Las enzimas se pueden localizar por procedimientos histoquímicos, De hecho, lo que se ve es el producto de la reacción enzimática, no la propia enzima. El reactivo se ha diseñado de modo que el producto se precipite en el sitio de la reacción y sea visible como depósito metálico o coloreado.
Inmunocitoquímica
Aunque los procedimientos histoquímicos permiten una localización buena de algunas enzimas y macromoléculas en las células y los tejidos, se puede lograr localización más precisa medianteinmunocitoquímica. Este procedimiento requiere el desarrollo de un anticuerpo contra la macromolécula especifica que se va a localizar, y que se marque el anticuerpo con un colorante fluorescente como fluoresceína o rodamina.
Son dos los métodos para la marcación de los anticuerpos, directo e indirecto. En el método directo (fig. 1-3e) el anticuerpo contra la macromolécula se marca con un colorante fluorescente. A continuación se permite que el anticuerpo reaccione con la macromolécula y, como consecuencia, podría verse el complejo resultante con un microscopio de fluorescencia (fig. 1-4L), En el método indirecto (fig. 1-3e) se prepara un anticuerpo marcado con material fluorescente contra el anticuerpo primario específico para la macromolécula de interés. Una vez que el anticuerpo primario reacciona con el antígeno, se lava la preparación para eliminar el anticuerpo primario que no se fijó; se añade a continuación el anticuerpo marcado que reacciona con el complejo original de antígeno y anticuerpo, y forma de esta manera un complejo secundario visible durante la microscopia de fluorescencia (fig.1-5L), El método indirecto es más sensible que el método directo, porque se fija al anticuerpo primario varios anticuerpos marcados, lo que los vuelve más fáciles de visualizar. Por añadidura, el método indirecto no requiere marcación del anticuerpo primario, que a menudo está disponible sólo en cantidades limitadas.
La inmunocitoquímica es una técnica para la localización de moléculas en los tejidos mediante el empleo de anticuerpos. Es una técnica que gracias a la oferta comercial de anticuerpos y a la estandarización de su protocolo se ha convertido en un método sencillo, rápido y muy potente. Se basa en la gran especificidad y alta afinidad que tienen los anticuerpos para reconocer a moléculas y unirse a ellas. Además, la conjugación o combinación de los anticuerpos con enzimas o con sustancias fluorescentes permite detectar cantidades ínfimas de moléculas presentes en el tejido.
Los anticuerpos o inmunoglobulinas que se usan en las técnicas inmunocitoquímicas son del tipo G, producidas por unas células del sistema inmunitario denominados linfocitos B durante la respuesta inmune. La producción masiva de anticuerpos se produce en un animal cuando le inyectamos una molécula, en este caso nuestra molécula problema, que reconoce como extraña. Estos anticuerpos pasan al suero sanguíneo que se extrae del animal inmunizado y a partir del cual se purifican. Éstos se usarán posteriormente en la técnica inmunocitoquímica. Las moléculas complejas como la proteínas tienen en su estructura varios determinantes antigénicos, es decir, lugares que son capaces de desencadenar una respuesta inmune. Ello implica que cada determinante antigénico activará un clon, línea de linfocitos B, que producirá anticuerpos contra él. Los anticuerpos de todos los clones de linfocitos B activados por la molécula inyectada irán a parar al suero. Cuando se emplean sueros purificados de este tipo en inmunocitoquímica se dice que se están empleando anticuerpos policlonales. Existe una técnica que perimite aislar y cultivar en el laboratorio (in vitro) de forma inividualizada a cada uno de los clones de linfocitos B activados durante la respuesta inmune. Cada uno de esos cultivos producirá un solo tipo de inmunoglobulina G que reconocerá sólo a uno de los determinantes antigénicos de la molécula inyectada. A estos anticuerpos se les denomina monoclonales ya que proceden de linfocitos que producen inmunoglobulinas idénticas.
Esquema resumido de las diferencias en la obtención de anticuerpos policlonales (izquierda) y monoclonales (centro y derecha).
Las inmunoglobulinas tipo G pueden dividirse en dos dominos: la fracción cristalizable y la variable. El dominio variable es el que se encarga de reconocer al determinante antigénico de nuestra molécula. Hay dos sitios de unión por lo que cada inmunoglubulina podría reconocer a dos moléculas o determinantes antigénicos, que han de ser iguales. La fracción cristalizable tiene una estructura similar para todas las inmunoglubulinas G producidas por los individuos de una misma especie.
Para que un anticuerpo se una a su determinante antigénico localizado en una molécula, ésta no debe alterarse. De otro modo ese determinante antigénico no será reconocido por el anticuerpo. Por ello el proceso de fijación del tejido debe elegirse para preservar al máximo a la molécula que queremos detectar. Así, se usan diferentes fijadores según el tipo de molécula en la que estemos interados. También es necesario considerar el método de obtención de loscortes. Inclusiones en parafina pueden dañar las moléculas por lo que en la mayoría de los casos se suele trabajar con cortes de vibratomo o con secciones obtenidas por congelación.
Las inmunoglobulinas, aunque se unan a la molécula que queramos detectar, no son visibles con el microscopio por lo que la tendremos que conjugar (unirla) a otras moléculas que nos den una señal visible. Estas moléculas que aportan visibilidad a los anticuerpos suelen ser de dos tipos: moléculas fluorescentes y enzimas. Las primeras se pueden observar con el microscopio de fluorescencia mientras que las segundas pueden convertir determinados sustratos solubles en productos insolubles y coloreados. La señal aparece allí donde está la sustancia fluorescente o el enzima, que es donde se ha unido la inmunoglubulina.
El método del marcado con sustancias fluorescentes tiene una serie de ventajas que veremos más adelante, pero tiene la desventaje de que no son marcajes permanentes puesto que la luz emitida por la molécula fluorescente se desvanece con el tiempo. Sin embargo, las secciones procesadas con anticuerpos unidos a enzimas pueden deshidratarse, montarse y mantenerse permanentemente para su obeservación. Las enzimas habituales que se unen a las inmunoglobulinas son la peroxidasa y la fosfatasa alcalina.
Métodos de marcaje para detectar los anticuerpos primarios unidos específicamente a una molécula del tejido.
La conjugación directa de un marcador (enzima o fluorescente) con la inmunoglobulina se denomina método de detección directa. Hoy en día se suele emplear el método de detección indirecta, que consiste en colocar una serie de intermediarios entre la inmunoglobulina y la molécula marcadora. Inicialmente se usó el método indirecto denominado peroxidasa-antiperoxidasa (PAP; ver figura anterior), pero actualmente es más frecuente usar el método del complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC; ver figura anterior). El método indirecto permite una mayor versatilidad de la técnica y mayor intensidad de señal frente a una misma cantidad de antígeno.
La inmunofluorescencia se basa en las propiedades de los fluorocromos. Son moléculas que emiten luz visible cuando se les ilumina con una determinada longitud de onda. Aunque la inmunofluorescencia se puede usar para detectar a una sola molécula tisular, su verdadero potencial se muestra cuando necesitamos una múltiple inmunodetección, es decir, dos o más moléculas presentes en una misma célula o matriz extracelular de forma simultánea. Esto es posible porque existe una gran variedad de fluorocromos que son capaces de emitir luz visible tras ser excitados con diferentes longitudes de onda, luego seleccionando el intervalo de longitudes onda con el que iluminamos un tejido podemos excitar de modo individual, y secuencial, varios fluorocromos que hayamos usado, unidos a inmunoglubulinas diferentes, para detectar moléculas diferentes. Tomando fotografías tras cada excitación y superponiendo dichas imágenes podemos averiguar si las moléculas se expresan, por ejemplo, en la misma célula.
Detección de la molécula tirosina hidroxilasa mediante inmunocitoquímica usando un anticuerpo primario sin marcar, un anticuerpo secundario conjugado con biotina y el complejo avidia-biotina-peroxidasa.
Inmunocitoquímica con detección indirecta y enzimática. La sección se obtiene de tejido previamente fijado. Inmediantemante después se incuban en una solución de bloqueo que satura los posibles sitios de unión inespecífica, gracias a una alta concentración de proteína como la albúmina de suero bovino. Tras cada paso de unión de anticuerpos o del complejo avidina-biotina-peroxidasa se procede a lavar los cortes en una solución tamponada de fosfato (tampón fosfato), en la que también van disueltos los anticuerpos. La reacción de la peroxidasa convierte unos sustratos, la diaminobencidina y el peróxido de hidrógeno, en un producto insoluble y coloreado visible con el microscopio ótico.
Detección con inmunofluorescencia de dos antígenos en una sección de tejido nervioso: la molécula calbindina (a la izquierda) y parvoalbúmina (a la derecha), usando fluoresceína y texas red como fluorocromos, respectivamente, mediante un método de marcaje indirecto. Se pueden observar cuerpos celulares y prolongaciones nerviosas. Las flechas blancas indican células que poseen ambas proteínas (calbindina y parvoalbúmina) mientras que la flechas azules indican cuerpos celulares que sólo expresan parvoalbúmina. Obsérvense las zonas oscuras, negativas, en la imagen de la izquierda.
Detección simultánea de dos moléculas situadas en misma sección mediante inmunofluorescencia. La razón de que los dos anticuerpos primarios procedan de dos animales diferentes es que los anticuerpo secundarios, obtenidos de otro animal, normalmente cabra u oveja, inmunizados con las inmunoglobulinas de ratón y conejo, respectivamente, es lo que permite a cada anticuerpo secundario reconocer y unirse a un anticuerpo primario determinado y no al otro.
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