Técnica de criofractura
Esta técnica brinda una imagen tridimensional del objeto que se está viendo. Por lo general el objeto que se va a ver se prepara de manera especial para permitir que se deposite sobre su superficie una capa delgada de un metal pesado, como oro o paladio.
Conforme el haz de electrones barre la superficie del objeto, algunos se reflejan (electrones de retrodispersión) y otros se expulsan (electrones secundarios) desde la cubierta de metal pesado. Detectores electrónicos capturan a los electrones de retrodispresión y secundarios y los interpretan, distribuyen, y proyectan sobre un monitor como imagen tridimensional (fig. 1-1e). La imagen se puede volver permanente mediante fotografía o por digitalización para guardarla en un disco de computadora.
Técnica de criofractura
La estructura molecular de las superficies internas de las membranas se revela por el método de la criofractura (fig.1-8f). Los ejemplares congelados con rapidez que se han tratado con criopreservadores no desarrollan cristales de hielo durante el proceso de congelación, de aquí que los tejidos no experimenten daño mecánico. Al ser golpeado el ejemplar congelado por una navaja de afeitar super enfriada, se fractura a lo largo de planos de segmentación, que son las regiones de menor fijación molecular; en las células las fracturas se producen entre las capas interna y externa de las membranas.
La superficie de fractura se cubre en un ángulo mediante platino evaporado y carbono, con lo que se formarán acumulaciones de platino sobre el lado de una proyección y no lo hacen en el lado opuesto siguiente a la proyección, con lo que se genera una réplica de la superficie. El tejido se digiere a continuación para eliminarlo, y se examina la réplica mediante microscopia electrónica de transmisión. Este método pone de manifiesto las proteínas transmembranales de las membranas celulares (fig.1-8f ).
Transcripción de CRIOFRACTURA
TÉCNICAS HISTOLÓGICAS ESPECIALES
Esta técnica es especialmente utilizada en la membrana
Esta se parte a través de la región
hidrofóbica dejando expuestas dos
caras de la membrana. De esta forma
se pueden apreciar claramente las
proteínas que participan en ella.
Detail 3
Detail 4
CRIOFRACTURA
Método especial para examinar la superficie de células
aisladas de su membrana a nivel macromolecular,
se requiere un fragmento pequeño de tejido el cual se
congela y se fractura en un plano semejante al instrumento
de corte.
Pasos de la Criofractura
1
Un fragmento de tejido se congela sumergiendo rápidamente la muestra (previamente tratada con un crioprotector como el glicerol para evitar la formación de cristales de hielo en el interior de la muestra) en nitrógeno líquido, a una temperatura cercana a los -195,8 °C.
2
Se fractura la muestra en un plano semejante al instrumento de corte (hoja metálica afilada).
Se mantiene el tejido al vacío.
3
Se calienta brevemente para grabar la superficie de fractura por sublimación al vacío y se hace una réplica de esta superficie por sombreo con metal pesado.
4
Se retira el tejido congelado y entonces se coloca la réplica de la superficie en una rejilla para observar al ME de transmisión o de centelleo.
Universidad Autónoma del Estado de México.
En la imagen inferior tienes dos células vistas con el microscopio electrónico con técnicas de transmisión (izquierda) y de criofractura (derecha). Aunque juntas, cada una de estas células posee una individualidad y esa cualidad se la proporciona la membrana plasmática.
 | En la imagen izda. hemos ampliado la zona de contacto entre dos células (1 y 2). Cada célula presenta una limitante que es la membrana plasmática (Flechas rojas) y entre las dos células hay un espacio intercelular (Ei)
La membrana plasmática aparece como una estructura trilaminar (dos bandas más oscuras en los extremos y una banda más clara en el centro), pero esto es solo un efecto de la tinción que usamos para poder ver las estructuras celulares al microscopio electrónico |
La ESTRUCTURA de la MEMBRANA PLASMÁTICA OBSERVADA por CRIOFRACTURA APOYA la HIPÓTESIS de MOSAICO FLUIDO
A la izquierda se muestra una imagen parcial de una célula vista por criofractura, en la imagen vemos la membrana (m), el citoplasma (c) y el núcleo (n). A la derecha se muestra una ampliación de la membrana plasmática, esta imagen sugiere que las proteínas de membrana -que se observan como granos- se hayan integradas en una superficie constituida por fosfolípidos.
La MEMBRANA MANTIENE la RELACIÓN ENTRE la CÉLULA y el EXTERIOR
La membrana plasmática es el componente que establece la comunicación entre la célula y el entorno. En la membrana se realiza un
transporte de moléculas en dos direcciones: de la célula al exterior y viceversa.
Los únicos mecanismos de transporte que pueden observarse al microscopio electrónico son los de la endocitosis y la exocitosis. La endocitosis es el mecanismo de formación de
vesículas en la membrana plasmática que se cargan con un contenido extracelular; la exocitosis es el proceso por el que las vesículas formadas en la célula se fusionan con la membrana plasmática y descargan su contenido al exterior.
Esos dos procesos distintos muestran, sin embargo, la misma imagen al microscopio electrónico (abajo). Las vesículas se fusionan con la membrana plasmática (Mp) o se forman en ella y este proceso no se distingue morfológicamente. Observa abajo como las vesículas (izda, flechas rojas) se localizan en la membrana plasmática y como el proceso se observa en criofractura como sacos asociados a la membrana (dcha, flechas rojas).
SUPERFICIE CELULARUsualmente la superficie celular no es lisa, como lo es la superficie de un globo inflado. Por el contrario puede presentar prolongaciones, algunas hasta 1 m de largo como es el caso de los axones de las neuronas.
Las microvellosidades (abajo, izda.) son pequeñas prolongaciones que aumentan la superficie de contacto de la célula con el medio exterior. Son habituales en células que limitan las cavidades de los organismos pluricelulares. Los cilios (derecha) son prolongaciones capaces de generar un movimiento sobre el medio extracelular líquido, para ello cuentan con un sistema de proteínas que forman parte delcitoesqueleto.
UNIONES
Las células de los organismos pluricelulares establecen contactos entre si. Estas uniones son importantes durante la formación del organismo pluricelular, para la coordinación de las células que lo componen y para la funcionalidad y la cohesión de las células que forman los tejidos. Estudiaremos las uniones en el curso, pero aquí tienes algunas de estas uniones tal y como se observan en microscopía
| GAP o NEXO | UNIÓN OCLUYENTE | UNIÓN ADHERENTE |
 |  | 
|
El desarrollo de la microscopía electrónica en los años 30 supuso uno de los progresos más grandes dentro de este campo. Los microscopios electrónicos, al iluminar la muestra con radiaciones electromagnéticas, haz de electrones, de longitud de onda muy corta, consiguen un poder de resolución muy superior al de los microscopios ópticos y por lo tanto un mayor aumento útil del objeto.
Existen dos tipos de microscopios electrónicos. El Microscopio electrónico de Transmisión (MET, TEM en lengua inglesa) y el Microscopio electrónico de Barrido (MEB, SEM en lengua inglesa). El MET tiene mayor poder de resolución pero el MEB produce imágenes tridimensionales de gran calidad .
Un microscopio electrónico de transmisión permite ver como objetos diferentes dos puntos que estén situados a una distancia de 1 nm, frente a los 200 nm que es el límite de resolución de un mircoscopio óptico. Esta resolución premite observar virus y estructuras moleculares. El número de aumentos puede llegar a ser de 200.000x.
La microscopía electrónica de transmisión requiere una preparación especial de las muestras, debido a que los electrones tienen poco poder de penetración. Se pueden hacer secciones finas de las células (Cortes ultrafinos) de menos de 0,1 mm de espesor, o se pueden seguir las técnicas de Criofractura y Criograbado o Sombreado
En la Criofractura las células se congelan en un bloque de hielo que a continuación se rompe con una cuchilla. La fractura deja al descubierto estructuras intrenas. Para más detalle se puede seguir la técnica de criograbado. Las muestras se someten a vacío y se elimina el agua por sublimación, esto hace que las estructuras sobresalgan en la superficie. A continuación se pulveriza carbón sobre eñ espécimen, que aún está congelado y se obtiene un réplica que se utiliaz para su observación al MET.
El sombreado metálico consiste en pulverizar el espécimen con una fina capa de un metal pesado como oro o platino, desde un ángulo. Los objetos de la preparación producen sombras en la capa de metal dando lugar a una imagen con una cierta apariencia tridimensional que permite calcular el tamaño del objeto.
Microfotografía de un bacteriófago obtenida por sombreado metálico.
Microfotografía de una bacteria obtenida por sombreado metálico.
La observación final se realiza al vacío y con las muestras completamente desecadas. Este tratamiento produce a veces artefactos en la imagen que han inducido errores en la interpretación. Durante mucho tiempo se creyó que las membranas tenían invaginaciones que se llamaron mesomonas. Dichos mesosomas resultaron ser consecuencia de la preparación e las muestras.
Todos los microscopios descritos hasta ahora, con excepción del microscopio de campo oscuro, se basan en el paso del haz de luz o de electrones a través de la muestra. En el MEB, sin embargo, se bombardea la muestra con un haz de electrones (primarios) lo que provoca la emisión de otros electrones (secundarios) que son recogidos para generar una señal que se transforma en una imagen tridimensional. El número de electrones secundarios expulsados varía con la composición y la conformación de las diferentes partes de la superficie bombardeada.
Los especímenes no necesitan ser cortadas en láminas ultrafinas ya que el haz de electrones recorre la superficie externa de la misma, no la atraviesa. La profundidad de campo es extraordinaria y las imágenes sorprendentes.
LR =20 nm
Número máximo de aumentos útiles= 100.000 x
Las muestras deben ser recubiertas de un metal pesado como el oro o el platino para evitar que los electrones penetren en ella. Permite observar el exterior de las células, o, si se realiza la técnica de criofractura, se pueden observar extructuas internas.
A partir de los años 80 se han desarrollado microscopios cada vez más potentes que permiten incluso ver átomos de la superficie de un objeto. El microscopio de sonda llamado deTunel de Barrido puede alcanzar aumentos de hasta 100 millones de veces. En la fotografía vemos una doble hélice de ADN fotografiada con un microscopio de Fuerza Atómica.
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