Anticuerpos
Antisuero o antiofídico es un producto biológico utilizado en el tratamiento de picaduras o mordeduras venenosas.
El antisuero se crea mediante la inyección de una pequeña cantidad de veneno blanco en un animal, como un caballo, oveja, cabra, conejo, etc; el animal sufrirá una respuesta inmune para el veneno, produciendo anticuerpos contra el veneno de la molécula activa. Pueden ser cosechadas a partir de la sangre del animal y se usa para tratar envenenamientos en otros. Internacionalmente, el antisuero debe cumplir las normas de lafarmacopea y la Organización Mundial de la Salud (OMS).- .............................:https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Especial:Libro&bookcmd=download&collection_id=2a016e11b919d4f42b25834d24e36c9a77632398&writer=rdf2latex&return_to=Antisuero
ANTISUEROS PARA ANTÍGENOS COLONIALES
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ANTISUEROS PARA ANTÍGENOS COLONIALES: Salmonella, E.Coli, Vibrio, Shigella.
INTRODUCCION
Para uso en identificaciones inmunológicas de los miembros del género Salmonella (o Escherichia coli, Vibrio cholerae, Shigella, para los que también sirve lo dicho a partir de aquí). Basados en el test de aglutinación bacteriana.
El género Salmonella contiene una amplia variedad de especies patógenas que afectan al hombre y
a los animales en todo el mundo. Sin embargo, la identificación completa de Salmonella requiere aislamiento en cultivos, caracterización bioquímica y serotipado.
a los animales en todo el mundo. Sin embargo, la identificación completa de Salmonella requiere aislamiento en cultivos, caracterización bioquímica y serotipado.
Los antisueros PROLAB y MUREX polivalentes se preparan mezclando el antisuero no absorbido de modo que den fuertes reacciones de aglutinación con las cepas correspondientes. Estos antisueros polivalentes sirven para guiar el diagnóstico, pero la identificación del grupo sólo puede realizarse con los antisueros monovalentes somáticos (O ó Vi) adicionales.
El serotipo de las Salmonella tambien se determina con el uso de antisueros polivalentes flagelares (H) en test de aglutinación, al contener éstos los anticuerpos contra antígenos flagelares asociados con el grupo somático del aislamiento. Los antisueros monovalentes flagelares (H) se utilizan para establecer la fórmula antigénica del aislamiento.
Todos estos antisueros se fabrican en conejos, de acuerdo con la WHO (World Health Organization) utilizando cultivos específicos de referencia y absorbidos por otros cultivos heteroespecíficos, para eliminar anticuerpos que reaccionan con antígenos homólogos.
El principio utilizado es la mezcla del microorganismo sospechoso con el antisuero que contiene aglutininas específicas de Salmonella. Las bacterias aglutinarán (“CLUMPING”) en presencia del antisuero homólogo y no aglutinarán en presencia de otros antisueros heterólogos.
Los antisueros contienen 0,01% de thiomerosal como conservante y se comercializan en goteros de 2 ó 3 ml listos para su empleo.
La estabilidad es de hasta cerca de dos años desde fabricación, y viene marcada en cada gotero. Éste debe mantenerse bien cerrado, al abrigo de la luz y a 2-5°C. Si se enturbia es porque algunos microorganismos han sido capaces de crecer con los antígenos como fuente de alimentación y en presencia del conservante. En tal inusual caso, filtrar de forma aséptica por 0,2 µm para recuperar la esterilidad y controlar la eficacia con cepas de referencia.
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MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO
- Portaobjetos de vidrio desengrasados
- Pipetas
- Solución Salina (0,85% ClNa en agua) (FPL112)
- Tubos
- Asas de siembra de plástico o palillos de madera
- Cepas de referencia CRIOSTRAINS, de trabajo o cuantitativas para validar los reactivos una vez llegados a fábrica o tras almacenamientos prolongados o inadecuados.
- Participación en servicios intercomparativos como SEILA para validar los procedimientos y los operarios.
PREPARACION DE LAS MUESTRAS
Las colonias aisladas en medios selectivos o diferenciales para Enterobacterias, que tengan las
características típicas de Salmonella se clasifican clásicamente con screening de pruebas bioquímicas. Si los antisueros que se van a usar son flagelares (H) es mejor partir de medios no agarizados, donde las bacterias hayan desarrollado mejor sus flagelos.
características típicas de Salmonella se clasifican clásicamente con screening de pruebas bioquímicas. Si los antisueros que se van a usar son flagelares (H) es mejor partir de medios no agarizados, donde las bacterias hayan desarrollado mejor sus flagelos.
MODO DE EMPLEO Y LECTURA DE RESULTADOS
A-Identificación de antígenos somáticos O y Vi en porta
1- Añada dos gotas separadas de solución salina en un portaobjetos de vidrio bien limpio.
2- Mezcle con un palillo o asa, sendas colonias de no más de 24 horas, para obtener una suspensión homogénea en cada gota.
3- Añada una gota de antisuero cerca de una de las suspensiones, sin tocarla para no contaminar el gotero. En la otra suspensión añada una gota de solución salina, que servirá como control negativo.
4- Mezcle la primera suspensión con la gota de antisuero, mediante un palillo.
5- Agite en forma de vaivén el porta durante 1 minuto. Se consideran positivos los resultados cuando se forman, bajo condiciones normales de buena luz, gránulos en la gota con antisuero y no se forman en la gota control.
B-Identificación de antígenos flagelares H en porta
El procedimiento es el mismo que en el caso anterior, con la única salvedad de que se utilizará como muestra la fase líquida de un medio semisólido o de un agar inclinado. Si se usa a partir de un medio líquido, no hay necesidad de utilizar solución salina.
C-Identificación de antígenos somáticos (O), Vi y flagelares (H) en tubo
1- Prepare una suspensión densa de la bacteria en solución salina. Hervir 10 minutos para la identificación con antisueros O o Vi. Prepare caldos de cultivo para la identificación de antígenos H añadiendo 0,5% de formol en solución salina, y diluya hasta alcanzar una concentración ligera, alrededor de 10 E9 bacterias/ml.
2- Antes de usar, diluya los antisueros en solución salina a razón 1:5.
3- Añada una o dos gotas de solución salina en un tubo de vidrio y otro tanto del suero diluido en otro tubo. Los tubos serán de fondo redondo, de 9 x 85 mm aproximadamente.
4- Añada el mismo volumen de la suspensión bacteriana a cada uno de los dos tubos.
5- Incubar en un baño de agua a 51°C durante 2 horas, en el caso de identificación flagelar, y durante 5-8 horas en el caso de identificación somática o del antígeno Vi.
6- Observar la aglutinación en los tubos, contra un fondo negro y bajo luz intensa. Los precipitados o aclaramientos del líquido no son positivos. Considerar positiva sólo la aparición de gránulos
7- Remitirse al esquema de Kauffman-White (1.966, The bacetriology of Enterobacteriaceae. The Williams & Wilkins Co., Baltimore) para identificar el serotipo.
LIMITACIONES Y PRECAUCIONES
1- La muestra puede contener microorganismos patógenos y debe manejarse como material potencialmente infeccioso.
2- Un control salino debe ser incluido en cada prueba para asegurar la especificidad de la reacción.
3- Ciertas cepas sufren autoaglutinación en el test de porta. Estos falsos positivos suelen aglutinar en el control de solución salina.
4- Se recomienda chequear la correcta actividad del antisuero con cepas control de referencia, de estructura antigénica conocida.
NOTAS SOBRE LOS ANTISUEROS DE VIBRIO
El antisuero polivalente se usará en test en porta, los monovalentes se pueden usar, además, en test en tubo, aunque en porta dan menos reacciones cruzadas entre ambos. No se pueden distinguir las variedades El Tor de otros Vibrio cholerae. El conservante utilizado es 0,5% de fenol.
AISLAMIENTO Y PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS.
- Obtención de antisueros (anticuerpos policlonales). Cuando un animal de experimentación es estimulado con un inmunógeno, éste responde produciendo gran variedad de Ac contra distintos componentes del Ag (polipéptidos, polisacáridos), y epitopos de cada uno de ellos. El conjunto de estos Ac es el antisuero (mezcla heterogénea de Ac) formado por Ac monoclonales. Dicha mezcla es heterogénea e irreproducible.
- Síntesis de anticuerpos monoclonales. Para obtener una solución que contenga un sólo Ac, y siempre el mismo, es necesario lograr la proliferación de un sólo LB. Algunos investigadores intentaron obtener Ac homogéneos (monoclonales) mediante transformación (inmortalización) de LB con el virus de Epstein Barr (VEB), estableciendo algunas líneas productoras, pero en poca cantidad.
8.1. OBTENCIÓN DE ANTISUEROS (ANTICUERPOS POLICLONALES).
Para la obtención de inmunosueros es necesario inocular varios animales con el mismo inmunógeno para seleccionar el mejor. El Ag se administra junto un adyuvante al menos en la inmunización primaria.
El antisuero se obtiene mediante el sangrado de los animales y después se comprueba el nivel de Ac mediante ELISA o Western-blot.
El antisuero se puede purificar por fraccionamiento proteico:
– Precipitación de gamma-globulinas con sulfato amónico al 30-50%.
– Filtración en gel para obtener moléculas de tamaño correcto.
– Cromatografía de intercambio iónico a pH 7: aísla las moléculas con carga positiva (Ac).
– Cromatografía de afinidad sobre ligandos naturales, como la proteína A estafilococica, que se une a Fc de los Ac.
– Cromatografía de afinidad mediante Ag fijado al soporte de la columna. Eluir y obtenemos los Ac puros.
8.2. PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS. TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN DE CÉLULAS SOMÁTICAS o HIBRIDOMAS (Kohler y Milstein).
La manera de hacerlo consiste en fusionar una célula plasmática específica para el Ag deseado, con otra célula que posee una capacidad indefinida de división. Por tanto, la célula fusionada será capaz de vivir en cultivo, dividirse y producir Ac.
Las células parentales responsables de la proliferación del hibridoma, son de una línea de mieloma. Son células capaces de vivir y dividirse in vitro, seleccionadas por carecer de la enzima HG PRT (hipoxantil-guanil-fosforribosil-transferasa); este defecto enzimático resulta necesario para la selección post-fusional de híbridos. La HG PRT es una enzima que utiliza guanina ó hipoxantina para producir purinas, lo que permite la reutilización de las bases cuando la síntesis de novo se ve interrumpida, por ejemplo por la aminopterina que bloquea la síntesis de purinas y timidinas. La adición de timidina al medio permite a la célula sintetizar timidina monofosfato, vía timidina quinasa, pero al no poder utilizar bases púricas, la célula muere, aun en presencia del precursor de hipoxantina.
El medio selectivo HAT contiene:
– Hipoxantina y timidina para enriquecer el cultivo.
– Aminopterina como inhibidor de la síntesis de novo.
En presencia de aminopterina sólo podrán sobrevivir aquellas células que expresan HG PRT, como los hibridomas; las células de mieloma morirán (son HG PRT -) y las células plasmáticas de bazo no se desarrollan en cultivo (no son inmortales). Otra característica de las células de mieloma es la de ser células no secretoras de Ac.
La obtención de Ac monoclonales sigue el siguiente esquema:
1) Inmunización de ratones con Ag soluble disuelto en adyuvante incompleto de Freund por vía intraperitoneal o intramuscular, administrando finalmente una dosis de recuerdo de Ag no emulsionado por vía intravenosa, 3 días antes de la fusión.
2) Fusión: se realiza 3 días después de la dosis de recuerdo del Ag, momento de máxima presencia de blastos en el bazo. Como agente fusionante se usa el polietilenglicol (PEG).
3) Selección de los híbridos linfocito-mieloma en medio HAT.
4) Cultivo de hibridomas en un medio que favorezca la división celular y la producción y secreción de Ac (RPMI 1640). El cultivo se realiza en placa de 96 pocillos a 37ºC, en estufa con un 5% de CO2.
5) Monitorización de la producción de Ac: la detección de Ac específicos en el medio de cultivo donde crecen los hibridomas es el punto más importante. Las técnicas deben ser de alta sensibilidad, capaces de detectar mgr/ml y rápidas para descartar cultivos inútiles. El método más utilizado es el ELISA.
6) Clonado: los cultivos que dan reacción positiva específica deben ser clonados lo más rápidamente posible para lograr el establecimiento de clones productores de Ac. El método más utilizado es la dilución en medio líquido o método de la dilución límite. Consiste en realizar diluciones de la población original para obtener cultivos que contengan una sola célula capaz de originar el clon correspondiente.
7) Producción de Ac monoclonales en grandes cantidades. Se puede realizar:
· “In vivo”: se inocula intraperitonealmente en ratones histocompatibles con la línea celular y se obtiene el líquido ascítico del animal en el que se pueden obtener concentraciones de Ac de mgr/ml.
· “In vitro”: realizar cultivos celulares de los híbridos a gran escala, obteniéndose concentraciones de mgr/ml en los sobrenadantes.
8.3. REDUCCIÓN DE SU INMUNOGENICIDAD. SÍNTESIS DE ANTICUERPOS QUIMÉRICOS
8.3.1. Disminución de la Inmunogenicidad de los anticuerpos
- Anticuerpos xenogénicos
– Estimulan la formación de antianticuerpos.
- Anticuerpos quiméricos (70% h +30% murino)
– Regiones variables murinas.
– Regiones constantes humanas funciones efectoras.
- Anticuerpos humanizados (90%h+10% murino)
– Reemplazo de regiones armazón originales del domino variable por otras humanas para disminuir todavía más la inmunogenicidad.
8.3.2. Variantes biotecnológicas
A) Quimeras con región Fc. alargan vida media de la molécula asociada
• Anticuerpos biespecíficos.
• Inmunopartículas biespecíficas
• Inmunoliposomas liposomas recubiertos de anticuerpos monoclonales letales como transportadores de sustancias toxicas intracelulares ej. RNAasas
B) El “toque humano” ha permitido el uso clínico
• Anticuerpos quiméricos (1995-) V murina C humana
– Simulect rechazo
– Remicade Infliximab Crohn, AR
• Humanizados HVR murina FR humana C humana
– Zenapax (1997) (CD25)
– Herceptin (1998) cáncer de mama metastático que expresa EGF receptor
– Campath (2001) antiCD52
– Xolair Omalizumab(2003) anti IgE asma alérgica
– Efalizumab (2004) psoriasis
– 200 tipos más están actualmente utilizándose en ensayos clínicos en humanos.
