Estudios de la Histología humana

• Interpretación de los cortes microscópicos.

La cualidad de una imagen dependerá no sólo de la capacidad de la lente para la amplificación, sino también de su resolución, que es la capacidad para demostrar que dos objetos definidos están separados por una distancia determinada. La calidad de una lente dependerá de lo cerca que se aproxime su resolución al límite teórico de 0.25 µm, que está determinado por la longitud de onda de la luz visible.
Existen diversos tipos de microscopios de luz, según el tipo de luz que emplean como fuente luminosa y la manera en que la aprovechan. Sin embargo, la mayoría de los estudiantes de histología deben reconocer sólo imágenes obtenidas de microscopia de luz compuesta, microscopia de transmisión de electrones y microscopia de barrido de electrones; por tanto, no se hablará de los otros tipos de microscopia.
Interpretación de los cortes microscópicos
Una de las capacidades histológicas más difícil, frustrante y consumidora de tiempo es el aprender a interpretar la manera en que se vería en tres dimensiones la imagen de un corte bidimensional. Si el lector se imagina una manguera de jardín ondulada y, a continuación, efectúa los cortes delgados indicados en la figura 1-2e de esa manguera se pondrá de manifiesto que el objeto tridimensional no se discierne de manera necesaria a partir de cualquiera de las ilustraciones bidimensionales. Sin embargo, al ver todos los cortes efectuados en la manguera ondulada, se puede reconstruir de manera mental la imagen tridimensional correcta.
Procedimientos avanzados de identificación
Histoquímica
Se pueden localizar los constituyentes químicos específicos de los tejidos y las células por métodos de histoquímica y citoquímica. Estos métodos se valen de la actividad enzimática, la reactividad química y otros fenómenos fisicoquímicos relacionados con el constituyente de interés. Las reacciones buscadas se vigilan a partir de la formación de un precipitado insoluble que adopta cierto color. A menudo la histoquímica se efectúa sobre tejidos congelados, y se puede aplicar tanto a la microscopia de luz como a la microscopia electrónica.
Una reacción histoquímica frecuente recurre al reactivo de ácido peryódico de Schiff, que forma un precipitado de color magenta con moléculas ricas en glucógeno y carbohidratos. Con objeto de garantizar que la reacción sea específica para el glucógeno, los cortes consecutivos se tratan con amilasa. Por tanto, los cortes que no se han tratado con esta última manifiestan un depósito de color magenta, en tanto que los tratados con amilasa carecerán de coloración en la misma región.

Interpretación de las imágenes microscópicas:

Aspectos bidimensionales de las estructuras tridimensionales.

Interpretación tridimensional:
Las imágenes obtenidas a partir de preparados histológicos observados al microscopio se denominan micrografías o microfotografías. Los microscopios de uso común, en su mayoría, permiten obtener imágenes bidimensionales, salvo contadas excepciones, como lo son las microfotografías obtenidas con microscopios especiales (microscopio electrónico de barrido, microscopio confocal) que muestran las estructuras en sus 3 dimensiones. Una de las dificultades a las que se enfrentan los estudiantes al analizar las imágenes microscópicas, consiste precisamente en la interpretación de las imágenes bidimensionales y realizar a partir de ellas la subsiguiente reconstrucción mental del aspecto tridimensional de las estructuras observadas. Comprender el aspecto tridimensional es indispensable para formar el correcto esquema conceptual de lo que se estudia. Es por ello que el estudiante debe complementar la observación microscópica de preparados histológicos y micrografías con la observación y análisis de dibujos o esquemas presentados en los textos de estudio recomendados. Esto conducirá a un desarrollo de la imaginación y la memoria visual necesarias para aprender la Histología.

Se pueden obtener interpretaciones erróneas al observar una imagen microscópica bidimensional puesto que se generalmente se estudian cortes aislados y la imagen obtenida dependerá del plano en el cual se realizó el corte de la estructura. De allí que se recomienda pensar en 3 dimensiones cuando se observan los cortes histológicos y adaptar la imagen a la forma macroscópica de la estructura.

Planos de corte histológico:
Corte longitudinal: Es el corte que se hace paralelo a la mayor dimensión de la estructura.

Corte transversal: Es el corte que se hace de manera perpendicular al eje longitudinal de la estructura.

Corte tangencial: Es el corte que se realiza tocando apenas la superficie de la estructura; también se le denomina rasante.

Corte oblicuo: Cuando se corta la estructura en un ángulo que esté comprendido entre los dos planos anteriores (longitudinal y transversal).

histoquímica

Incluiremos dentro de las técnicas histoquímicas a aquellas que supongan una reacción química en la que intervienen moléculas pertenecientes al propio tejido (trataremos la detección de glúcidos mediante lectinas y la inmunohistoquímica en apartados diferentes a éste, aunque algunos autores las incluyen como ténicas histoquímicas). El objetivo de la histoquímica es poner de manifiesto una molécula o familia de moléculas presentes en una sección histológica y estudiar su distribución tisular "in situ". Estas moléculas son difícilmente discernibles con colorantes generales. Durante el procesamiento del tejido previo a la reacción histoquímica, como la fijación o la inclusión, hay queevitar dañar a la molécula que queremos detectar porque de otra manera resultaría en falsos negativos, es decir, no tener tinción cuando en realidad la molécula de interés sí está presente en el tejido, aunque deteriorada. En algunas ocasiones es necesario realizar pasos previos a la reacción histoquímica para descubrir la molécula que queremos detectar, por ejemplo usando un fijador adecuado, ya que de otra manera no reaccionaría con los reactivos químicos. Vamos a dividir las técnicas histoquímicas en dos grupos: reacciones químicas e histoquímica enzimática. Las reacciones químicas consisten en la modificación química de moléculas del tejido para posteriormente poder colorearlas. Existen técnicas histoquímicas para detectar glúcidos, proteínas y nucleótidos. La técnica histoquímica más empleada es la reacción de PAS (Periodic Acid Schiff). Se utiliza para la detección de hidratos de carbono, libres o conjugados, cuando están en cantidades relativamente grandes en los tejidos. La modificación química del tejido consiste en la oxidación mediante el ácido periódico de los enlaces entre los carbonos próximos que contienen grupos hidroxilos. Esto provoca la formación de grupos aldehídos que serán reconocidos por el reactivo de Schiff, el cual se combinará con ellos para dar un color rojizo brillante. Entre los componentes del reactivo de Schiff está la pararosanilina (un componente de la fucsina básica) tratada con ácido sulfúrico. Una gran ventaja de la tinción histoquímica PAS es su capacidad de discriminación de tipos de glúcidos con pequeñas modificaciones de la técnica. Tinción con hematoxilina-eosina (imagen de la izquierda) y PAS-hematoxilina (imagen de la derecha) de las vellosidades del intestino de humano cortadas transversalmente. Se puede apreciar a las células caliciformes teñidas de rosado con la ténica de PAS por su alto contenido en mucopolisacáridos, mientras que en una tición general aparecen transparentes, sin teñir. Pasos de la tinción histoquímica PAS-Hemtaoxilina sobre cortes de parafina. Los pasos con letras en color verde son los específicos para esta tinción. La histoquímica enzimática o histoenzimología se basa en la capacidad que tienen algunos enzimas del tejido de mantener funcional su centro activo tras el proceso de fijación. Estos enzimas y las células que los poseen se ponen de manifiesto mediante una reacción enzimática que convierte a unos sustratos solubles e incoloros en productos insolubles y coloreados. Los sustratos son específicos para el enzima y los productos se depositan en el lugar preciso donde se produjo la reacción, es decir, donde se localiza el enzima. Las enzimas que se pueden detectar son variadas como las peroxidasas, fosfatasas, deshidrogenasas, diaforasas, acetilcolinesterasa, etcétera. Hay que tener en cuenta que cuando queremos detectar una actividad enzimática es recomendable no incluir el material en medios como la parafina puesto que la deshidratación y la temperatura elevada pueden dañar la conformación de la enzima y por tanto la actividad de su centro activo. Por ello estas técnicas se realizan normalmente en secciones obtenidas por congelación o con el vibratomo. La actividad NADPH diaforasa se asocia a la enzimas sintasas del óxido nítrico en sistema nervioso y vascular. A estos enzimas se les ha relacionado con el control del flujo sanguíneo y con ciertos aspectos de la fisiología del sistema nervioso. Esta técnica permite detectar neuronas que expresan la enzima sintasa del óxido nítrico de una forma sencilla y rápida. La reacción es NADPH + tetrazolio = NADP+ + formazán. Es el formazán el producto coloreado e insoluble que se puede observar con el microscopio óptico, incluso con el electrónico. Imagen de un corte de 60 µm de grosor de cerebro obtenida con un criostato y procesada para histoquímica enzimática que pone de manifiesto una actividad diaforasa perteneciente a la enzima óxido nítrico sintasa neuronal que aparece en algunas neuronas (células con un color azul intenso). Los pasos para la detección histoquímica de la actividad diaforasa es muy sencilla. Tras una fijación, preferentemente por perfusión, hay que permeabilizar el tejido con un disolvente de lípidos como el Triton-X100. El revelado se produce a 37 oC y el final de la reacción se controla mediante observaciones periódicas. La concentración de los sustratos (NADPH y azul de tetrazolio) varía según el tejido o el proceso de fijación. Histoquímica No enzimática Este procedimiento incluye diversas técnicas que permiten la identificación de componentes celulares o intercelulares, que al ser identificadas, contribuyen a tener más precisión en un diagnóstico que se sospecha, en la clasificación de una enfermedad, o en la identificación de bacterias como Helicobacter pylori asociado a gastritis. Clasificación de fibrosis en la médula ósea de enfermedades como síndrome mielodisplásico, infiltración por linfomas o leucemias; identificación de fibras elásticas en vasos sanguíneos o en algunos tumores etc. Masson en una biopsia de hígado Tinción de fibras elásticas, que muestra una arteria de una biopsia de pulmón TÉCNICAS DE HISTOQUÍMICA Realizamos todo tipo de técnicas de histoquímica para facilitar un diagnóstico acurado al patólogo. La histoquímica es la aplicación de las  reacciones químicas y bioquímicas en la técnica histológica, con el fin de localizar y determinar de manera científica ciertas sustancias o su actividad. En todas estas reacciones o bien se tiñe la sustancia que buscamos o los colorantes reaccionan químicamente con ella, como es el caso del PAS. Las técnicas histoquímicas comprenden el conjunto de métodos empleados para la demostración de la naturaleza química de los componentes tisulares y celulares. Se recurre al empleo de estas tinciones histoquímicas cuando la pretensión es visualizar (teñir) específicamente una sustancia determinada.  Los métodos histoquímicos se basan, pues, en hacer reaccionar químicamente (incubar) determinados reactivos con los componentes celulares o tisulares que queremos demostrar para obtener un producto final que es coloreado y puede verse con el microscopio.