Estudios de la Histología humana

Microscopía electrónica de barrido

Al colocar una carga diferencial de cerca de 60 000 volt entre el cátodo y el ánodo, los electrones que pasan a través del agujero en el ánodo tienen más energía cinética.
El haz de electrones se enfoca sobre el ejemplar mediante electromagnetos, que son análogos a la lente condensadora del microscopio de luz (fig 1-1e). Como el tejido se encuentra contrastado con metales pesados que se precipitan de manera preferencial sobre las membranas lipídicas, los electrones pierden algo de su energía cinética al entrar en interacción con el tejido de estudio. Cuantos mayores sean las cantidades de metal y electrones que encuentren, menor la energía que se retendrá.
Los electrones que dejan el ejemplar se someten a los campos electromagnéticos de diversos electromagnetos adicionales, que enfocan el haz sobre una placa fluorescente. Al golpear los electrones la placa, su energía cinética se convierte en puntos luminosos cuya intensidad es una función directa de la energía cinética que poseen. Se efectúa un registro permamente de la imagen resultante mediante sustitución de una película sensible a los electrones en lugar de la placa fluorescente, y producción de un negativo a partir del cual se puede imprimir una fotomicrografía en blanco y negro.
Microscopia electrónica de barrido
A diferencia de la microscopia electrónica de transmisión la microscopia electrónica de barrido (MEB) se utiliza para ver la superficie de un ejemplar sólido.

 Microscopia electrónica de barrido  ...

El microscopio electrónico de barrido (SEM) es un instrumento capaz de ofrecer un variado rango de informaciones procedentes de la superficie de la muestra. Su funcionamiento se basa en barrer un haz de electrones sobre un área del tamaño que deseemos (aumentos) mientras en un monitor se visualiza la información que hayamos seleccionado en función de los detectores que hayan disponibles. En el Servicio de Microscopía de la U.P.V. existen los siguientes:

Detector de electrones secundarios (SE): es el que ofrece la típica imagen en blanco y negro de la topografía de la superficie examinada. Es la señal más adecuada para la observación de la muestra por ser la de mayor resolución.

Detector de electrones retrodispersados (BSE): también ofrece una imagen de superficie aunque de menor resolución. Su ventaja consiste en que es sensible a las variaciones en el número atómico de los elementos presentes en la superficie. Si tenemos una superficie totalmente lisa observaremos distintos tonos de gris en función de que existan varias fases con distintos elementos.

Detector de rayos X (EDS): es el que recibe los rayos X procedentes de cada uno de los puntos de la superficie sobre los que pasa el haz de electrones. Como la energía de cada rayo X es característica de cada elemento, podemos obtener información analítica cualitativa y cuantitativa de áreas del tamaño que deseemos de la superficie. Por ello se conoce esta técnica como Microanálisis por EDS.

Detector de rayos X (WDS): similar al anterior, pero en vez de recibir y procesar la energía de todos los rayos X a la vez, únicamente se mide la señal que genera un solo elemento. Esto hace que esta técnica, aunque más lenta, sea mucho más sensible y precisa que la de EDS. Realmente son complementarias, pues el EDS ofrece una buena información de todos los elementos presentes en la superficie de la muestra y el WDS es capaz de resolver los picos de elementos cuyas energías de emisión estén muy cercanas, así como detectar concentraciones mucho más pequeñas de cualquier elemento y, sobre todo, de los ligeros.

Detector de electrones retrodispersados difractados (BSED): en este caso sólo se reciben aquellos electrones difractados por la superficie de la muestra que cumplen la ley de Bragg en el punto que son generados, es decir, se trata de una señal que nos aporta información de la estructura cristalina de la muestra. Si conocemos previamente la o las fases cristalinas presentes en nuestra muestra, el sistema es capaz de procesar la señal que recibe en forma de “líneas de Kikuchi” y ofrecer una variada información cristalográfica: orientación de granos, orientaciones relativas entre ellos, textura, identificación de fases, evaluación de tensión, fronteras de grano, tamaño de grano…

Microscopia electronica de barrido

     En el microscopio electrónico de barrido, un campo magnetico permite enfocar los rayos catódicos (electrones) y obtener una imagen tridimensional, por el examen de la superficie de las estructuras, permitiendo la observación y la caracterización de materiales orgánicos e inorgánicos, proporciona aumentos de 200.000 diámetros.
        Von Ardenne, en 1.938, construyó el primer Microscopio Electrónico de Barrido (MEB); posteriormente, en Inglaterra, se construyó el primer MEB Ambiental, con el cual se pueden observar muestras hidratadas.Descripción del Equipo
El MEB consta de las siguientes partes:
1. Cañón de electrones (e-).
2. Filamento de tungsteno o de hexaboruro de lantano-LaB₆.
3. Anodo.
4. Columna en vacío.
5. Lentes condensadores (centran y dirigen el rayo de electrones).
6. Lentes Objetivas (controlan la cantidad de electrones del haz).
7. Detectores para colectar y medir electrones (producción de imagen).
8. Bobinas de barrido (obligan al haz a barrer la muestra).
9. Control de aumento.
10. Generador de barrido.
11. Colector de electrones (electrones  se atraen y se aceleran).
12. Escintilador (convierte la energía cinetica de los e- en luz visible).
13. Amplificador.
14. Pantalla (imagen).
15. Bombas de vacío.
Diagrama de funcionamiento
        La muestra es colocada en un pequeño espacio, al cual se le hace vacío después de cerrada la puerta. La puerta tiene tres palancas que el operador usa para: subir y bajar la muestra, rotar la muestra y acercarla o alejarla.
        Un haz delgado de electrones, es producido en la parte superior del microscopio por medio del calentamiento de un filamento metálico (10-30 KV). El rayo de electrones primarios sigue un recorrido a traves de la columna de vacío del microscopio, esto, con el propósito, de evitar la dispersión de los electrones. El trayecto del haz de electrones es enseguida modificado por un conjunto de bobinas deflectoras que lo hacen recorrer la muestra punto por punto y a lo largo de líneas paralelas (barrido), y a su vez atraviesa las lentes condensadoras o electromagneticas que le permiten ser reenfocado o centrado hacia la muestra. Posteriormente, el diámetro del haz de electrones puede ser modificado al pasar por las lentes objetivas que controlan la cantidad de electrones dentro de este. Cuando los electrones primarios golpean la muestra, son emitidos electrones secundarios por el propio especimen.  Estos electrones secundarios son atraídos por un colector donde se aceleran y se dirigen al escintilador, donde la energía cinetica Es convertida en puntos de mayor o de menor luminosidad, es decir, en luz visible. Esta luz es dirigida a un amplificador donde se convierte en senal electrica, la cual pasa a una pantalla de observación donde la imagen  es formada línea por línea y punto por punto. Los circuitos que dirigen las bobinas de barrido (que obligan al haz a barrer la muestra), son las mismas que dirigen la parte de colección de electrones y que producirán la imagen.
Resolución del Equipo
        El MEB tiene una resolución de 10 nm y una profundidad de foco de 10 mm, mucho menor que el microscopio electrónico de transmisión. La ventaja del MEB es que proporciona imágenes tridimensionales, ya que éste específicamente examina la superficie de las esructuras.
Preparación de las muestras
        Se debe tener en cuenta el material a observar y guiarse por parámetros específicos para cada muestra. Los siguientes pasos son utilizados en general  y guían acerca de lo necesario en cada uno.
Limpieza
Reactivo: solución salina
Objetivo: Remoción de contaminantes de la muestra
Comentarios: En muestras como dientes y huesos es necesario limpiar la muestra con una bomba de aire. Para epitielio intestinal se utilizan enzimas (quimiotripsina) que degradan el moco intestinal. En esperma de mamíferos es necesario lavar con solución salina y posteriormente centrifugar suavemente.
Relajación
Reactivo: Cloruro de magnesio, cloretano, hidrato de cloral y anestésicos locales como lidocaína.
Objetivo: Permitir que organismos marinos o de agua fresca, que utilizan el encogimiento y extensión para movilizarse, no se contraigan y pueda observarse toda la superficie de éste.
Comentarios: Se aplica gradualmente hasta que cese el movimiento del organismo.
Fijación
Reactivo: Glutaraldehído, formaldehído, permanganato y acroleína.
Objetivos: Permitir que cese la actividad biológica de la célula y preservar la estructura celular. Mantener la integridad de la superficie. Evitar cambios autolíticos, debido a que al haber remoción del organismo se presnetan cambios en temperatura, pH y concentración de oxígeno y nutrientes.
Comentarios: Se puede utilizar vapor de osmio, específicamente cuando se observan esporas de hongos. Es importante tener en cuenta la concentración del fijador y de la muestra, debido a que diversos estudios muestran que a una mayor concentración de éste, se dificulta la observación de lamuestra.
Deshidratación
Reactivo: Etanol o acetona.
Objetivo: Remover agua de los tejidos
Comentarios: Se utiliza más comúnmente etanol, debido a que la acetona, puede danar el secador en el SPC.
Secado de punto crítico
Reactivo: CO₂ líquido y gaseoso.
Objetivo:  Remoción total del agua de la muestra
Comentarios: Este paso se basa en lo siguiente: el CO₂ a temperatura baja es líquido y a temperatura alta es gaseoso. Cuando la muestra sale deshidratada por el etanol, se coloca en el secador de punto crítico (SPC), allí, la muestra se purga con CO₂ líquido hasta que el etanol haya sido reemplazado, posteriormente se sella la cámara y se calienta hasta que la temperatura llegue a 31ºC, de esta forma el CO₂ líquido se evapora y la muestra queda totalmente seca. Este procedimiento reduce de tamano la muestra.
Montaje de la muestra
Objetivo Utilizado: Porta muestra o stub
Objetivo: Colocar la muestra asegurada para permitir la colocación en el rociador de oro.
Comentarios: Para asegurar la muestra en el stub, se utiliza una cinta doble faz (tejidos) o carbono cemento conductivo CCC (dientes).
Recubrimiento con oro (sputter)
Elementos:  Oro, paladio o carbono
Objetivo: Permitir que el haz de electrones primarios choquen contra la muestra recubierta con un material conductor para que estas sean eléctricamente conductivas.
Comentarios: Este pocedimiento se realiza con un rociador o Sputter coater. Se coloca la muestra en la cámara, se sella y se programa el tiempo de recubrimientoen el cual el oro cae uniformemente, se hace vacío y automáticamente el timer se enciende y la muestra se recubre totalmente según el tiempo programado, aproximadamente son 2 minutos. Cuando el tiempo ha finalizado, lentamente empieza a ingresar aire a la cámara y de esta forma, la muestra está lista para colocarla en el MEB. El stub con la muestra recubierta no se debe tocar  con los dedos, por lo tanto es necesario utilizar pinzas.
Almacenamiento
Objeto utilizado: Cámara libre de humedad
Objetivo: Mantener la muestra totalmente seca para posterior observación.
Aplicaciones

• Obtención de imágenes 3D.
• Caracterización  estructural.
• Estudio de características morfológicas y topográficas.
• Estudio de enfermedades del tallo piloso.
• Estudio de formación de biofilms.
• Interacción de microorganismos con células eucariotas.

Ventajas y Desventajas

• Mayor resolución.
• Mayor numero de señales, mayor información.
• Imágen de detalles profundos de la superficie de la muestra: 3D
• No da información acerca de viabilidad cell.
• Costos
• Destrucción de la muestra: fijación y secado.
• Personal especializado.

Microscopio electrónico de barido (SEM)

Principios básicos: en el microscopio electrónico de barrido se hace incidir un delgado haz de electrones acelerados, con energías desde unos cientos de eV hasta unas decenas de keV (50 KeV), sobre una muestra gruesa, opaca a los electrones. Este haz se focaliza sobre la superficie de  la muestra de forma que realiza un barrido de la misma siguiendo una trayectoria de líneas paralelas.

    De todas las formas de radiación resultantes de la interacción del haz incidente y la muestra (ver fig. en la Introducción) hay dos realmente fundamentales en el  microscopio de barrido: los electrones secundarios y los electrones retrodispersados. Los primeros son electrones de baja energía (decenas de eV) que resultan de la emisión por parte de los átomos constituyentes de la muestra (los más cercanos a la superficie) debido a la colisión con el haz incidente. Los electrones retrodispersados sin embargo, son electrones del haz incidente que han interacccionado (colisionado) con los átomos de la muestra y han sido reflejados. La intensidad de ambas emisiones varía en función del ángulo que forma el haz incidente con la superficie del material, es decir depende de la topografía de la muestra.

    La señal emitida por los electrones y radiación resultantes del impacto se recoge mediante un detector y se amplifica para cada posición de la sonda. Las variaciones en la intensidad de la señal que se producen conforme la sonda barre la superficie de la muestra, se utilizan para variar la intensidad de la señal en un tubo de rayos catódicos que se desplaza en sincronía con la sonda. De esta forma existe una relación directa entre la posición del haz de electrones y la fluorescencia producida en el tubo de rayos catódicos. El resultado es una imagen topográfica muy ampliada de la muestra. 

    El aumento de la imagen producido por el microscopio de barrido resulta de la relación entre las dimensiones de la imagen final y el área de la muestra que ha sido barrida. Así, por ejemplo, si la sonda barre un área de 1 mm² de la muestra y la imagen en la pantalla es de 100 mm², ésta ha sido ampliada 100 veces.  Este microscopio tiene un rango de aumentos que varía desde ´10 hasta ´200.000 con una distancia focal de 35 mm. El poder de resolución del microscopio es determinado directamente por el área mínima que la sonda es capaz de escanear. El menor diámetro de la sonda con un número mínimo de electrones.

    Si la muestra no es buena conductora se acostumbra a recubrirla con una película conductora metálica o de carbono para evitar que ésta se cargue cuando sea irradiada.

Modos de operación: si el microscopio dispone de varios sistemas de detección es posible diferenciar entre energías electrónicas, principalmente  entre la señal producida por los electrones secundarios y la generada por los electrones retrodispersados.

Con los electrones secundarios se obtiene una imagen de apariencia tridimensional de la muestra:

    La intensidad de emisión de los electrones  retrodispersados depende del número atómico medio de los átomos de la muestra, así los átomos más pesados producen mayor cantidad de electrones retrodispersados. Una imagen originada por los electrones retrodispersados revela diferencias en la composición química por diferencias de contraste:

  El espectro de radiación X emitido por un mineral en el proceso puede ser utilizado para hacer un microanálisis químico semicuantitativo mediante espectrometría de dispersión de longitudes de onda. Los electrones incidentes excitan los átomos de la muestra y provocan la emisión de rayos X cuya longitud de onda (l) es característica de los elementos presentes en la muestra y cuya intensidad para una determinada longitud de onda es proporcional a la concentración relativa del elemento a esa l.

Normalmente se obtiene un análisis cualitativo de los constituyentes mayoritarios y minoritarios de pequeñas áreas (1mm). Sin embargo, en muestras planas y bien pulidas es posible hacer análisis cuantitativos al comparar la intensidad de los rayos X a cualquier l con la producida en una muestra estándar (patrón) de composición conocida. La precisión de un análisis cuantitativo normalmente es mayor del ± 2% y los límites de detección están alrededor de las 100 ppm en análisis rutinarios, llegando a ser de 10 ppm en circunstancias excepcionales.

    Es preciso hacer una corrección (ZAF) en función de tres factores: número atómico (Z), absorción (A) y fluorescencia (F) antes de extraer los resultados cuantitativos.

En geología se usa habitualmente en micropaleontología, diagénesis y determinación de texturas (en granos), y mineralogía.

            Microsonda electrónica

Principios básicos: En los análisis de microsonda electrónica, el bombardeo de electrones sobre la muestra genera de rayos X que son exahustivamente analizados. Así, con la longitud de onda o la intensidad de las líneas en el espectro de rayos X, los elementos presentes pueden ser identificados y sus concentraciones estimadas. El uso de un haz de electrones muy finamente focalizado consigue seleccionar un área muy pequeña para ser analizada.

Los análisis cualitativos (identifican los elementos presentes) suponen la grabación del espectro mediante un espectrómetro de rayos X, por encima del rango de longitudes de onda o energías dentro de las cuales las líneas relevantes pueden estar presentes. Las líneas son identificables por referencia a las tablas.

En los análisis cuantitativos, las intensidades de las líneas de rayos X del especimen son comparadas con aquellas originadas por estándares de composición conocida. Las intensidades medidas requieren ciertas correcciones instrumentales, incluyendo la eliminación del fondo, de la que es origen principalmente el "espectro contínuo"  (fotones emitidos por electrones decelerados en colisiones con átomos). La composición en el punto analizado es calculada a patir de las intensidades, corregidas por la "matriz de correcciones", que tiene en cuenta los diferentes factores que gobiernan la relación entre intensidad y composición. Esto es lo que se aplica comunmente en forma de correcciones ZAF (con factores de corrección separados dependientes del número atómico, de la absorción y de la fluorescencia.

Modos de operación: Los electrones incidentes normalmente tienen una energía cinética de 10-30 KeV (un eV es la energía asociada con un cambio de 1 voltio en el potencial de un electrón), y penetra la muestra a una profundidad del orden de 1 µm, extendiéndose lateralmente a una distancia similar. Esto impone un límite inferior para el volumen analizado y por tanto para la resolución espacial. La mejora de la resolución mediante la reducción de la energía del electrón es generalmente impracticable ya que éstos deben poseer suficiente energía para conseguir una excitación eficiente de rayos X.

En los análisis de microsonda, el espectro de rayos X es grabado con un espectrómetro de dispersión de longitudes de onda (wavelength-dispersive spectrometers, WDS), o de dispersión de energía (energy-dispersive spectrometers, EDS). El primero utiliza un cristal difractor que actúa como un monocromador, seleccionando una longitud de onda cada vez, dependiendo del ángulo de incidencia de los rayos X. Muchos instrumentos tienen dos o más espectrómetros con cristales que cubren diferentes rangos de longitudes de onda. Los espectrómetros de energía dispersiva emplean detectores complementarios de rayos X en estado sólido y para algunos objetivos han reemplazado a los WDS. Los EDS graban el espectro completo simultáneamente, se analiza la altura del pulso electrónico para tipos de pulsos producidos en el detector de acuerdo con la energía de los rayos X.     

La platina portadora de muestras aloja normalmente varias muestras y estándares. Las muestras son siempre redondas o rectangulares con dimensiones típicas del orden de 2 o 3 cm. Los patrones pueden ser montados individualmente o agrupados en soportes de tamaño normalizado. Se requiere que la muestras sean gruesas y estén pulidas, y que sean situadas en un sitio plano. Lo normal es fijar el foco del microscopio óptico acoplado y usar usar un fino ajuste de la platina en la dirección z para enfocar. Esto asegura que la posición de la fuente de rayos X es constante, lo cual es especialmente importante para espectrómetros de dispersión de longitudes de onda. En la actualidad, mediante ordenadores se controla la posición x e y, y los movimientos en z.  Esto posibilita el análisis de un gran número de puntos sin intervención del operador, usando coordenadas previamente almacenadas.

Microsonda electrónica versus microscopio electrónico de barrido: la microsonda electrónica posee muchas características comunes con el microscopio de barrido. La diferencia fundamental es que en el microscopio de barrido tienen prioridad la adquisición de imágenes topográficas de gran resolución sobre el microanálisis mientras que en la microsonda ocurre todo lo contrario. Normalmente las microsondas electrónicas poseen más de dos espectrómetros de rayos-X y un control preciso de los movimientos para localizar las coordenadas concretas de puntos previamente almacenados. Las muestras, planas y perfectamente pulidas, se disponen siempre perpendiculares al haz incidente. Todo ello hace que con la microsonda electrónica se consigan análisis cuantitativos más precisos que con la microscopía electrónica de barrido con un espectrómetro de rayos X.