la transferencia genética.
¿Cuál era la naturaleza exacta del misterioso agente filtrable? Por experimentos independientes se sabía que una de las dos cepas de Salmonella producía un fago (llamado P22), de tipo moderado. Con una serie de ensayos se demostró que era precisamente este fago el responsable de los recombinantes:
  • el tratamiento de sobrenadantes de esa cepa con calor o con antisuero provocaba la inactivación tanto del fago como del agente filtrable;
  • las cepas de Salmonella resistentes a P22 (porque no adsorben el fago) no pueden interaccionar con el agente filtrable, y por lo tanto tampoco dan recombinantes;
  • finalmente, se comprobó que la cepa productora del agente filtrable poseía un fago moderado en forma de profago. La inducción de esta cepa lisogénica era la responsable de producir algunas partículas de fagos portadoras de material genético de la cepa de origen, que los fagos inyectaban posteriormente a las células de la cepa receptora.
Así pues, se acababa de descubrir un nuevo sistema de transferencia genética entre bacterias, sistema que fue bautizado con el nombre de transducción.
La transducción se puede definir como el proceso de transferencia genética desde una célula donadora a otra receptora mediatizado por partículas de bacteriófagos que contienen ADN genómico de la primera. En la transducción podemos distinguir dos estapas diferenciadas:
  1. Formación de la partícula fágica transductora: un trozo de material genético de la célula donadora se introduce en el interior de la cabeza de la cápsida de un fago. Las partículas transductoras son en cierta manera "subproductos" anómalos del ciclo normal del fago.
  2. La partícula transductora inyecta de forma habitual el ADN que porta a la célula receptora, donde este ADN puede eventualmente recombinarse y expresar su información.
La transducción descubierta por Lederberg y Zinder se llama transducción generalizada.
  • Mediante ella se puede transferir cualquier marcador del genóforo del donador, con aproximadamente la misma frecuencia relativa (de ahí el calificativo de generalizada).
  • La transducción generalizada se produce sólo como consecuencia de infecciones líticas.
  • El ADN del genomio de la bacteria donadora que es introducido en la partícula transductora suele ir sin acompañamiento de ADN del propio fago. Por ello, a esta peculiar partícula consistente en cápsida del fago que encierra sólo ADN genofórico de la bacteria se la denomina pseudovirión.
Siguiendo con la buena racha de descubrimientos, pocos años más tarde (1956), el mismo Lederberg (esta vez junto con su mujer, y con Morse) hallaron un tipo nuevo de transducción, mientras estaban estudiando el sistema del fago moderado l y su hospedador, E. coli. Este tipo de transducción recibió el nombre de transducción especializada, y sus caracteres distintivos son:
  • sólo se transfieren marcadores cromosómicos cercanos al sitio de integración del ADN del fago (profago) en la célula lisogénica (p. ej., en el caso de l , los marcadores gal o bio);
  • se produce únicamente como consecuencia de la inducción de la célula lisogénica por escisión del profago y consiguiente entrada a fase lítica, productora de nuevas partículas de fago;
  • el ADN genómico de la bacteria transportado por la partícula transductora va unido a ADN del fago;
  • la célula transductante se suele convertir en lisogénica para el fago correspondiente.

3. TRANSDUCCIÓN GENERALIZADA

Se caracteriza porque en ella se puede transferir cualquier trozo de genóforo bacteriano, con tal de que tenga un tamaño compatible con la capacidad de "empaquetado" de ADN de la cápsida del fago. La partícula transductora (pseudovirión) se forma por empaquetamiento anómalo de ADN genofórico bacteriano. En el interior de la cabeza del pseudovirión sólo existe ADN bacteriano, sin ADN del fago. Las partículas transductoras sólo se forman como consecuencia de infecciones líticas del fago.
Mecanismo de la transducción generalizada promovida por el fago P22 de S. typhimurium.
1ª fase: producción de las partículas fágicas transductoras (=pseudoviriones): Porencapsidamiento ilegítimo de ADN cromosómico. De vez en cuando, el sistema fágico encargado de introducir su ADN en la cápsida (sistema pac), se "equivoca", y en su lugar introduce un trozo de tamaño equivalente del genóforo de la bacteria donde está teniendo lugar la infección.
Al parecer, el cromosoma bacteriano contiene secuencias que eventualmente pueden ser reconocidas de vez en cuando por el sistema del fago, de manera que puede introducirse un trozo de ADN deSalmonella en la cápsida.
Al final de esta fase, la célula hospedadora se lisa. El lisado (sobrenadante) contiene una mayoría de viriones auténticos y un pequeño número de pseudoviriones, cada uno con un trozo aleatorio distinto del genomio de la bacteria.
2ª fase: Destino del ADN del exogenote: Mezclemos el lisado obtenido en la fase anterior con un cultivo de la cepa receptora (dotada de marcadores genéticos adecuados). Cada pseudovirión inyecta de forma normal su ADN a una bacteria. Este ADN puede tener varios destinos posibles:
  • 1) puede ser destruido por exo- y endonucleasas citoplásmicas.
  • 2) Puede recombinarse con la región homóloga del genóforo del receptor, mediante la actuación del sistema de recombinación general dependiente de RecA. Se produce una recombinación con dos sobrecruzamientos ("crossing-overs"), que conduce a la integración de doble cadena de ese exogenote, con eliminación de la zona homóloga del endogenote.
  • 3) Puede ocurrir que el exogenote no sea ni destruido ni recombinado; este ADN puedepersistir en la célula sin replicarse. La consecuencia de esto es que cuando la célula que originalmente recibió ese ADN exógeno se divida, lo pasará solo a una de las dos células hijas, la cual a su vez la pasará a una hija en la siguiente división, y así sucesivamente. Tenemos, pues, que el exogenote se va diluyendo en el clon por transmisión unilinear: tras varias generaciones, el clon consta de n-1 células sin exogenote y una sola célula con ese exogenote. A este fenómeno se le conoce con el nombre de transducción abortiva, y es más frecuente que la transducción completa derivada de recombinación (más de 90% frente a sólo 1-5%).
La célula que alberga el exogenote abortivo puede expresar los genes de éste: por lo tanto, la célula transductante abortiva contiene proteínas derivadas del exogenote. Parte de las proteínas (en principio la mitad), pasarán a la célula hija que no reciba el exogenote en la siguiente generación. Las hijas de la hija ("las nietas no herederas del original") reciben la cuarta parte, etc... es decir, aparte de la célula hija que en cada generación hereda el exogenote, sus parientes no-herederos más cercanos reciben proteínas derivadas de la expresión previa de los genes del exogenote. Esto significa que las células no herederas pueden poseer, durante unas pocas generaciones, la función o funciones del exogenote, hasta que el producto correspondiente se diluya o se inactive.
Esto permite detectar fácilmente determinados tipos de transductantes abortivos, distinguiéndolos de los transductantes completos. Por ejemplo, si estamos seleccionando transductantes en base a la adquisición, por parte de una cepa receptora auxotrofa, de la versión silvestre del gen que tiene mutado, sembrando en placas de Petri con medio mínimo, se distinguen dos dos tipos de colonias:
colonias grandes, correspondientes a transductantes completos;
microcolonias, correspondientes a los transductantes abortivos.
  • 4) Si el exogenote es un plásmido, al llegar a la célula receptora, puede replicarse autónomamente.
  • 5) Si el exogenote contiene un transposón, éste puede insertarse en el genoma de la célula receptora.
No todos los fagos virulentos pueden actuar como mediadores de transducción generalizada. Los fagos con esta capacidad suelen ser aquellos que no degradan totalmente el ADN del hospedador inmediatamente después de entrar (de otra manera, no habría ADN intacto que transducir). Además, su sistema de empaquetamiento de ADN no debe ser muy específico: fagos como el P22 deSalmonella typhimurium o el P1 de Escherichia coli tienen un mecanismo de empaquetado secuencial de unidades de concatémeros, mecanismo que reconoce secuencias que también existen con cierta frecuencia en el genoma del hospedador.
La transducción generalizada ha sido muy útil en el análisis genético de bacterias y la construcción de nuevas cepas. El alumno seguramente estudiará en la asignatura de Genética algunas aplicaciones, incluida la elaboración de mapas de ligamiento. En las prácticas de Virología del Departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias los estudiantes realizan un interesante experimento de co-transducción que permite aplicar algunas de estas ideas.

4. TRANSDUCCIÓN ESPECIALIZADA (=RESTRINGIDA)

Recordemos que fue descubierta por el equipo de Lederberg (1956), mientras hacían experimentos de inducción de células de E. coli lisogenizadas con el fago l . Este tipo de transducción consiste en la transferencia -mediatizada por fagos moderados producidos en la inducción de un cultivo lisogénico-, de un número limitado de marcadores, correspondientes a los loci genéticos adyacentes al sitio de integración del profago. La transducción restringida nunca ocurre por infecciones líticas. El ADN transducido va unido a ADN del fago.
Mecanismo de la transducción especializada promovida por el fago l de Escherichia coli
1ª fase: Producción de los fagos transductores: Supongamos una cepa silvestre de E. coli K12 (l+), o sea, lisogénica para el fago l . Como ya sabemos, el profago se encuentra integrado entre los operones gal y bio.
  • Inducimos artificialmente este cultivo lisogénico (tratando, p. ej., con rayos UV, o con mitomicina-C). El profago desreprime sus funciones vegetativas, de modo que va a entrar en un ciclo lítico, comenzando por escindirse del lugar de integración, por medio de unarecombinación específica conservativa entre sus extremos (BOP' X POB'). Con una baja frecuencia (10--5-10--6) se producen escisiones anómalas del profago: bucles anómalos, de modo que se forman círculos que llevan una porción adyacente del cromosoma bacteriano(dependiendo de los casos, o gal o bio), y en cambio, queda un trozo del genomio del fago. De esta forma se pueden formar fagos l defectivos (l d) para alguna función fágica, pero con la "contrapartida" de ser portadores de material genofórico de la bacteria hospedadora.
  • Así pues, de esta forma se obtiene un lisado (llamado lisado LTF, de baja frecuencia de transducción), donde existe una pequeña proporción (alrededor de 10--6) de partículas defectivas del fago portadoras de ADN cromosómico. Estos viriones, por sí solos no podrían establecer lisogenia, pero si en una misma célula inyectaran su ADN un fago defectivo y otro silvestre, este último actuaría como fago auxiliador ("helper") de modo que el defectivo sí podría entonces establecer lisogenia. A continuación veremos precisamente cada una de estas dos posibilidades. (En ambos casos vamos a suponer que las partículas transductoras portan el operón silvestre gal+, y que empleamos una cepa receptora mutante gal--).
2ª fase en el caso de infectar una cepa receptora con el lisado anterior a baja multiplicidad de infección: Imaginemos que mezclamos un cultivo de la cepa receptora con un lisado LTF, a una multiplicidad de infección (m.d.i., o en inglés, m.o.i) de alrededor de 1 (o sea, cada bacteria recibe, por término medio una sola partícula de fago).
  • Una partícula l gal+ inyectaría de forma normal su ADN en la bacteria gal--. El ADN lineal del fago se circulariza como de costumbre. Pero obsérvese que este ADN no posee un sitio attnormal, sino que presenta solamente el sitio BOP' (derivado de la escisión anómala producida en el ciclo anterior), y además, al ser defectivo, cabe la posibilidad de que haya perdido el genint que codifica la integrasa. En este caso, la única posibilidad de integración del ADN es mediante recombinación homóloga simple (un solo crossing-over) propiciada por el sistema RecA de la bacteria receptora.
  • El resultado de esta recombinación homóloga es la creación de un heterogenote gal+/gal-- con un profago l defectivo, que debido a ese carácter defectivo no es inducible (no provoca lisogenia). Observar que cada copia del gen gal es en realidad un "mosaico", con una porción derivada del exogenote y otra del endogenote. Este heterogenote con fenotipo Gal+ es estable.
2ª fase en el caso de infectar la cepa receptora con el lisado LTF a una alta multiplicidad de infección: Imagimenos ahora que mezclamos una media de 10 partículas de fago del lisado obtenido en la primera fase con 1 célula de la bacteria receptora (o sea, una m.o.i.=10).
  • Algunas bacterias reciben el ADN del fago defectivo (l dgal+) junto con el ADN del fago silvestre.
  • El ADN del fago silvestre se integraría de la forma habitual, mediante su sistema de recombinación específica de sitio (POP' X BOB'). Este ADN del fago silvestre actúa como auxiliador respecto del defectivo: le suministra sitios para la recombinación y la función de la integrasa. Por lo tanto, a continuación se produce otro evento de recombinación específica entre ambos ADN de l .
  • El resultado es un heterogenote gal+/gal-- que es doble lisogénico (l +/l d). Su fenotipo sería Gal+ y l +, capaz de producir, por inducción partículas de fago silvestres y defectivas.
  • Supongamos que inducimos ahora este clon doble lisógeno: se producen dos bucles en cada célula, uno que regenera el genomio circular del l silvestre, y otro que origina el de l dgal+. Observar, pues, que el resultado de esta inducción es un lisado donde existe un 50% de l + y un 50% de fagos portadores del gen gal+. Si este lisado lo usamos para infectar de nuevo una cepa gal--, la proporción de transductantes Gal+ será muy alta. Por esta razón, al lisado obtenido por inducción del doble lisógeno l +/l d se le denomina lisado HTF (alta frecuencia de transducción).
La transducción especializada con el fago l permitió los primeros aislamientos ("clonaciones") de genes in vivo, pero por supuesto, desde mediados de los años 70 la clonación de genes se realiza ya con métodos de ADN recombinante (ingeniería genética).






CONJUGACION BACTERIANA

CONCEPTO Y APROXIMACIÓN HISTÓRICA

La conjugación bacteriana es el proceso de transferencia de información genética desde una célula donadora a otra receptora, promovido por determinados tipos de plásmidos, y que requiere contactos directos entre ambas, con intervención de estructuras superficiales especializadas y de funciones específicas.
El descubrimiento de la transformación había revelado ya la existencia de recombinación genética entre porciones de genomios bacterianos. En mitad de los años 40, la pregunta que se planteaba era: ¿existe algún tipo de recombinación bacteriana que suceda al estilo de la reproducción sexual de los eucariotas?
Se descubrió que ciertas bacterias presentan una forma de recombinación que recordaba en algunos rasgos a la sexualidad: un tipo de célula donadora ("macho") donaba directamente parte de su material genético a otro tipo (la receptora, equivalente a la "hembra"), con ulterior recombinación entre ambos. A este fenómeno se le denominó conjugación, por su similitud aparente con lo que sucede en eucariotas. Sin embargo, como veremos enseguida, la conjugación no es una forma auténtica de sexualidad al estilo de los eucariotas.
Con la perspectiva de los años, se puede decir que el descubrimiento de la conjugación bacteriana fue uno de los más fortuitos, pero al mismo tiempo, de los más felices y trascendentales de toda la Biología del siglo XX. Muchos biólogos habían intentado infructuosamente demostrar conjugación de tipo "sexual" en bacterias. Lederberg y Tatum (1946), que a la sazón investigaban en la Universidad de Yale, tuvieron la enorme suerte de "escoger" (sin saberlo a priori) una de las pocas especies bacterianas (Escherichia coli) que presentan sistemas naturales de conjugación, y aún más, la cepa concreta denominada K12, que llevan uno de estos sistemas... Pero todavía mejor: como se descubriría muchos años después, el sistema conjugativo de dicha cepa es casi único por su capacidad de conjugación permanente, no estando sometido a los controles negativos típicos de la inmensa mayoría de los demás sistemas que luego se descubrieron. En resumen, un extraordinario "golpe de suerte" en el año 1946 dio el "pistoletazo de salida" para una de las épocas más gloriosas de la Biología, contribuyendo de modo excepcional al origen de la Biología Molecular.
A continuación expondremos los hitos más importantes en el estudio de la conjugación enEscherichia coli K12 (consulten los esquemas)

1.1 EXPERIMENTOS DE LEDERBERG Y TATUM

Joshua Lederberg y Edward Tatum (1946) mezclaron dos cepas doblemente auxotrofas, dotadas de distintos marcadores genéticos:

Cepa "A" (Met--, Bio--, Thr+, Leu+)
cepa "B" (Met+, Bio+, Thr--, Leu--)
Sembrar 2·108 céls de "A"
Sembar 108 céls de "A" + 108 céls de "B"
Sembrar 2·108 céls de "B"
plaquear en medio mínimo e incubar varios días
No crecimiento
Colonias prototrofas a una frecuencia de 10-5 - 10-6, muy superior a la frecuencia esperada de doble reversión (10-14).
No crecimiento
Estos prototrofos debían haber surgido por recombinación.

¿Qué proceso de transferencia genética había dado origen a los recombinantes? Se descartó que fuera por transformación:
  • No había recombinantes si se usaban extractos libres de una cepa y se mezclaban con células enteras de la otra cepa.
  • Si en el experimento original se añadía DNasa, no cambiaban los resultados.
  • Se vio que se necesitaban contactos directos entre las células de las dos cepas, mediante el experimento del tubo en "U" de Davis: si en cada rama de la U se coloca una cepa distinta, y ambas están separadas físicamente (en la base de la U) por un filtro con poros de tamaño inferior al del diámetro de las bacterias, no aparecían recombinantes.
En ulteriores experimentos se comprobó que existían dos tipos de cepas de cara a la producción de recombinantes:
  • cepas fértiles (F+): aquellas que al mezclarlas con otras, daban lugar a recombinantes;
  • cepas infértiles (F--).
Los cruces de tipo F+ x F-- dan origen a recombinantes;
Los cruces de tipo F--x F-- no dan origen a recombinantes.
Por otro lado, se observaron dos importantes propiedades de los cruces F+ x F--:
  • casi la totalidad de las células infértiles (F--), al final de la conjugación, adquirían la capacidad de fertilidad (se convertían en células F+);
  • sin embargo, los recombinantes aparecían con mucha menor frecuencia (alrededor de 10-5).
El origen de ambos fenómenos estriba en la posesión, por parte de las células F+, del llamado "factor sexual o factor de fertilidad F", (que hoy sabemos que es un plásmido, pero tal extremo se desconocía aún en esa época). Por lo tanto, de alguna manera el factor F debía de tener la doble capacidad de transferirse con alta frecuencia (casi el 100%) a las células F--, y de dar origen en ellas a recombinantes, pero con mucha menor frecuencia (10--5). ¿Cómo explicar esta doble capacidad del factor F, con dos frecuencias tan diferentes? Las bases para la respuesta a esta pregunta fueron colocadas en el siguiente gran capítulo de esta historia:

1.2 AISLAMIENTO DE LAS CEPAS Hfr POR LEDERBERG Y HAYES

En los años de 1950 Joshua Lederberg y William Hayes, cada uno por separado, aislaron un nuevo tipo de cepas fértiles a partir de las cepas F+ originales, cuyas propiedades distintivas respecto de las cepas F+ eran:
  1. Provocaban fertilidad (o sea, daban recombinantes al cruzarlas con F--) con una frecuencia muy alta (unas 1000 veces superior a la de las cepas F+). Por ello, el nombre que se dio a este nuevo tipo de cepas fértiles fue el de Hfr (iniciales, en inglés, de alta frecuencia de recombinación).
  2. A diferencia de las F+, las cepas Hfr no suelen convertir en fértiles a las cepas F-- tras el cruce conjugativo con ellas.
Entonces, la pregunta obvia era: ¿qué relación existe entre las células Hfr y las células F+ de las que parecen derivar?

1.3 El MODELO DE CAMPBELL

Alan Cambell propuso en 1962 un modelo hipotético que posteriormente se vio confirmado por otros experimentos, y que daba cuenta del comportamiento de las cepas F+ de Lederberg y de las Hfr de Lederberg y Hayes:
  • En las células F+ el factor de fertilidad F se encuentra en forma de plásmido de replicación autónoma, independiente del cromosoma. En este estado, el factor F sólo puede provocar su propia transferencia conjugativa a las células F--, de modo que éstas adquieren a su vez dicho factor F.
  • En una población de células F+, de vez en cuando (con una frecuencia de 10-5), el factor F interacciona con el cromosoma: se integra en él, y entonces se replica conjuntamenente con el genóforo de la bacteria (actuando, pues, como episoma). En esta situación, el factor F puede "arrastrar" al cromosoma y transferir parte de él a la célula receptora F--. Sin embargo, en esta situación el factor F no se transfiere completo a la célula receptora, razón por la cual los cruces Hfr x F-- no suelen conferir el carácter F+ a los exconjugantes del receptor.
  • En resumen: cada cepa Hfr es clon procedente de un evento de integración del factor F en un sitio del cromosoma de E. coli. En estos clones todas las células tienen la capacidad de transferir porciones de cromosoma y por ello confieren alta frecuencia de recombinación. Así pues, en un cultivo F+ normal, existe una pequeña proporción de células Hfr. Esa minoría de células Hfr son las responsables de la baja frecuencia de recombinantes que provocan los cultivos F+.
El análisis del proceso de conjugación y de la transferencia de marcadores cromosómicos se vio grandemente impulsado una vez disponibles las cepas Hfr puras. Se fueron obteniendo diversas cepas Hfr, cada una de las cuales se caracterizaba por una mayor eficiencia de transferencia de determinados marcadores. El siguiente gran avance en el estudio de la conjugación se produjo trabajando sobre una de estas cepas, la denominada HfrH (la "H", en honor de Hayes):

1.4 EXPERIMENTOS DE LOS CRUCES INTERRUMPIDOS DE JACOB Y WOLLMAN

Estos autores, que trabajaban en el Instituto Pasteur de París, realizaron a partir de 1956 una importantísima serie de experiencias, que demostraron que la transferencia conjugativa tiene una polaridad (un sentido determinado): la transferencia de ADN por cada cepa Hfr es unidireccional y linear, o sea, los genes del donador van entrando al receptor en un orden determinado.
  • Imaginemos una cepa Hfr con un juego de marcadores (A+, B+, C+, D+, F--, G--), y una cepa F-- con el juego opuesto (A--, B--, C--, D--, F+, G+). Mezclamos ambas cepas, y a distintos tiempos extraemos alícuotas, y las agitamos fuertemente, con objeto de deshacer las parejas que se estaban conjugando (de ahí el nombre de "cruces interrumpidos" que recibe el experimento).
  • Cada una de estas alícuotas es sembrada en un medio mínimo suplementado con los requerimientos correspondientes a los marcadores A, B, C y D. (Obviamente, en este medio, sólo puede crecer la cepa receptora). Tras incubar las placas, se obtienen colonias derivadas de la cepa receptora, procedentes de las mezclas de conjugación.
  • Ahora realizamos réplicas en placa (p. ej., por el método del tampón de terciopelo), "copiando" los transconjugantes en sendas placas de medio mínimo suplementadas con mezclas de 3 de los 4 requerimientos que originalmente le hacían falta a la cepa receptora. Mediante esta forma, lo que pretendemos es ver la posible adquisición de las versiones silvestres de los marcadores (mutantes) de esa cepa, versiones que obviamente habrá debido de adquirir tras transferencia conjugativa de partes de cromosoma procedentes de la cepa donadora.
  • Se anota la frecuencia de aparición de cada alelo silvestre, y los resultados se representan en función de los tiempos a los que se extrajeron e interrumpieron las muestras del cruce conjugativo (ver gráfica).
De la representación gráfica de porcentaje de recombinantes (eje de ordenadas) en función del tiempo de conjugación (abscisas) se deduce lo siguiente:
  1. Cuanto más tiempo se deja la conjugación sin interrumpir, más material genético se transfiere.
  2. Los genes van entrando ordenada y secuencialmente. La frecuencia relativa obtenida para cada marcador (es decir, el nº final de recombinantes) está en relación (inversa) con el tiempo en que éste comienza a aparecer (a menor tiempo de aparición, mayor frecuencia final de ese marcador). Cada marcador tiene un tiempo de entrada inicial característico (que en la gráfica se manifiesta por el punto del eje de abscisas cortado por la curva).
  3. Cada marcador da una curva con una pendiente característica. El hecho de que exista pendiente (y no que exista una recta en vertical desde el momento de aparición del marcador) implica que cada marcador no entra a la población de bacterias receptoras "de un tirón", sino que algunas células lo reciben antes y otras después, dentro de un cierto rango de tiempos. La existencia de una meseta final significa que a partir de un punto ya no entra más marcador (es decir, ya se ha producido toda la transferencia de ese marcador).
Resumiendo las consecuencias de este experimento: En la conjugación Hfr x F-- el cromosoma entra en la célula receptora con una orientación determinada, de modo que los genes entran ordenada y secuencialmente. El tiempo en que comienza a detectarse un determinado marcador, así como lafrecuencia final de dicho marcador en los transconjugantes dan una estimación de su distanciarespecto del origen de transferencia. La correlación entre tiempo de aparición y frecuencia final del marcador sugiere que las parejas de cruce donador-receptor se separan espontáneamente en algún momento de la conjugación; de no existir tal separación espontánea, se terminarían obteniendo frecuencias del 100% para cada marcador individual, incluidos los más alejados del origen de transferencia.
  • Precisamente esto último es la base por la que se aprovecha el sistema de conjugación para la elaboración de mapas genéticos del cromosoma bacteriano. Como este aspecto es tratado oportunamente en la asignatura de Genética, nosotros no vamos a insistir más en él, aparte de recordar que fue precisamente utilizando distintas cepas Hfr como se comprobó genéticamente que el cromosoma de E. coli es, en efecto, circular.
  • La unidad de medida en el mapa genético de la bacteria es el minuto. El cromosoma de E. colitiene unos 100 minutos; si tenemos en cuenta que el cromosoma mide 4.200.000 pares de bases (pb), esto significa que la transferencia cromosómica promovida por F se da a razón de 4.200 pb/min, es decir, unas 700 pb/ seg.
  • Existen 22 tipos distintos de cepas Hfr. Cada una se caracteriza por poseer el factor F en un punto concreto del cromosoma de E. coli, y de transferir ese cromosoma con un sentido determinado. Existen pares de cepas Hfr cuyo factor F está integrado en la misma localización del genóforo, pero que transfieren cromosoma en sentidos opuestos: los marcadores que una de ellas transfiere en primer lugar son los últimos que transfiere la otra cepa Hfr.

2. INDUCCIÓN ZIGÓTICA

    Imaginen un cruce entre una cepa Hfr (l +) -o sea, una Hfr lisogénica para el fago Lambda- y una cepa F-- no lisogénica. En este tipo de cruces se observa que sólo se transfieren los marcadores genéticos situados antes del profago l (este "antes" está en referencia, obviamente, al sentido concreto de transferencia que tenga la cepa Hfr en cuestión). No se detecta nunca transferencia de los marcadores colocados después del sitio del profago.
    La explicación es muy sencilla: como estudiaremos oportunamente en la sección de Virología, el profago integrado sólo expresa un gen, el cual produce una proteína que mantiene reprimidos los genes de las funciones líticas. En la cepa lisogénica Hfr (l +) existe una concentración de represor de l suficiente para mantener esa represión en la célula donadora. Ahora bien, en un cruce con una cepa F-- no lisogénica, cuando entre la porción de cromosoma donador que porta el profago, este profago se encuentra en un entorno celular que no tiene represor de sus funciones vegetativas; por lo tanto, se produce una inducción y entrada a ciclo lítico, con muerte de la célula receptora. A este fenómeno se le conoce con el apropiado nombre de inducción zigótica.

    3. ESTUDIO DE LA CONJUGACION PROMOVIDA POR EL PLASMIDO F DE E. COLI

    3.1  DESCRIPCIÓN DEL PLÁSMIDO F Y DE SUS FUNCIONES BÁSICAS

    El factor responsable de la fertilidad de E. coli K12, o sea, el plásmido F, es un ejemplo de plásmido conjugativo que tiene la capacidad de interaccionar con el cromosoma bacteriano para integrarse en él (episoma). El factor F puede encontrarse en uno de tres posibles estados:
    • autónomo, en las células F+;
    • integrado (como episoma), en las células Hfr;
    • autónomo, pero con un trozo de cromosoma, en las cepas F' (ver el apartado sobre sexducción).
    En estos tres estados realiza el mismo tipo de funciones esenciales.
    Estructura física:
    • ADN circular de cadena doble, cerrado covalentemente (C.C.C.);
    • superenrollado negativamente (requiere la acción de la girasa);
    • tamaño: 100 kilobases. El mapa físico de F posee coordenadas en kb de 0 a 100 (obviamente el 0 y el 100 son el mismo punto), tomando como punto arbitrario de referencia (0/100) el borde izquierdo de la secuencia de inserción IS3a.
    Organización genética y funcional: Se han identificado unos 60 genes en el plásmido F. Vamos a echar una ojeada al mapa de F para describir los principales grupos de genes según las funciones que realizan:
    1. Porción tra (genes que codifican funciones relacionadas con la transferencia conjugativa). Existen unos 25 genes tra, repartidos en unas 33 kb (o sea, casi la tercera parte de F está dedicado a genes de conjugación). La mayor parte de esos genes están formando parte de un gran operón traY……Z (unos 20 genes). Los genes tra se pueden clasificar en:
      1. Necesarios para la biosíntesis y ensamblaje de los pelos sexuales. Entre ellos está el gen traA, que codifica la pre-propilina, es decir, el precursor que por maduración se convertirá en la pilina F, la proteína constitutiva de los pelos sexuales de tipo F. Otros genes tra intervienen en la maduración de la pilina, y en el ensamblaje de las subunidades para dar el pelo F.
      2. Estabilización de los agregados de conjugación: traG, traN.
      3. Metabolismo del ADN durante la conjugación: traI, traD, traM, traY, traZ.
      4. Regulación genética de la transferencia: traJ determina un activador transcripcional del gran operón traY…Z; finP, finO formarían un sistema de control negativo sobre el gran operón traY...Z, pero como veremos, este sistema no es funcional en el plásmido F debido a que el finO tiene una inactivación insercional permanente por la secuencia de inserción IS3.
      5. Exclusión de superficie: traS, traT.
    2. Regiones para la replicación vegetativa del plásmido F: la zona RepFIA es la más importante, y posee genes relacionados con la replicación vegetativa, con la incompatibilidad de F respecto de otros plásmidos (Inc) de tipo similar, y con el reparto de las copias replicadas de F a las células hijas.
    3. Existen varias secuencias de inserción: dos copias de IS3, una copia de IS2 y una copia de Tn1000 (antes llamado g d , y que pertenece a la misma familia que los transpones Tn1, Tn3, etc). Precisamente son estas secuencias de inserción las que permiten la integración de F en varios lugares del cromosoma, por medio de recombinación homóloga con elementos similares del genóforo bacteriano. Aludiremos a esto de nuevo, cuando tratemos el origen de las cepas Hfr y de las cepas F'.
    4. Observen que existen dos secuencias ori (es decir, orígenes de replicación). Una de ellas, la oriV actúa como origen de replicación vegetativa, y la otra (oriT, de unas 300 pb) es el origen para la transferencia conjugativa, que como veremos enseguida, implica un tipo especial de replicación.

3.2 FISIOLOGÍA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CONJUGACIÓN

Podemos distinguir en la conjugación dos grandes fases:
  • contactos entre células F+ (o, en su caso, Hfr) y F--;
  • transferencia del ADN.

3.2.1 CONTACTOS ENTRE CÉLULAS F+ Y F--

Las células F+ (o las Hfr) forman de 1 a 10 pelos sexuales (repasar aquí lo que se dijo oportunamente en el cap. 11 sobre este tipo de pelos, que son distintos de las fimbrias de tipo adhesivo). El pelo interacciona específicamente, a través de su punta, con un receptor de la célula F--(concretamente, parece ser que se trata de la proteína OmpA, de la membrana externa).
En los cruces se ha visto que más que parejas de cruce existen agregados de cruce, donde varias células de ambos tipos (hasta unas 20) se encuentran relacionadas por contactos directos. Las cosas ocurren de la siguiente manera:
Una célula F+ contacta por medio de la punta de su pelo F con el receptor de superficie de una F-- El pelo F se va despolimerizando desde su base, lo cual provoca la apariencia de que se va retrayendo. En ese movimiento de retracción, la célula F-- se va acercando a la F+. Cuando el pelo se termina de desintegrar, las células se ponen en contacto directo pared-pared. Se forma un puente conjugativo que pone en contacto los citoplasmas de ambas células Las parejas o agregados de cruce se estabilizan por la acción de los genes traN y traG del plásmido F, y de ompA de la célula F--. La proteína producida por traD (localizada en ambas membranas, citoplásmica y externa) parece que facilita el transporte del ADN a la célula receptora. Tras cierto tiempo de conjugación, el agregado se desagrega de forma activa.
Aquí hablaremos de un fenómeno interesante, que tiene que ver con las interacciones entre superficies celulares: se trata de la exclusión superficial, y consiste en un sistema por el que se evita que las células de tipo F+ puedan actuar como receptoras frente a otras F+. Se sabe que la acción de dos genes del plásmido F realizan esta función:
  • traT: su producto se sitúa en la membrana externa, impidiendo la formación de contactos con pelos sexuales de otra célula F+.
  • traS: su producto, situado en la membrana citoplásmica, evita la entrada de ADN desde otra célula F+.
Otro fenómeno que se puede observar en los cruces F+ x F-- es la zigosis letal. Ocurre cuando la proporción de células F+ es muy superior a la de F-- (p. ej., de 10:1). En este caso, las células receptoras pueden morir, debido a que están siendo modificadas en muchos puntos de su superficie por numerosos contactos con células F+.

3.2.2  TRANSFERENCIA Y PROCESAMIENTO DEL ADN CONJUGATIVO

La transferencia de ADN desde una célula F+ a una F-- es un proceso especial de replicación asimétrica por círculo rodante.
  • Una de las dos cadenas parentales del plásmido F pasa a la célula receptora, replicándose en ella;
  • La otra cadena parental se queda en el donador, sirviendo a su vez como molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. Esto explica porqué las células F+ siguen siendo F+ tras la conjugación.
Por lo tanto, la transferencia de ADN no implica que la doble hélice de F desaparezca del donador para aparecer en el receptor, sino que al final, ambos miembros de la pareja poseen un plásmido F completo.
Resumiendo el modelo que explicaremos luego, la transferencia conjugativa del plásmido F ocurre de la siguiente manera:
  • En la célula F+, una endonucleasa específica codificada por uno de los genes tra reconoce y corta en una de las cadenas de la secuencia oriT del plásmido.
  • La cadena así cortada se ve desplazada por una helicasa codifica por otro gen tra del plámido.
  • Los productos de otros genes tra transfieren la cadena cortada al receptor. Al parecer, los extremos de esa cadena permanecen "anclados" a otra proteína Tra (es decir, durante el proceso nunca quedan extremos libres como tales).
  • Cuando la cadena rota ha terminado de entrar al receptor, la proteína Tra que mantenía los extremos 3’ y 5’, vuelve a unirlos (se rehace el enlace fosfodiéster).
  • Durante el proceso de transferencia de la cadena rota en el receptor, se están dando dos procesos de síntesis de ADN: por una lado, la cadena intacta de F del donador sirve como molde para sintetizar la correspondiente cadena complementaria (que es idéntica, claro está, a la cadena desplazada hacia el receptor); y al mismo tiempo, en el receptor, la cadena transferida, conforme va entrando, va sirviendo para sintetizar la cadena complementaria. De este modo, al final, el donador sigue siendo F+, y el receptor se ha convertido en F+.
Veamos el modelo actualizado que incorpora lo que se conoce de este proceso (aunque por supuesto, aún quedan puntos hipotéticos por aclarar):
  1. Corte específico de una de las cadenas de F a nivel de la secuencia oriT. El corte lo realiza el complejo {TraY+TraZ}, que se localiza anclado en el poro o canal de conjugación. Así pues, este complejo actúa en este momento como una endonucleasa específica que corta en una sola de las cadenas de F, dentro de la secuencia oriT.
  2. El producto del gen traM suministra la señal, por un mecanismo desconocido, paradesencadenar la transferencia.
  3. El extremo 5' generado en el corte a oriT entra a la célula receptora, pero dicho extremo permanece unido al complejo {TraY+TraZ}. La transferencia progresa en el sentido 5' à 3'. El complejo {TraY+TraZ} actúa ahora como una helicasa de tipo I, de modo que va desenrollando la doble hélice del F, separando las dos hebras, e hidrolizando ATP simultáneamente (o sea, la helicasa de F es una ATPasa dependiente de ADN). De esta forma se va desenrollando la doble hélice a razón de unas 1200 pb/ seg.
  4. Síntesis conjugativa del ADN: Se producen dos procesos simultáneos de síntesis de ADN, uno en cada célula:
    1. Síntesis de la cadena de reemplazo del donador (SCRD): esta síntesis opera de modocontinuo (sería equivalente a la síntesis de la cadena adelantada de la replicación normal). Esta síntesis se inicia a partir de un ARN cebador ("primer" en inglés) sintetizado por un primosoma que reconoce una secuencia (n') situada cerca de oriT.
    2. Síntesis de la cadena complementaria en el receptor (SCCR): a diferencia de la anterior, es discontinua, a base de fragmentos de Okazaki (por lo tanto, sería la equivalente de la síntesis de la cadena retrasada).
    En ambos casos parece ser que el primosoma responsable de los ARN cebadores no es exactamente idéntico al que se emplea en la replicación "normal", sino que está modificado por alguna función específica codificada por el plásmido F (una primasa específica del factor F).
  5. Circularización del ADN transferido y replicado, y adquisición de configuración final:No se sabe exactamente cómo ocurre la circularización (o sea, cómo se vuelven a ligar los extremos generados por la rotura descrita en el apartado 1º). Parece ser que el complejo {TraY+TraZ} "guarda" la energía del enlace fosfodiéster que él corta (conservándola al unirse con el ADN cortado), y luego la vuelve a emplear para "sellar" el corte una vez que las cadenas han sido replicadas-y-transferidas (o sea, el complejo actuaría al final como una "ADN-ligasa"). Posteriormente, sobre esta molécula circular cerrada covalentemente (C.C.C.) y aún "relajada", actúa la ADN-girasa, introduciendo superenrollamiento negativo. En esta configuración, el plásmido F queda intacto y funcional en el transconjugante.
  6. En el caso de cruces Hfr x F--, al menos una parte del fragmento cromosómico "arrastrado" desde el donador al receptor se recombina, con un doble sobrecruzamiento (por el sistema de RecA) con la porción homóloga del endogenote, lo que lleva a sustitución de unas secuencias por las otras.

3.3 REGULACION GENÉTICA DE LA CONJUGACION

La mayor parte de los plásmidos conjugativos (pero curiosamente no el F) tienen un control negativo de su transferencia, de modo que sólo se transfieren a alta frecuencia durante unas pocas generaciones, al cabo de las cuales se establece una baja frecuencia de conjugación(). El resto del tiempo, los genes tra están reprimidos.
Vamos a referirnos a un plásmido que sí tiene control negativo: el R1, perteneciente a otro grupo de incompatibilidad (IncFII) distinto del F, pero que por lo demás tiene funciones similares:
La regulación negativa se produce por la acción de los genes finO y finP, e implica un mecanismo basado en ARN regulatorio antiparalelo (antisentido).
  • finO está situado distalmente respecto del gran operón traY……Z.
  • finP está situado en la zona proximal, superpuesto de hecho con el gen traJ, transcribiéndose en sentido opuesto, a partir de la cadena opuesta a la que se usa para la transcripción de traJ.
  • El ARN producido por transcripción de finP es antiparalelo respecto de una parte del ARNm del gen traJ. El producto de traJ es un activador de la transcripción del gran operón traY.....Z. Ahora bien, el ARN antiparalelo de finP tiende a emparejarse con la porción 5' del ARNm detraJ, ocultando la secuencia de Shine-Dalgarno. La conjunción de la expresión de finP y definO (que produce una proteína represora) tienden a dificultar la expresión (a nivel traduccional y transcripcional) del gran operón tra.
La superposición de un sistema de regulación positiva (por traJ) con otro de regulación negativa (porfinO + finP) es la responsable de una importante característica de muchos plásmidos conjugativos:su dispersión esporádica de tipo epidémico entre poblaciones bacterianas:
  • Supongamos que partimos de una población donde originalmente casi todas las células son de tipo infértil (F-- o R--), y donde existe una minoría de células poseedoras de un plásmido conjugativo con el tipo de regulación que acabamos de describir. Cuando alguna de las células infértiles reciban por conjugación una copia del plásmido, tiene que pasar un tiempo (contado en generaciones de divisiones celulares) hasta que se vayan acumulando los productos de los genes finO y finP hasta que alcancen una concentración suficiente como para inhibir la conjugación. Por lo tanto, durante unas pocas generaciones el plásmido tiene una gran tendencia a transferirse a células F--. Se dice que durante ese tiempo ocurre una alta frecuencia de transferencia (HFT). De este modo, bastan esas pocas generaciones para que el plásmido se disemine de forma epidémica a casi toda la población.
  • Al cabo de ese tiempo, la acumulación del ARN de finP y de la proteína de finO llega a un nivel que ya es capaz de inhibir la conjugación eficazmente. El cultivo pasa, pues, a la modalidad de baja frecuencia de transferencia conjugativa (LFT). Sin embargo, para cuando se haya establecido este control, prácticamente todas las células se habrán convertido ya en F+. Estamos, pues, ante un sistema de conjugación que permite "prever" su propia desconexión (con el consiguiente ahorro), una vez que se ha logrado el "objetivo" de haberse diseminado a la población.
Significado adaptativo de este sistema de control: Como acabamos de exponer, este sistema asegura la rápida dispersión epidémica de los plásmidos, de modo que la represión de la transferencia se produce coincidiendo con la situación en la que de hecho el plásmido conjugativo ha "invadido" toda o casi toda la población, ahorrándose la energía y materiales que tendría que dedicar a fabricar pelos sexuales y demás funciones conjgativas en unas circunstancias en las que serían superfluos.
Pero además, como se recordará, los pelos sexuales son la zona de reconocimiento de una diversidad de fagos (p. ej., para los pelos F existen diversos fagos icosaédricos de genomio ARN que se adsorben a los laterales del pelo, y fagos filamentosos de ADN que comienzan su infección uniéndose a la punta del pelo sexual). Cabe imaginar que la represión de las funciones tra (entre ellas, claro está, la fabricación del pelo) son una ventaja para la bacteria, al evitar que durante la mayor parte del tiempo puedan iniciar la infección dichos fagos específicos.

4.  INTERACCIONES DEL PLÁSMIDO F CON EL CROMOSOMA

4.1  FORMACIÓN Y CARACTERÍSTICAS DE LAS CEPAS Hfr

Como ya dijimos, el plásmido F puede pasar desde su estado autónomo a un estado integrado en el cromosoma bacteriano (episoma), lo que es el origen de la creación de las cepas Hfr. Veamos ahora la base genético-molecular de este proceso:
Se da una recombinación entre secuencias homólogas presentes simultáneamente en el plásmido F y en el cromosoma, que son secuencias de inserción. Concretamente, en F existen 2 copias de IS3, 1 copia de IS2 y una copia de Tn1000 (que hasta hace poco se denominaba g d ), y en el cromosoma hay varias copias de IS. Esta recombinación se da principalmente debido a la actuación del sistema de recombinación homóloga (dependiente de RecA), de modo que las IS funcionan aquí como regiones portátiles de homología implicadas en eventos de recombinación homóloga con un sobrecruzamiento ("crossing-over") sencillo. Sin embargo, en las cepas mutantes recA--, la recombinación puede tener lugar por el sistema de recombinación ilegítima propio de los elementos transponibles (el mecanismo sería el de la fusión de replicones, al que aludimos cuando estudiamos la transposición). En cualquiera de los dos casos, el plásmido integrado, es decir, el episoma, aparece "emparedado" entre dos copias de la IS implicada en la recombinación.
Cada recombinación origina una Hfr distinta, dependiendo de las secuencias IS implicadas, de su localización dentro del cromosoma de E. coli, y de la orientación. Ya dijimos que se han identificado unas 22 cepas Hfr distintas, y que existen ejemplos de parejas de Hfr que transfieren cromosoma a partir del mismo punto cromosómico, pero en orientaciones opuestas.
Recordemos de nuevo que las Hfr codifican todas las funciones del plásmido F. Al promover la transferencia conjugativa, "arrastran" al cromosoma desde el oriT. Para que se transfiriera todo el cromosoma, la pareja de cruce debería permanecer unida 100 minutos, y en ese caso, lo último que se transfiere es la porción del plásmido F que queda al otro lado de oriT (y que es la que lleva la región tra). Pero como dijimos, ello ocurre raramente (porque antes las parejas de cruce se deshacen espontáneamente), y por lo tanto, esta es la razón de que en los cruces HfrXF-- los transconjugantes siguen siendo F--.
Así pues, en la mayer parte de los cruces HfrFXF--, lo que se transfiere (el exogenote) es un fragmento más o menos largo de ADN cd lineal del donador, encabezado por una parte del plásmido F y seguido por un trecho de cromosoma. Este fragmento no tiene capacidad de replicación autónoma, y su destino será perderse a no ser que se recombine con alguna porción homóloga del endogente. Si ocurre esa recombinación, y suponiendo (como ocurre en los experimentos) que donador y receptor tienen marcadores distintos, nosotros detectamos eso precisamente por la alta frecuencia de recombinantes entre la población de transconjugantes receptores. No hace falta insistir (ya lo vimos en los experimentos de Jacob y Wollman) que para cada cepa Hfr existe un "gradiente" de marcadores transferidos, según su frecuencia final en los transconjugantes, que a su vez se correlaciona con el tiempo de entrada al receptor (siendo esto la base de la elaboración de mapas genéticos por conjugación).

4.2 REVERSIÓN DE LAS CEPAS Hfr, ORIGEN DE LAS F', Y SEXDUCCIÓN

La cepa Hfr puede revertir a F+, por una escisión precisa (exacta), que implica los extremos del factor integrado (las secuencias IS que lo "emparedan"). Cada cepa Hfr concreta presenta una frecuencia característica de reversión a F+. Algunas cepas son muy inestables, de modo que revierten frecuentemente, lo que obliga a purificarlas continuamente en el laboratorio para evitar que al final se obtenga una población F+. En cambio, otras cepas son muy estables. La cepa HfrC es la más estable, de modo que raramente revierte por escisión.
Pero también pueden ocurrir escisiones imprecisas (en las que están implicadas secuencias repetida diferentes a las IS que flanquean al episoma), de modo que el factor F adquiere trozos de genomio bacteriano adyacentes al lugar donde estaba integrado. Estos plásmidos F autónomos que adquieren e incorporan permanentemente un trozo de genomio bacteriano, se denominan F' (F-primas). Dependiendo de qué se lleva en su escisión anómala se pueden distinguir:
  1. Escisiones que dejan parte de F en el genóforo pero que adquieren genes a uno u otro lado del sitio original de inserción: generan las F' de tipo I, que a su vez pueden ser:
    1. F’ de tipo Ia: adquiere genes del lado proximal (o sea, aquellos que la cepa Hfr original transfería en primer lugar);
    2. F' de tipo Ib: adquiere genes del lado distal (los que se transferían tardíamente por la cepa Hfr original).
  2. Escisiones que no dejan ninguna porción de F en el genomio bacteriano, pero que incorporan genes a ambos lados del sitio de inserción original: generan F' de tipo II.
A las cepas donde se genera originalmente cada F' concreto se las llama con el nombre de cepas F' primarias. Cada plásmido F' porta un segmento concreto y discreto de cromosoma, que dependiendo de la cepa puede tener una longitud de hasta el 25% del cromosoma bacteriano. Observen que una cepa F’ primaria tiene una delección en su cromosoma, pero esa delección no es letal, porque el trozo de ADN escindido sigue en la célula, aunque formando parte ahora del F prima.
Si realizamos un cruce F' x F--, la célula receptora adquiere ese plásmido F', y por lo tanto, los genes bacterianos portados por dicho F'. Esta es la base del siguiente concepto:

4.3 SEXDUCCIÓN

La sexducción consiste en el transporte de material genético desde una célula a otra por medio de plásmidos F'. Sus caracteres distintivos respecto de los cruces F+ x F-- y de los Hfr x F-- son:
  • A diferencia de los cruces F+ x F--, el plásmido F' transfiere regiones cromosómicas discretas a altas frecuencias (cercanas al 100%);
  • Pero a diferencia de los cruces Hfr x F--, el receptor se convierte en fértil.
Las cepas generadas por transferencia a ellas de un F' desde una cepa F' original se denominan F' secundarias. Tras la sexducción, si la cepa receptora es recA+, se produce una recombinación entre segmentos cromosómicos (procedentes de la célula donadora) portados por el F' y marcadores cromosómicos homólogos de esa cepa receptora. Se origina una cepa parecida a las Hfr (pero que no se ha producido por recombinaciones a través de las IS), que es merodiploide (diploide parcial) por recombinación, y no un recombinante por sustitución.
Si se cura una cepa F' primaria de su plásmido F', obviamente quedará sin los genes cromosómicos que había "secuestrado" el factor F'. Si dichos genes eran esenciales para la viabilidad celular, el resultado es que la célula muere. Si no eran esenciales, se producirá la pérdida de funciones correspondientes, con la pertinente alteración del fenotipo.
El uso de factores F-primas fue muy útil durante muchos años para hacer análisis genéticos en bacterias (por ejemplo, muchos de los datos sobre el operón lac de Escherichia coli se obtuvieron con F-primas, lo cual permitía realizar pruebas de complementación cis-trans). Sin embargo, actualmente, al igual que otras técnicas in vivo desarrolladas durante la "edad de oro de la genética molecular" (años 50-60), han sido prácticamente desplazadas por los métodos de Ingeniería Genética.

5.  ALGUNAS IDEAS ADICIONALES SOBRE BIOLOGÍA DE LOS PLÁSMIDOS

Vamos a concluir el presente capítulo con una rápida visión de algunos aspectos importantes de la biología de los plásmidos, deteniéndonos en algunos sistemas plasmídicos distintos al tipo del factor F que acabamos de estudiar.

5.1 TIPOS DE PLÁSMIDOS

Existe una amplia variedad de plásmidos. Los plásmidos bacterianos son de muchos tipos distintos, pero a grandes rasgos podemos clasificarlos atendiendo a diversos caracteres:
  1. Según que sean autotransmisibles por conjugación o no:
    1. plásmidos conjugativos
    2. plásmidos no-conjugativos. Dentro de esta categoría se incluyen:
      1. plásmidos no movilizables
      2. plásmidos movilizables por otros que sí son conjugativos.
  2. Según su control de replicación vegetativa:
    1. Plásmidos de control estricto del número de copias: tienen bajo número de copias por cromosoma en la misma célula. Suelen ser plásmidos de tamaños medianos (unas 30 kb) a grandes (cientos de kb) P. ej., el factor F se mantiene a 1-2 copias por cromosoma.
    2. Plásmidos de control relajado: alto nº de copias por cromosoma (más de 10). Suelen ser plásmidos pequeños (menos de 10 kb). Algunos de ellos tienen un sistema de replicación especial, y son amplificables cuando a las bacterias que los poseen se les añade cloramfenicol: este antibiótico detiene la síntesis de proteínas, lo que afecta a la replicación del cromosoma, ya que para que se inicie cada ciclo de replicación cromosómica se necesita un nuevo "pool" de determinadas enzimas. Pero esto no afecta a la replicación del plásmido, que de este manera se "amplifica" y aumenta aún más su proporción respecto del cromosoma.
  3. Según el tipo de fenotipos que codifican (y dejando aparte a los plásmidos crípticos, de los que se desconoce su función fenotípica):
    1. Plásmidos R, que codifican una o más resistencias a drogas (antibióticos) y/o resistencia a metales pesados.
    2. Plásmidos bacteriocinogénicos, que codifican alguna bacteriocina y simultáneamente confieren inmunidad frente a esa bacteriocina a la bacteria que lo posee. Dentro de ellos, de los más estudiados son los plásmidos Col, que producen colicinas (bacteriocinas deE. coli).
    3. Plásmidos de virulencia, que codifican funciones relacionadas con la virulencia en muchas bacterias patógenas. Por ejemplo:
      1. plásmido de la toxina tetánica en Clostridium tetani.
      2. plásmido de la toxina del ántrax en Bacillus anthracis.
    4. Plásmidos que codifican factores de colonización (para la invasión de los tejidos de su hospedador).
    5. Plásmidos de cepas de Pseudomonas, que confieren rutas metabólicas capaces de utilizar como fuentes de carbono y energía sustancias que otros organismos no pueden catabolizar:
      1. plásmidos OCT (degradación del octano);
      2. plásmidos TOL/XYL (degradación del tolueno y xileno);
      3. plásmidos NAF (degradación del naftaleno), etc.
    6. Plásmidos de cepas de Rhizobium responsables de funciones relacionadas con el establecimiento de las simbiosis fijadoras de nitrógeno en los nódulos radicales de las leguminosas (pSym y otros tipos).
    7. Plásmidos Ti y Ri de Agrobacterium, responsables de la producción de tumores en numerosas plantas dicotiledóneas.
    8. Existen igualmente plásmidos que codifican más de un tipo de fenotipos: p. ej., plásmidos que suministran resistencia a antibióticos y capacidad de virulencia.
  4. Plásmidos según el grupo de incompatibilidad. Recordar la definición de incompatibilidad entre plásmidos que se dio oportunamente, y la base de este fenómeno: dos plásmidos son incompatibles (no pueden permanecer establemente en la misma célula) porque comparten un mismo sistema de replicación y segregación de las copias. Como se sabe, los plásmidos se pueden clasificar según su pertenencia a un mismo grupo de incompatibilidad.
    1. Así p. ej., el plásmido F pertenece al llamado grupo IncFI;
    2. Los plásmidos R1 y R100, de resistencia a antibióticos, pertenecen al grupo IncFII.
Obsérvese que dos plásmidos conjugativos pertenecientes a grupos de incompatibilidad diferentes pueden poseer regiones tra semejantes, y tipos de pelos sexuales parecidos. Esto es precisamente lo que ocurre con el F comparado con el R1 o el R100.

5.2 MÁS IDEAS ACERCA DE PLÁSMIDOS EN BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

En Gram negativas existe una muy amplia variedad de plásmidos. Podemos encontrar ejemplos de plásmidos conjugativos, aunque no todos basados en el sistema que hemos estudiado para el factor F. Muchos plásmidos conjugativos poseen pelos de tipo F (por ej., los ya citados R1 y R100), pero existen otros tipos de sistemas, con sus correspondientes clases de pelos sexuales. p. ej., el plásmido colicinogénico ColE1 posee pelos de tipo "I".
Existen muchos casos de plásmidos no conjugativos, pero algunos de ellos pueden ser transferidos a cepas receptoras cuando "conviven" en la célula donadora con otro plásmido conjugativo capaz de movilizarlos. Ello suele deberse a que estos plásmidos no autotransmisibles pero movilizablescarecen de la región tra, pero poseen una región denominada mob (del inglés "mobilizable"), que es reconocida por proteínas Tra de conjugación suministradas en trans por el plásmido movilizador, aunque la región mob del plásmido movilizable suministra una región en cis (la secuencia oriT) y un par de funciones en trans (la endonucleasa específica que actúa sobre oriT , y una helicasa).
En algunas bacterias Gram negativas, p. ej., en cepas de Pseudomonas existe un tipo especial de plásmido conjugativo, que tiene la facultad de transferirse a sí mismo y transferir cromosoma entre una amplia variedad de bacterias Gram negativas, incluyendo entre géneros muy diferentes. A esta clase de plásmidos se le ha dado el nombre de plásmidos promiscuos, y se han usado mucho para realizar mapeos y análisis genéticos en bacterias que por sí mismas carecen de sistemas naturales de conjugación. Ejemplos:
  • determinados plásmidos de resistencia a antibióticos pertenecientes al grupo IncP1 (como el RP4 y el R68.45, ambos con el fenotipo Ampr, Kanr, Tetr).
  • Plásmidos del grupo IncW (como el R388).
  • Plásmidos del grupo IncN (como el pKM101)
La existencia de plásmidos conjugativos, promiscuos o no, y de plásmidos no conjugativos pero movilizables, explica la rápida diseminación de muchos plásmidos de resistencia a antibióticos a una amplia diversidad de bacterias, incluyendo importantes patógenas, lo que hace cada vez más difícil la lucha por quimioterapia contra estas últimas. De hecho, un importante problema sanitario lo suministran estas cepas multirresistentes, muchas de las cuales están "acantonadas" en los ambientes hospitalarios, donde la presión selectiva es grande. A continuación nos detendremos precisamente en un comentario sobre los plásmidos R, su significado evolutivo y su importancia epidemiológica.

5.3 PLÁSMIDOS R

Los plásmidos de resistencia a antibióticos (plásmidos R) fueron descubiertos en los años 50 en Japón, cuando se investigaban cepas de Shigella multirresistentes (Cmr, Smr, Sur, Tetr) que habían empezado a aparecer y proliferar, de modo que en pocos años se diseminaron rápidamente por todo el primer mundo. Enseguida se encontraron en numerosos países cepas de E. coli y de otras enterobacterias con plásmidos similares.
Del intenso estudio a que han estado sometidos estos plásmidos desde entonces se deduce que los plásmidos R son "maleables" y que evolucionan rápidamente ante la presión selectiva. Con las modernas técnicas de Ingeniería Genética y de secuencición de ADN ha sido posible medir el grado de similitud de los genes plasmídicos de resistencia a antibióticos procedentes de bacterias muy diferentes, y de orígenes geográficos muy alejados entre sí, deduciéndose que estos genes han debido de "pasar" de forma epidémica de unas cepas a otras, entre especies y géneros muy distintos ("transmisión horizontal" de información genética). Un mismo gen, conservado en su secuencia en especies muy alejadas, puede sin embargo estar situado en plásmidos de diferentes tipos y grupos de incompatibilidad. Esto ya es un indicio de que los plásmidos R son bastante "moldeables", y que han venido evolucionando rápidamente desde que el hombre introdujo los quimioterápicos a mediados de este siglo.
Para hacernos una idea concreta del tipo de procesos implicados en este gran "experimento de evolución bacteriana" desencadenado por el hombre, veamos la estructura del ya citado plásmido R1, un típico plásmido R conjugativo.
Observen en los mapas genéticos que posee dos grandes regiones, denominadas determinantes:
  • det-r: región portadora de los genes de resistencia a distintos antibióticos.
  • det-RTF: región con los genes tra, responsable del carácter conjugativo del plásmido.
Veamos en más detalle el determinante "r". Comprobaremos que está compuesto de "módulos", algunos de los cuales son transposones. El determinante "r" como un todo está limitado por dos copias directas del IS1. Existe dentro un transposón, el Tn4, que codifica Smr y Sur, pero a su vez, dentro de él se insertó otro transposón, el Tn3 (que codifica Ampr). Por fuera del "doble transposón" Tn4-Tn3 encontramos más genes de resistencias: Cmr (a la izquierda), y Kanr, Neor. Las copias de IS1 hacen que todo el determinante "r" se comporte a su vez como un enorme transposón compuesto:
  • El "r" puede transponerse a otro plásmido totalmente diferente, o incluso al cromosoma;
  • El "r" puede escindirse, es decir, puede separarse del RTF, por recombinación homóloga entre las dos copias directas de IS1.
  • El "r" puede amplificarse: se originan varias copias de "r" dentro del mismo plásmido, de manera que esto permite a la bacteria resistir mayores concentraciones de los antibióticos.
Consecuencias evolutivas y epidemiológicas: Aunque en la naturaleza, e independientemente de la acción humana, ya existían plásmidos R antes de la era de los antibióticos, está claro que desde el uso masivo de los quimioterápicos se ha originado un aumento espectacular del número de cepas bacterianas portadoras de plásmidos R, así como el hecho de que los R que se están aislando recientemente llevan mayor número de genes de resistencia, lo que está dificultando los tratamientos de ciertas enfermedades infecciosas.
Estamos ante un espectacular "experimento" de genética de poblaciones, en el que la acción humana ha llevado a la supervivencia y prevalencia de las cepas bacterianas más aptas, por adaptación evolutiva frente a una fuerte presión selectiva.
Para ilustrar esto, basta hacer una sencilla comprobación: si se trata a un paciente con tetraciclina, al cabo de una semana las cepas de E. coli que se aislen de sus heces serán casi en su totalidad Tetr.
Está claro que la prescripción y uso indiscriminado de antibióticos como terapia provoca una presión selectiva que favorece la prevalencia de cepas portadoras de plásmidos R, que van "incorporando" genes de resistencia a diversos quimioterápicos. El uso de un antibiótico provoca la selección automática de las demás resistencias a otros antibióticos, ya que los genes responsables respectivos forman parte del mismo replicón, que además, al ser en muchos casos de tipo conjugativo, puede diseminarse a otras cepas de la misma o de diferentes especies.
En muchos países se usan antibióticos como suplementos de dieta para los animales domésticos. Se ha comprobado que esto es también una fuente de transmisión de cepas resistentes a humanos.
Otra cuestión evolutiva, aún no resuelta, es la del origen último de los genes de resistencia que tan fácilmente parecen transferirse entre especies bacterianas. Una hipótesis es que proceden de bacterias del suelo del grupo de los Actinomicetos, sobre todo del género Streptomyces, que son típicos productores de antibióticos, y que poseen de modo natural mecanismos de resistencia para evitar que el antibiótico que producen les afecte negativamente.

5.4 CONJUGACION EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS

Hasta ahora, y a diferencia de Gram negativas, se han encontrado pocos sistemas conjugativos en Gram positivas. Existen ejemplos de plásmidos autotransmisibles en especies de Streptococcus, Enterococcus, Bacillus, Clostridium y Streptomyces, y todos ellos son bastante diferentes de lo estudiado en Gram negativas. Por ejemplo, en ninguno de estos hay implicación de pelos sexuales.
Los plásmidos conjugativos de los cocos en cadenas (géns. Streptococcus y Enterococcus) han recibido cierta atención en los últimos años.
  • Algunos de estos plásmidos (p. ej., pAMß1) promueven una conjugación poco eficiente en líquidos, pero muy eficiente cuando las cepas donadoras y receptoras se mezlan sobre la superficie de un filtro de tipo Millipore.
  • Otros plásmidos son muy eficientes en líquidos, como les ocurre a ciertos plásmidos deEnterococcus faecalis. En estos casos el sistema de conjugación de la célula donadora portadora del plásmido responde a la presencia en el medio de feromonas sexuales excretadas por las células receptoras, carentes del plásmido. Existen varios ejemplos de este tipo que funcionan según este modelo. En cada caso, cada tipo de célula donadora (según el plásmido concreto que lleve) responde a un tipo definido de feromona. Las feromonas son pequeños péptidos de alrededor de 1.000 dalton de peso molecular. Una cepa receptora puede producir varias feromonas distintas, cada una "dedicada" a provocar una respuesta conjugativa en diferentes cepas donadoras según el plásmido que porten. Cuando una determinada feromona alcanza la superficie celular de la correspondiente célula donadora, induce en esta una serie de funciones relacionadas con la conjugación, una de las cuales es la producción desustancias de agregación, que provocan la adhesión entre donadoras y receptoras. Una vez que la célula originalmente receptora recibe el plásmido, se convierte en donadora de ese plásmido, y se reprime la producción de la feromona correspondiente, aunque las otras posibles feromonas se siguen sintetizando.
Por ejemplo, las células portadoras del plásmido pAD1 detectan un tipo concreto de feromona, lo que genera la respuesta de agregación con las células que producen esa feromona.

5.5 TRANSPOSONES CONJUGATIVOS EN ENTEROCOCCUS

En E. faecalis y otros cocos Gram positivos se ha descubierto una clase especial de transposones que tienen la curiosa propiedad de inducir conjugación entre dos células para transponerse desde el cromosoma de la donadora al de la receptora, pero sin producir transferencia de marcadores cromosómicos. El mecanismo aún se desconoce en detalle, pero parece que implica la circularización del transposón al escindirse del genóforo donador. Al parecer, esta clase de transposones conjugativos son los principales responsables de la diseminación de resistencias a antibióticos entre cepas de estos estreptococos y a otras bacterias Gram-positivas. Ej.: Tn916, que codifica Tetr y que mide unas 16 kb.

5.6 TRANSFERENCIA CONJUGATIVA ENTRE REINOS

Un sorprendente sistema de intercambio de material genético nada menos que entre una bacteria y plantas superiores lo tenemos en el caso de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que parasita una amplia diversidad de plantas dicotiledóneas. Como el estudiante verá en la sección de Taxonomía bacteriana, esta bacteria provoca el llamado "tumor en agalla" en los tallos de muchas plantas, debido a que posee un plásmido llamado Ti (iniciales inglesas de "inducción de tumoración (=agalla en corona)". Los productos de ciertos genes del plásmido Ti detectan la presencia de la planta, y activan a los genes tra, que promueven la transferencia a la célula vegetal de un segmento del plásmido denominado ADN-T. Dicho ADN-T se integra en el genoma vegetal, y allí los genes que lleva, que son de tipo eucariótico, obligan a la planta a fabricar hormonas vegetales (responsables del crecimiento incontrolado de las células de la planta) y a fabricar unas sustancias (las opinas) que sólo puede usar la bacteria como fuente de C y energía. Estamos ante un extraordinario caso de "colonización genética" de una bacteria sobre un organismo superior.
Los humanos hemos aprendido, a nuestra vez, a "domesticar" el sistema del plásmido Ti, de modo que actualmente, a partir de él se puede realizar Ingeniería Genética de plantas. La mayor parte de las plantas transgénicas están obtenidas con algún sistema de plásmidos artificiales derivados de Ti, que funcionan como vectores para introducir genes foráneos en una amplia diversidad de especies vegetales.
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