Estudios de la microbiología

CRECIMIENTO A NIVEL DE POBLACIONES

DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO DE POBLACIONES BACTERIANAS

El crecimiento de una población o cultivo bacterianos se puede expresar en función de:

• aumento de masa del cultivo
• aumento del número de células

Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que estén en crecimiento balanceado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporción por unidad de tiempo).

1.1 MEDIDA DE MASA BACTERIANA

1.1.1  Métodos directos:

en estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas.

1.1.1.1  Determinación del peso húmedo:

1. se tara un tubo de centrífuga;
2. se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante;
3. se determina el peso del sedimento.

Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.

1.1.1.2  Determinación del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105^oC, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso húmedo.

Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x10⁹ bacterias.

1.1.1.3  Determinación del nitrógeno total: técnica de micro-Kjeldahl.1.1.14  Determinación de un componente característico: peptidoglucano, ADN, ARN, proteínas, etc.

Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros métodos más fáciles dan errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes naturales.

1.1.2  Métodos indirectos

1.1.2.1  Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad de tiempo . Ejemplos: consumo de oxígeno (QO₂) y consumo de carbónico (QCO₂), determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de ácidos.

1.1.2.2   Métodos turbidimétricos (ópticos). La base común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano.

Recordemos aquí que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partícula pequeña suspendida en agua. La dispersión de la luz es, dentro de ciertos límites, proporcional a la masa del cultivo.

Medición de luz transmitida:
A) Escala de MacFarland: Se trata de una serie de patrones de turbidez previamente calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio herméticamente cerrados que contienen {1% de Cl₂Ba + cantidades crecientes de SO₄H₂ al 1%}; por lo tanto, en cada tubo se origina un precipitado de SO₄Ba, origen de la turbidez. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentración de bacterias (en céls/ml) que genera una turbidez similar. Se trata de una serie de patrones de turbidez previamente calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio herméticamente cerrados que contienen {1% de Cl₂Ba + cantidades crecientes de SO₄H₂ al 1%}; por lo tanto, en cada tubo se origina un precipitado de SO₄Ba, origen de la turbidez. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentración de bacterias (en céls/ml) que genera una turbidez similar.

Inconveniente: es un método poco preciso, que sólo se emplea cuando no hace falta exactitud. Ha sido desplazado por los métodos espectrofotométricos.
B) Espectrofotómetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiología o Bioquímica. Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia.

D.O. = A = -logT/100

donde T= transmitancia

Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los valores de A con la masa bacteriana.

Comentarios: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño de la partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta pues a longitudes de onda (l ) cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana sólo es válida para >10⁷céls/ml.
C) Nefelómetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está situado en ángulo recto respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparación. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotómetro.

1.2   MEDIDA DEL NÚMERO DE INDIVIDUOS

1.2.1    Métodos directos

1.2.1.1   Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas:

• excavación con 0.02 mm de profundidad;
• área de 1 mm², dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes;
• cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeños.

O sea, la muestra se distribuye en 16X25 = 400 celdillas (cuadros pequeños).

La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el número n de células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la concentración celular es fácil de establecer:

n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.

Ventajas: es un método muy rápido

Inconvenientes: sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x10⁶ céls./ml). Por debajo de este valor el número de células vistas en el campo del microscopio es muy pequeño y poco significativo estadísticamente. En bacterias móviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol y agua.

1.2.1.2  Recuento en preparaciones teñidas: Se dispone de un porta con una excavación circular (de área At) con un volumen conocido (v). Sobre esta excavación se extiende la muestra con asa de siembra o con micropipeta, y se fija y tiñe por algún colorante. Se observa con un microscopio dotado de un juego de ocular y objetivo que delimitan un área de campo (Ac). Si en dicho campo se cuentan n bacterias, la concentración de bacterias por mililitro será:

n·At/Ac· 1/v

1.2.1.3   Recuento proporcional de Wright: Se mezcla la suspensión bacteriana problema con una cantidad conocida de bolitas de látex o de hematíes. La concentración bacteriana se deduce de la proporción de bacterias y partículas observadas en el mismo campo microscópico. Este método se emplea más frecuentemente en Virología.

1.2.1.4   Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se hace pasar una suspensión bacteriana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 m m diámetro) pasa una partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico, que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partícula). Recientemente se ha introducido la citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS). Es una sofisticada modificación en la que las partículas a contar se marcan previamente con un anticuerpo monoclonal u otro ligando específico hacia alguna molécula de superficie, unidos a su vez a un fluorocromo, una molécula que emite fluorescencia al incidir sobre ella un haz de luz láser.

1.2.2    Métodos indirectos:

Son métodos que miden el número de bacterias viables (que no equivale al de totales).

1.2.2.1   Método del número más probable: Su fundamento estriba en la distribución de Poisson: una distribución aleatoria de partículas en una serie de muestras iguales, en función del número medio de partículas presentes en una suspensión.

P_X = m^X · e^-m/x!

donde x = número real de partículas en cada muestra y m = concentración (n^o partículas/volumen)

La técnica consiste en sembrar alícuotas de la suspensión original problema sobre un medio líquido o sólido adecuado; tras el tiempo de incubación adecuado se anota la proporción obtenida de muestras donde no se haya dado crecimiento, P₀ (x = 0). Entonces, según la distribución de Poisson:

P₀= e^--m

y por lo tanto es fácil calcular el valor de m:

m = -lnP₀

1.2.2.2   Recuento de viables en placa: Como esta técnica será explicada al alumno en clase, y además la realizará en las prácticas, remitimos a las pertinentes explicaciones "en vivo". Es una de las técnicas de recuento más usadas en la rutina del laboratorio de Microbiología.

Precauciones:

• para minimizar los errores estadísticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas de cada dilución;
• hay que usar pipetas nuevas en cada dilución;
• contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.

1.2.2.3  Determinación de la proporción células viables/células totales: Si se está interesado en conocer esa proporción se recurre a una técnica de microcultivos en cubreobjetos: hay que seguir periódicamente la evolución del crecimiento de células individuales y determinar la proporción de aquellas células no viables (visibles al microscopio, pero incapaces de crecer).

1.2.2.4  Recuento sobre filtros de nitrocelulosa: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa estéril, que retiene las bacterias. Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro y se cuentan, deduciéndose la concentración original en función del volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.

2. CRECIMIENTO BALANCEADO (= EQUILIBRADO)

Una población de bacterias que se encuentre en un medio adecuado en el que se mantienen constantes todos sus parámetros nutricionales y ambientales, crece de forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, n^o de células, ADN, ARN, proteínas, etc., es un valor constante y similar en cada caso:

D M/M = D N/N = D [ADN]/[ADN] = D [proteínas]/[proteínas] = ... = K

Así pues, durante este crecimiento, de tipo exponencial o logarítmico, el cultivo se comporta como una reacción autocatalítica de primer orden:

velocidad de aumento del componente = K·{cantidad del componente}

También se puede decir que el n^o de células, la masa celular u otros componentes se duplican en un mismo lapso de tiempo determinado.

Este tipo de crecimiento se denomina balanceado o equilibrado. Se caracteriza, pues, por ser el crecimiento en el que

• todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra manera:
• aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo. Este factor es el coeficiente exponencial de crecimiento (m ), que es característico para cada cepa bacteriana en cada medio determinado.

2.1 Expresión matemática del crecimiento balanceado:

Para deducirla vamos a aprovechar la definición empírica anterior, atendiendo por un lado al aumento de la masa celular, y por otro al incremento del número de individuos.

En función del aumento de masa celular:

Podemos decir que

[(dM/M)/dt] = m

por lo tantodM = M·m·dt

Si integramos, resulta:

M/M₀ = em ^(t-t0)

Aplicando logaritmos neperianos:

Tenemos que ln[M/M₀] = m (t-t₀) fórmula{14.1}

De aquí se puede deducir que el coeficiente m es

m = lnM/M₀ /(t-t₀) fórmula{14.2}

En función del aumento del número de células. Supongamos que partimos de una célula. Tras una división (generación celular), tendremos 2, tras dos divisiones tendremos 4, luego 8, etc:

serie geométrica. 1, 2, 2², 2³, 2⁴, ... 2ⁿ (donde n es es número de generaciones transcurridas).

Si en vez de partir de una célula partimos de N₀ células iniciales, la expresión se convierte en:

N = N₀·2ⁿ ; por lo tanto:

N/N₀ = 2ⁿ ; . fórmula {14.3}

Por otro lado, el número de generaciones se puede calcular fácilmente teniendo en cuenta el tiempo transcurrido y conociendo el tiempo medio de generación (g):

Es n = (t-t₀)/g

Sustituyendo esta expresión en la fórmula {14.3} tenemos:

N/N₀ = 2^(t-t0)/g

Apliquemos logaritmos neperianos:

Obtenemos que lnN/N₀ = [(t-t₀)/g ]· ln2 (fórmula 14.4)

Ahora bien, como estamos ante un crecimiento balanceado, las dos expresiones matemáticas {14.1} y {14.4} que hemos deducido (la de la sección A, basada en masa, y la de la sección B, basada en número de individuos) son equivalentes:

Por lo tanto, lnM/M₀ = lnN/lnN₀

m = lnM/M₀ /(t-t₀) = [(t-t₀)/g ]· ln2

m = ln2/g = 0.693/g (expresado en h^--1)

Esta es la expresión matemática del coeficiente del crecimiento balanceado, en función del tiempo medio de generación (g).

En un medio ideal, sin limitación de nutrientes, este coeficiente es m = m _máx, o sea, el máximo valor posible del coeficiente para esa cepa en ese medio. Es decir, es un crecimiento balanceado no restringido.

En un medio donde exista algún nutriente limitante (o sea, cuya concentración está por debajo del límite de eficiencia de las permeasas), el crecimiento balanceado es de tipo restringido, de modo que el coeficiente real de crecimiento es inferior al máximo, según la fórmula empírica siguiente:

m =m _máx [S]/(K_S + [S])

donde [S] es la concentración del nutriente limitante; K_S es la constante de saturación, equivalente a la concentración de nutriente para la que el coeficiente es semimáximo.

Como se puede ver, la tasa de crecimiento (medida por m ) es una función hiperbólica de la concentración del sustratro (nutriente) limitante (ver gráfico). Este sustrato puede ser una fuente de C y/o de energía, fuente de N, de P, un factor de crecimiento, etc.

Ejemplos de K_S:

• la K_S para la glucosa en E. coli es 1·10^-6M
• la K_S para el triptófano en esta bacteria es 2·10^--7 M

Estos bajos valores se deben a la alta afinidad de las permeasas membrana hacia los sustratos, lo cual es una adaptación evolutivamente adquirida de las bacterias a los medios muy diluidos en nutrientes en los que normalmente viven. (Por el contrario, los medios de laboratorio donde se suelen cultivar las bacterias suelen ser más concentrados).

Como veremos en el apartado 4, en la naturaleza, y en los sistemas de cultivo cerrados que habitualmente se emplean en laboratorio, tarde o temprano el crecimiento balanceado suele terminar, debido a que se agotan los nutrientes o se acumulan sustancias de desecho.

3. CULTIVO CONTINUO

Es un cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema de flujo que se compone de:

• una cámara de cultivo de volumen constante,
• a la que llega un suministro de nutrientes,
• y de la que se eliminan o separan los productos tóxicos de desecho (por un dispositivo de rebosadero).

Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el número de células y la concentración de nutrientes en la cámara permanecen constantes, y entonces se dice que el sistema está en estado estacionario, con las células creciendo exponencialmente.

Los parámetros a tener en cuenta son:

• flujo (f), medido en ml/h
• volumen de la cámara de cultivo (v, en ml)
• densidad celular en la cámara (x)
• factor de dilución D = f/v (en h^--1). El inverso de este factor de dilución es el tiempo medio de residencia (1/D= TMR)

Existe una pérdida de células por el rebosadero: -dx/dt = x·D

El crecimiento bruto es dx/dt = x·m

Por lo tanto, el crecimiento neto es dx/dt = x·m - x·D = x·(m - D)

Si logramos que el coeficiente de crecimiento (m ) se haga igual al factor de dilución (D), entonces dx/dt = 0, y por lo tanto la concentración de células se hace constante (x= x). El cultivo se encuentra entonces en estado dinámico de equilibrio. Las pérdidas de células por drenaje se compensan con las ganancias por crecimiento.

Existen dos tipos de procedimientos para obtener cultivos continuos:

• de control interno: turbidostato;
• de control externo: quimiostato.

3.1 Turbidostato

Permite cultivos continuos con un coeficiente m cercano al m _máx, trabajando a valores altos de D. Ello lo logra ajustando los valores de densidad celular de modo que ningún factor nutricional se haga limitante.

Se dice que es un sistema de control interno porque es la misma concentración de bacterias la que regula el flujo de entrada y de salida (por medio de un mecanismo electrónico basado en la medición y control de la densidad óptica del cultivo).

Para el mecanismo de su funcionamiento, por favor atender la explicación en clase y consultar el esquema suministrado en la Fig.

Inconvenientes:

• es difícil de manejar y ajustar;
• si las bacterias tienen tendencia a adherirse a superficies (paredes internas del aparato), los resultados de medida de la D.O. quedan falseados (infravalorados).

Aplicaciones: se emplea bastante en el estudio de los factores que incrementan o disminuyen la tasa de crecimiento.

3.2 Quimiostato

Para introducirnos al funcionamiento del quimiostato, partamos de la observación de lo que pasaría en el turbidostato si desconectamos el fotómetro y ajustamos la bomba 1 para que vierta medio fresco al cultivo a una tasa (flujo) menor que el que mantiene la m cercana a la m _máx:

las bacterias tenderían a crecer a mayor velocidad que su dilución debida a adición de medio fresco; por lo tanto, en un principio aumentaría la concentración de bacterias.

Pero este incremento no podría continuar indefinidamente. Pero el crecimiento tampoco se detendría. De hecho, tras un cierto tiempo, el cultivo alcanzaría un nuevo estado estacionario de equilibrio, en el que la tasa de crecimiento se hace proporcional a la tasa de adición de medio fresco. En este caso, el cultivo crece exponencialmente, pero a tasas m <m _máx. Sigue creciendo exponencialmente porque la tasa de dilución del cultivo es una función exponencial del tiempo.

La m submáxima viene determinada en el quimiostato por la tasa de dilución (D). La cinética sigue siendo exponencial, ya que en el nuevo estado estacionario de equilibrio la tasa de crecimiento compensa a la tasa de dilución, que como sabemos, es una función exponencial.

Ventajas del quimiostato en comparación con el turbidostato:

En un quimiostato, los microorganismos pueden cultivarse a una amplia variedad de tasas de crecimiento exponencial, mientras que, como vimos, en el turbidostato se cultivan en un rango estrecho de valores de m cercanos al m _máx.

El quimiostato permite crecimientos balanceados restringidos debido a que existe un nutriente o sustrato presente en una concentración suficientemente baja como para limitar la densidad de población.

S_R es la concentración de nutriente en el reservorio, y determina el valor de S, que es la concentración de nutriente limitante en el recipiente de cultivo.

La tasa de adición de ese sustrato determina la tasa de crecimiento.

Así pues, el quimiostato también permite elegir la densidad de células a la que se quiere trabajar.

Expresión matemática del quimiostato:

x = concentración celular en equilibrio

Y = constante de rendimiento en el medio empleado (masa de microorganismo formada/masa de sustrato consumida)

S_R= concentración del sustrato limitante en el reservorio

D = factor de dilución

K_S= constante de saturación respecto del sustrato limitante

La fórmula nos dice que sabiendo Y, K_S y m _máx se puede fijar la densidad celular (x) simplemente ajustando dos parámetros del aparato:

S_R (concentración del sustrato o nutriente limitante en el reservorio)

D (coeficiente de dilución, regulable por el flujo)

Por otro lado, se puede demostrar también que la concentración de sustrato limitante en equilibrio en la cámara de cultivo es:

S= K_S·D/(m _máx- D)

Esta fórmula nos dice que el efecto principal de cambiar el flujo (D) es alterar la concentración S de sustrato limitante en el cultivo, lo que a su vez afecta a la tasa específica de crecimiento (m ).

Véase la gráfica compleja en el esquema, bajo el dibujo del quimiostato. Algunos comentarios (atiéndase la explicación del profesor):

La densidad del cultivo es muy similar en un amplio margen de tasas de dilución (D). Este margen es el más adecuado para hacer estudios en el quimiostato. En cambio, el valor de tiempo de generación (g) varía ampliamente. O sea, el quimiostato puede obtener tasas de crecimiento muy diferentes, sin que se afecte la densidad celular.

En cambio, a altas tasas de dilución la concentración microbiana cambia rápidamente, y en un margen estrecho el cultivo puede drenarse totalmente (D_C: dilución crítica).

A muy bajas diluciones (D_M) el quimiostato no funciona si el nutriente limitante es la fuente de energía. Ello se debe a que en esas condiciones, la fuente de energía sólo se usa para reacciones de mantenimiento de la integridad celular, pero no queda para el crecimiento. A este valor lo llamamosenergía de mantenimiento. Los procesos relacionados con esta energía de mantenimiento son el potencial de membrana, el transporte de solutos y la renovación de proteínas.

Aplicaciones del cultivo continuo en quimiostato:

Aportan una fuente continua de células en fase exponencial, lo que se aplica a procesos industriales de fermentación (producción de bebidas alcohólicas, de antibióticos, de aminoácidos, etc).

En el quimiostato, el crecimiento a bajas concentraciones de sustrato permite estudiar:

• aspectos fisiológicos (por ejemplo, catabolismo del sustrato limitante);
• selección de mutantes
• estudios ecológicos.

4. CULTIVO EN SISTEMAS CERRADOS

En los sistemas cerrados (que pueden ser líquidos o sólidos), no existe aporte continuo de nutrientes, ni drenaje de células ni de sustancias de desecho.

En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura sólo unas cuantas generaciones, debido al agotamiento de nutrientes y/o a la acumulación de desechos.

NOTA:En la naturaleza no es normal ver crecimientos balanceados indefinidos. Hágase el alumno una idea de lo que es el crecimiento exponencial indefinido de una bacteria a través de los siguientes datos: si una sola bacteria (que pesa 10^--12 gramos) pudiera crecer sin restricción, con un tiempo de generación de 20 minutos, al cabo de 48 horas la población derivada pesaría nada menos que 2,2 ·10³¹ gramos, equivalente a 4000 veces el peso de nuestro planeta.

4.1 CURVA DE CRECIMIENTO EN UN SISTEMA CERRADO EN MEDIO LÍQUIDO

El crecimiento en un sistema cerrado consta de varias fases, que pasamos a comentar:

Fase de retardo (fase "lag"): Es el período de tiempo durante el que el inóculo se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Se trata de un período de ajuste metabólico. Su duración depende de varios factores:

tamaño del inóculo;

bondad del inóculo (estado metabólico previo del inóculo):

si el inóculo procede de células en fase estacionaria de un cultivo anterior, la fase lag es larga. Ello se debe a que los contenidos en coenzimas y otros constituyentes de las células son bajos, y las células deben reponerlos en el medio fresco.
si las células están dañadas por algún agente, el lag también es largo, ya que necesitan un tiempo para la reparación de los daños.
si las células del inóculo se tomaron de un cultivo previo en fase logarítmica, el lag es más corto.

medio del que procede el inóculo:

si el medio es similar al medio fresco, el lag es más corto;
si el medio del inóculo era un medio rico y el medio fresco es más pobre, la fase de retardo se hace más larga, porque las bacterias necesitan un tiempo adicional para activar la síntesis de las enzimas biosintéticas que estaban reprimidas en el medio rico.

Pero aun cuando la inoculación se hace desde un cultivo previo en fase logarítmica, cuyo medio sea idéntico al medio fresco, se observa siempre una fase lag. )Por qué?:

• necesidad de neutralizar sustancias tóxicas en el medio fresco;
• porque se produce dilución de ciertos metabolitos intracelulares al inocular las bacterias en el medio nuevo; por lo tanto, hasta que no se vuelva a alcanzar una concentración de esos metabolitos adecuada para el crecimiento, éste no "arranca".

Ejemplo: Supongamos que inoculamos una bacteria heterotrófica en un medio ligeramente ácido, sometido a aireación: en un principio, se produce dilución de CO₂, por lo que se retardan reacciones de carboxilación que requieren este CO₂, y se produce un retardo.

Fase de transición, de crecimiento acelerado, que conduce a ...

Fase de crecimiento exponencial (= fase logarítmica). La fase 2 se debe a que cada célula entra en la fase exponencial con desfase respecto de sus compañeras. Ello demuestra que las células del inóculo no están todas en las mismas condiciones fisiológicas.

Durante la fase logarítmica se da un crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de generación (g) es característico para cada especie o cepa, en cada medio concreto:

El valor del tiempo de generación (g) depende de:

• composición del medio
• temperatura
• pH
• osmolaridad (tonicidad), etc.

Los microorganismos heterotrofos suelen crecer más rápidamente en los medios complejos, ricos, que en los medios sintéticos, y dentro de estos últimos, mejor con glucosa que con otras fuentes de carbono.

Fase de aceleración negativa, de crecimiento desequilibrado, que conduce a...

Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento se hace nulo(m = 0), pero aún existe crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes celulares.

En este período se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho. Incluso el pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el crecimiento celular.

Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transición (de aceleración negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes alternativas (p. ej., puede recurrir a aminoácidos como fuente de C una vez agotados los hidratos de carbono).

En la fase estacionaria aún existen reacciones metabólicas, pero el metabolismo general es diferente al de la fase logarítmica:

• las células son más pequeñas, debido a que existe división celular después de que se haya detenido el incremento de masa;
• el citoplasma se condensa;
• en las bacterias Gram-negativas aumenta el volumen relativo del periplasma;
• el nucleoide se condensa, por sustitución de ciertas proteínas que se unen a ADN;
• la membrana citoplásmica se hace menos fluida;
• suelen ser más resistentes a agentes físicos (temperatura, estrés osmótico) y químicos;
• existe un cambio en el patrón de expresión genética: se desconectan cientos de genes que habían estado expresándose durante la fase exponencial, mientras que se activan unos 50-100 genes que antes estaban reprimidos (genes de fase estacionaria); estos genes se transcriben mediante la holoenzima de la ARN-polimerasa dotada de la subunidad s³⁸ (=s^S).
• existe reciclado de ciertos materiales intracelulares;
• baja el contenido en ARN.

Fase de transición hacia ...

Fase de muerte exponencial: Se da muerte y lisis masiva, exponencial, del cultivo. Se debe aagotamiento de reservas de energía. Algunas veces las células aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas (formas "fantasmas", "ghost"). La pendiente de esta parte de la curva depende de las especies (por ejemplo, en bacterias entéricas es suave, mientras que en Bacillus es más acentuada).

4.2 CRECIMIENTO DIÁUXICO

Supongamos que inoculamos una bacteria en un medio líquido provisto de dos fuentes de carbono (p. ej., glucosa y lactosa), de las cuales una (en este ejemplo, la glucosa) es usada preferencialmente. Si representamos la cinética del crecimiento poblacional según hemos aprendido en el apartado anterior, obtenemos una curva como la de la figura siguiente:

Obsérvese que se dan dos fases de crecimiento exponencial separadas por una breve fase intermedia estacionaria. Esta modalidad de crecimiento con dos fases exponenciales se conoce con el nombre de crecimiento diáuxico.

Bases del crecimiento diáuxico:

La bacteria usa en primer lugar sólo la fuente preferencial de C (en este caso, la glucosa, que suele ser la fuente preferencial en muchos heterotrofos), sin "tocar" la otra fuente. Una vez que agota la primera fuente, se dispone a usar la segunda (ej.: lactosa), pero tarda un tiempo hasta que sintetiza los enzimas catabólicos necesarios para degradar esa segunda fuente. Cuando las bacterias han logrado niveles de esos enzimas adecuados, se restablece el crecimiento exponencial, aunque, como se puede constatar en el gráfico, con una pendiente menor (lo que significa que esta fuente alternativa permite una tasa m menor que la preferencial).

Pero esta explicación aún es "superficial": nos queda por estudiar su base genética y molecular, que postergaremos hasta el capítulo primero de la sección de Genética bacteriana.

4.3 CRECIMIENTO EN SISTEMAS CERRADOS EN MEDIOS SÓLIDOS

Un medio sólido es una solución nutritiva (como el líquido), pero incorporado a un gel, que le da consistencia.

Los tipos de gelificantes usados para los medios sólidos:

• agar-agar (o simplemente, agar): es el más comúnmente empleado;
• gelatina (inconveniente de que se licúa a temperaturas relativamente bajas);
• silicagel (o gel de sílice): tedioso de preparar. Uso casi exclusivo para quimioautotrofos.

Los medios sólidos se suelen inocular mediante asa de siembra o espátula, diseminando las bacterias sobre su superficie libre, en recipientes adecuados, como las placas de Petri (ver prácticas). Tras la incubación a la temperatura y condiciones pertinentes, cada bacteria o agrupación bacteriana que ha quedado en un punto determinado del medio da origen, por crecimiento, a una acumulación de células, visible a simple vista, denominada colonia.

La densidad de cada colonia es muy alta (del orden de 10⁷ células para una colonia de unos 5 mm). Esto se debe a que en el medio sólido, a diferencia del líquido, las bacterias no pueden dispersarse, y durante mucho tiempo este medio sólido permite un aporte continuo de nutrientes (por difusión desde el entorno de la colonia, hacia ella), y eliminación continua de productos de desecho (por difusión desde la colonia hacia fuera). Por lo tanto, se parece a un cultivo continuo, excepto que no hay drenaje de células.

Como el alumno comprobará en prácticas, cada especie bacteriana suele originar colonias de un tipo determinado, en cada medio concreto. Con vistas a la determinación taxonómica, se suele tomar nota de una serie de características de las colonias (caracteres culturales):

• tamaño (relativo)
• forma general
• forma de los bordes de la colonia
• aspecto de la superficie y elevación sobre el sustrato
• color
• consistencia, etc.

METABOLISMO ENERGÉTICO

NOCIONES GENERALES SOBRE EL METABOLISMO ENERGÉTICO BACTERIANO

Las bacterias requieren aporte continuo y de acceso inmediato de energía, que es usada en procesos de:

• biosíntesis (anabolismo)
• transporte activo
• translocación de proteínas a través de la membrana citoplásmica
• movimiento flagelar
• bioluminiscencia

En bacterias, al igual que en eucariotas, la conservación intracelular de energía ocurre principalmente por medio de la síntesis de ATP:

ADP^3- + H⁺ + PO₄H^2- --------> ATP^4- + H₂O

La hidrólisis de ATP hasta ADP y P genera una variación de energía libre DG^o'= -31 kJ (= -7,3 kcal). La síntesis de ATP a partir de ADP y P requiere una DG_o' de +31 kJ. Los métodos usados por las bacterias para generar este ATP son principalmente:

• fosforilación a nivel de sustrato;
• fosforilación oxidativa;
• fotofosforilación (durante la fotosíntesis).

Cada uno de estos procesos implica uno o varios pasos de reacciones redox exergónicas, pero la manera en que esas reacciones exergónicas se acoplan a la síntesis de ATP varía entre la fosforilación a nivel de sustrato y las otras dos.

En esta reacción se libera energía libre, cuyo valor viene expresado por la fórmula:

DG⁰'= - n·F·DE₀'

n = nº de electrones transferidos

F = constante de Faraday = 96,6 kJ·volt^-1·equivalentes^--1

D E₀' es la diferencia entre los potenciales de reducción del donador (pareja D/DH₂) y del aceptor (pareja A/AH₂).

Una reacción redox exergónica de este tipo se puede acoplar a la consecución de trabajo útil:

• formación de un compuesto rico en energía;
• formación de un gradiente de concentración y/o de carga eléctrica a ambos lados de una membrana.

Ambos tipos de trabajo se pueden usar en la síntesis de ATP.

Por lo tanto, los seres vivos, para poder obtener su moneda energética (principalmente ATP), han de captar alguna fuente de energía externa, del medio ambiente. Veamos, pues, cuáles son los tipos de energía que captan las bacterias y los correspondientes tipos de metabolismos energéticos:

1. Si la energía procede de radiaciones (en los cuantos de una determinada longitud de onda de la luz visible): bacterias fototrofas, que a su vez pueden ser:
1. fotolitotrofas: captan energía lumínica en presencia de sustancias inorgánicas;
2. fotoorganotrofasotoorganotrofas: captan energía lumínica con requerimiento de sustancias orgánicas.
2. Si la energía se desprende a partir de moléculas químicas en reacciones biológicas de óxido-reducción: bacterias quimiotrofas, que a su vez pueden ser:
1. quimiolitotrofas:: captación de energía química a partir de sustancias inorgánicas;
2. quimiorganotrofas: captación de energía química a partir de sustancias orgánicas.

Veamos ahora lo que diferencia a grandes rasgos a la fosforilación a nivel de sustrato respecto de la fosforilación oxidativa y la fotofosforilación:

A) La fosforilación a nivel de sustrato es un sistema usado por ciertas bacterias quimiorganotrofas. El sustrato orgánico (donador de electrones) es oxidado por un coenzima (p. ej., NAD⁺), de manera que se origina un intermediario no fosforilado con una gran energía de hidrólisis. Dicho intermediario experimenta una sustitución con un fosfato, para dar la correspondiente forma acil-fosfato (siendo este enlace de alta energía). Finalmente, este acil-fosfato dona su fosfato de alta energía al ADP, que pasa a ATP.

Las fosforilaciones a nivel de sustrato se caracterizan por lo siguiente:

• son procesos escalares (es decir, no influye su situación espacial dentro de la célula);
• son series de reacciones bioquímicas en las que la transferencia de un grupo químico (ej., el fosfato) se cataliza por enzimas solubles (en el citoplasma);
• existen intermediarios metabólicos (antes de llegar al ATP) en los que el fosfato está unidocovalentemente.

B) En cambio, tanto la fosforilación oxidativa como la fotofosforilación son procesos caracterizados por:

• ser vectoriales (orientados en el espacio);
• estar ligados a membrana;
• implicar una secuencia ordenada de transportadores de electrones que sufren oxidaciones y reducciones reversibles (cadena transportadora de electrones, c.t.e.).
• no hay intermediarios covalentes ricos en energía, sino que la transferencia de energía se realiza por medio de un gradiente electroquímico de protones (y, en algunos casos, de cationes). Este gradiente de protones se puede emplear a su vez para:
• síntesis de ATP,
•  
• transporte de nutrientes,
• translocación de proteínas fuera del protoplasto,
• movimiento flagelar.

2. CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN LAS BACTERIAS QUIMIOTROFAS

En los organismos quimiotrofos, la captación de energía consiste esencialmente en la oxidación de un sustrato reducido (orgánico en quimiorganotrofos e inorgánico en quimiolitotrofos) con una redución concomitante de un aceptor de electrones (que a su vez puede ser orgánico o inorgánico), y todo ello acoplado a un sistema de fosforilación del ADP, que se convierte en ATP.

2.1 FOSFORILACIÓN A NIVEL DE SUSTRATO. FERMENTACIONES

Recordemos aquí lo dicho anteriormente: La fosforilación a nivel de sustrato es un sistema usado por ciertas bacterias quimiorganotrofas. El sustrato orgánico (donador de electrones) es oxidado por un coenzima (p. ej., NAD⁺), de manera que se origina un intermediario no fosforilado con una gran energía de hidrólisis. Dicho intermediario experimenta una sustitución con un fosfato, para dar la correspondiente forma acil-fosfato (siendo este enlace de alta energía). Finalmente, este acil-fosfato dona su fosfato de alta energía al ADP, que pasa a ATP.

gliceraldehido-3-P-->1,3-difosfoglicérico -->3-fosfoglicérico

La fosforilación a nivel de sustrato está acoplada a un proceso metabólico denominadofermentación. Durante la fermentación, el sustrato orgánico reducido (DH₂) es catabolizado, de modo que como acabamos de ver, se produce ATP. Este catabolismo genera, además:

• equivalentes de reducción (en forma de NADH y otros cofactores reducidos), e
• intermediarios oxidados de la ruta catabólica.

Pues bien, es característico de las fermentaciones que los equivalentes de reducción reaccionen con uno de esos intermediarios (A), que de este modo se reduce a AH₂ (producto de la fermentación), regenerándose el cofactor en forma oxidada (NAD⁺) para el siguiente ciclo.

El rendimiento de las fermentaciones, expresado como variación de energía libre, es bajo. En la fermentación homoláctica se producen 2 moles de ATP por cada mol de glucosa consumido (frente a los 28 moles de ATP/mol de glucosa en la respiración aerobia). Esto significa que para que el microorganismo crezca en estas condiciones, degrada grandes cantidades de sustrato fermentable.

Las fermentaciones se dan en determinados microorganismos quimiorganotrofos, que pueden ser anaerobios obligados o anaerobios facultativos (cuando crecen en ausencia de O₂).

Hay una gran variedad de fermentaciones microbianas, y cada tipo libera uno o varios productos de fermentación característicos. Algunos ejemplos:

Fermentación láctica	Lactato
Fermentación alcohólica	etanol, CO2
Fermentación ácida-mixta	etanol, succinato, acetato, formiato, lactato, CO2, H2
Fermentación butilénglicólica	butilénglicol, CO2
Fermentación aceto-butírica	acetato, acetona, butirato, butanol, etanol, CO2, H2

2.2 FOSFORILACIÓN OXIDATIVA. RESPIRACIONES

Respiración es la obtención de energía por oxidación de sustratos orgánicos (en quimiorganotrofas) o inorgánicos (quimiolitotrofas), pero los coenzimas reducidos (ej., NADH) transfieren los electrones a un aceptor final oxidado, no directamente (como en la fermentación), sino a través de una cadena transportadora de electrones.

• Si el aceptor final es el O₂, hablamos de respiración aerobia;
• Si el aceptor final es distinto del O₂ (nitrato, sulfato, etc.), respiración anaerobia.

En ambos casos, la transferencia se da ordenadamente, en la dirección de mayor potencial redox positivo, con la consiguiente liberación de energía libre. Como veremos enseguida, esta energía libre se va a traducir en un potencial electroquímico de protones, cuya disipación a través de ATP-asas de membrana origina ATP, conociéndose este proceso como fosforilación oxidativa.

Esquema y balance de la fosforilación oxidativa

Como el alumno seguramente sabrá, el mecanismo de la fosforilación oxidativa se suele explicar en base a la teoría quimiosmótica de Mitchell (1961 y años siguientes).

Recordemos que la c.t.e. está formada por una serie ordenada de moléculas transportadoras situadas (en bacterias) en la membrana citoplásmica (y en sus invaginaciones), moléculas que sufren oxidaciones y reducciones reversibles:

DH₂ + A ---------> AH₂ + D

El alumno conocerá por la asignatura de Bioquímica los principales tipos de componentes de las c.t.e. respiratorias

• flavoproteínas (Fp), dotadas de grupos FAD o FMN
• proteínas no hémicas de Fe-S
• quinonas:
• ubiquinona (UQ)
• menaquinona (MQ), más frecuente en bacterias Gram-positivas.
• citocromos (proteínas hémicas con Fe quelado).

Observar que algunos de estos transportadores transportan átomos de H (o sea, protones y electrones), mientras que otros transportan únicamente electrones.

La situación de los transportadores dentro de la membrana es asimétrica, lo que condiciona que el transporte sea un proceso vectorial (es decir, tiene un sentido determinado), de modo que los H salen hacia afuera y los electrones tienden a entrar al interior.

Como resultado de todo ello, tenemos que existen determinados puntos de la c.t.e. (llamados bucles o lazos translocadores de protones) en los que el efecto neto es la salida de protones al exterior de la membrana citoplásmica (concretamente, en los puntos donde confluyen un transportador de H y otro de electrones). Es decir, existe una translocación de protones hacia el exterior ligada a las reacciones redox que ocurren en la c.t.e.

Por otro lado, la membrana es impermeable a los protones, por lo que los protones translocados a resultas del funcionamiento de las c.t.e. no pueden entrar directamente. Por lo tanto, se crea un gradiente electroquímico de protones, compuesto de gradiente osmótico de esos iones H⁺ (DpH) y un gradiente de carga eléctrica (Dy ). Este gradiente es una forma de energía potencial que puede realizar trabajo.

El valor de este gradiente electroquímico de protones o fuerza protón motriz (f.p.m.) es:

Dp = D y -Z·DH (expresado en milivoltios, mV),

donde Z = 2,3 R·T/F, siendo R= constante de los gases, T= temperatura absoluta, F= constante de Faraday

Como ya dijimos, esta Dp (f.p.m.) es capaz de realizar trabajo, bajo la forma de:

• transporte activo (véase el capítulo 7)
• alimentar el motor flagelar (capítulo 11)
• síntesis de ATP.

Veamos, pues, cómo se produce esta síntesis de ATP a partir del gradiente de protones:

• La síntesis de ATP ocurre gracias al complejo ATP-asa, funcionando como ATP-sintetasa. Este complejo consta de varios polipéptidos que conforman dos porciones: la hidrofóbica BF₀, inserta en la membrana citoplásmica, y la BF₁ a modo de tallo que se proyecta hacia el interior celular.
• La porción BF₀ forma un canal a través de la membrana, por donde pueden pasar H⁺ desde el exterior al interior, y agua desde dentro hacia afuera.
• La porción BF₁ es la parte enzimáticamente activa del complejo.

Esencialmente, el mecanismo consiste en que la disipación del gradiente de protones a través de BF₀suministra la energía para la síntesis de ATP por parte de la BF₁. La reacción se puede expresar así:

2H⁺ (ext) + ADP (int) + P (int) -------> 2H⁺ (int) + ATP (int) + H₂O (ext)

El balance final del funcionamiento de la c.t.e. es:

DH₂(int) + A(int) + ADP(int) + P(int) à D(int) + AH₂ + ATP(int) + H₂O (ext)

El esquema anterior hace referencia al funcionamiento de una cadena transportadora con un solo bucle translocador de protones. Pero en la realidad las c.t.e. suelen poseer más de uno de estos bucles.

• Véase en la Fig. la c.t.e. de Paracoccus, una bacteria que posee un sistema similar al de las mitocondrias, donde se observan 3 sitios donde termodinámicamente la variación de energía libre es suficiente para apoyar la síntesis de una molécula de ATP.
• Véase también la c.t.e. de E. coli, cuando usa el O₂ como aceptor final de electrones. En esta cadena podemos constatar algo relativamente frecuente en las cadenas bacterianas:

En los quimiolitotrofos, la c.t.e. respiratoria funciona en los dos sentidos:

• en su sentido "normal", ya estudiado. Un donador inorgánico de electrones cede electrones, que llegan a la c.t.e., que crea un gradiente de protones, cuya disipación a través de ATP-asa genera ATP;
• pero estas bacterias necesitan equivalentes de reducción (NADPH) para reducir el CO₂ (su fuente exclusiva de C) hasta material orgánico celular [CH₂O]. Este NADPH lo logran merced a un flujo invertido de electrones a través de la c.t.e., usando para ello como energía parte del potencial de protones generado por el flujo normal.

Cadenas de electrones ramificadas:

Muchas cadenas respiratorias aerobias muestran ramificaciones alternativas, sobre todo a nivel de los citocromos terminales. El papel principal de estas ramificaciones es lograr flexibilidad en la ruta de transferencia de electrones, de manera que se obtengan rendimientos máximos en ciertos sustratos y condiciones de crecimiento, y para minimizar los efectos nocivos de otros.

• Por ejemplo, cuando Azotobacter (fijador aerobio de N₂) crece fijando nitrógeno, usa una ramificación que gasta muchísimo oxígeno como aceptor final (aunque el rendimiento en ATP es menor); con ello logra evitar que entre oxígeno al citoplasma, con lo que protege a la nitrogenasa de la inactivación por oxígeno.

Mecanismo de la ATP-sintasa dependiente de protones

En los años recientes se está avanzando en el mecanismo de la ATP-sintasa (con concesión de premio Nobel de Química 1997 a tres biólogos que han contribuido en este aspecto):

• F₀ es un complejo integral de membrana, que trasloca los protones. Está compuesto de {a, b₂, c₁₀}. F₁ constituye la porción intracitoplasmática, dotada de los sitios catalíticos. Su composición se puede expresar como {a₃, b₃, g, d, e). Ambas porciones están unidas entre sí por enlaces iónicos e hidrófobos.
• Al parecer, la traslocación de unos 4 protones a través de F₀ está acoplada, por medio de grandes cambios conformacionales, a la síntesis de una molécula de ATP en las subunidades bde la F₁, por un notable mecanismo de catálisis rotacional:
• El que los 4 protones entren por F₀ parece que induce un cambio conformacional en la subunidad g de F₁, que a su vez obliga a girar al F₁, con una síntesis de ATP.

Las ATP-asas de membrana pueden funcionar también en sentido inverso al de síntesis, es decir, como ATP-hidrolasas: se produce hidrólisis de ATP y extrusión de protones al exterior. Por lo tanto, en este sentido de funcionamiento, se genera un gradiente de protones a expensas de gasto de ATP intracelular. Esto muestra una vez más que el ATP y el gradiente de protones se pueden considerar como formas diferentes e interconvertibles de energía celular.

Las ATP-asas productoras de gradientes de protones existen en bacterias no respiratorias, que carecen de c.t.e., como por ejemplo, las bacterias anaerobias del ácido láctico. Estas bacterias obtienen su ATP por fosforilación a nivel de sustrato, en sus procesos de fermentación, y a su vez, parte del ATP lo convierten, por las ATP-asas hidrolíticas, en una fuerza protón-motriz que se usa para transporte de nutrientes y para alimentar al motor flagelar.

Respiraciones anaeróbicas

Como ya hemos dicho, en algunas bacterias, al final de la c.t.e. puede existir un aceptor diferente del oxígeno (respiración anaerobia). Los aceptores y sus respectivos productos reducidos (A à AH₂) son:

• NO₃^-- à N₂
• SO₄^2- à SH₂
• fumarato à succinato
• CO₂ à CH₄
• Fe³⁺ à Fe²⁺

Con estos aceptores se obtiene menos energía que con el oxígeno, porque la pareja O₂/H₂O es más oxidante que las otras.

El uso de nitratos, sulfatos y CO₂ como aceptores finales de electrones (y no como material a incorporar al metabolismo plástico) se denomina metabolismo disimilativo(o desasimilativo). para distinguirlo del asimilativo. El producto reducido se excreta al ambiente de la bacteria.

El uso disimilativo de nitrato se llama desnitrificación, y ocurre por medio de una serie de fases donde el N va cambiando su estado de oxidación:

NO₃^-- à NO₂^- (nitrito) à NO (óxido nítrico) à N₂O (óx. nitroso) à N₂ (dinitrógeno)

Hasta la llegada de las actividades industriales humanas, todo el dinitrógeno de la atmósfera procedía de estos proceso desnitrificantes.

El uso de sulfato como aceptor de electrones sólo lo hacen las bacterias sulfatorredutoras, por una ruta especial en la que el sulfato primero tiene que activarse con ATP (formando la adenosina-fosfo-sulfato, APS). La mayoría son quimiorganotrofos, pero algunos pueden usar H₂ donador de electrones (quimiolitotrofos).

Las arqueobacterias metanogénicas son los únicos seres vivos capaces de obtener energía acoplando la oxidación del hidrógeno molecular con el uso de CO₂ como aceptor de electrones (actuando en estas condiciones como quimiolitotrofos):

4H₂ + CO₂ à CH₄ + 2H₂O

Tipos de quimiolitotrofos

Insistamos en el hecho de que la capacidad de obtener energía por fosforilación oxidativa a partir de donadores inorgánicos de electrones sólo ha evolucionado en ciertos grupos de procariotas. Cada grupo fisiológico usa un tipo de donador inorgánico:

• bacterias de hidrógeno (H₂)
• bacterias del hierro (Fe²⁺)
• bacterias del azufre (S^2-, S⁰).
• bacterias nitrificantes, con dos subtipos diferentes: las oxidadoras de amoniaco (llamadas nitrosas) y las oxidadoras del nitrito (llamadas nítricas).

En general, el mecanismo de generación de ATP es similar al de quimioorganotrofas respiradoras. los electrones extraídos del donador exógeno (en este caso inorgánico) pasan a una cadena transportadora de electrones hasta un aceptor final, que suele ser el oxígeno.

Pero a excepción del H₂, los demás donadores inorgánicos de electrones tienen un potencial de oxidación E₀^' menor que el del NADH, por lo que la oxidación de estos donadores inorgánicos sólo puede generar energía, pero no poder reductor de modo directo. Para obtenr poder reductor emplean transporte inverso de electrones: parte del gradiente electroquímico creado se emplea en hacer que electrones viajen por la c.t.e. (o una parte de ella) en sentido inverso, para poder reducir el NAD.

3. CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN LAS BACTERIAS FOTOTROFAS: FOTOFOSFORILACIÓN

Los organismos fotosintéticos usan energía de la luz para convertir el CO₂ en material celular, según la fórmula general:

energía de la luz (hn )

2 H₂A + CO₂--------------------------------------->[CH₂O] + H₂O + 2 A

• En Oxifotobacterias, algas y plantas verdes, H₂A = H₂O, como agente reductor. Por lo tanto, al oxidarse se genera O₂.
• En Anoxifotobacterias el reductor exógeno ("H₂A") puede ser H₂, S⁼, S₂O₃^-, etc.

Tenemos, pues, dos modalidades de fotosíntesis, la oxigénica y la anoxigénica. Como veremos, en ambas pueden existir dos versiones de un mecanismo de obtención de energía a partir de la luz visible: fotofosforilación cíclica y acíclica.

En la fotofosforilación cíclica (FFC) no existe aporte de un agente reductor externo ni de agente oxidante externo.

• Su única función es transformar la energía de la luz en un gradiente de protones (f.p.m.), que a su vez puede convertirse en ATP.
• No se originan equivalentes de reducción (NADPH), y por lo tanto, no hay fijación de CO₂.

En cambio, en la fotofosforilación acíclica (FFA) un donador exógeno de electrones (H₂A) servirá para que, por acción de la luz, se produzcan equivalentes de reducción (NADPH, o NADH), que a su vez se usarán para la reducción (asimilación) de CO₂ hasta materia orgánica. Al igual que en la cíclica, se produce gradiente de protones, convertible en ATP.

3.1 COMPONENTES DEL APARATO FOTOSINTÉTICO

• Fotosistemas: Catalizan la conversión de la energía de la luz, capturada en moléculas excitadas de clorofila o bacterioclorofila en una forma útil de energía. Están constituidos por complejo antena y centro de reacción.
• Cadenas transportadoras de electrones: Estas cadenas están ligadas de forma estrecha al centro de reacción, y crean una f.p.m.

Antes de describir el funcionamiento del aparato fotosintético, describamos brevemente las principales moléculas implicadas:

A) Clorofilas y bacterioclorofilas. Estos tetrapirroles cíclicos quelados con Mg⁺⁺ pueden formar parte tanto de los pigmentos antena como de los centros de reacción.

Las clorofilas del centro de reacción son mucho menos abundantes que las del complejo antena. Típicamente son 4 moléculas, de las cuales dos están asociadas a proteínas, de modo que en este estado actúan como "trampas" para los cuantos de luz. Como veremos, estas clorofilas especiales, tras excitarse, se oxidan, por lo que se denominan clorofilas fotoactivas. La luz convierte a estas clorofilas desde su estado basal a su estado excitado, en el que tienen un E₀^' negativo, por lo que entonces pueden ceder electrones (oxidarse) fácilmente.

B) Carotenoides. Forman parte del complejo antena. Sus funciones son:

• protección contra los efectos potencialmente perjudiciales derivados de la interacción entre la luz y el oxígeno;
• como pigmentos antena, captadores de luz (aunque menos eficientes que otros).

C) En las Oxifotobacterias, existe, además un conjunto de ficobiliproteínas, organizadas en complejos supramoleculares denominados ficobilisomas, dispuestos (como ya vimos en el tema 8) en la superficie de los tilacoides.

Las principales ficobiliproteínas son ficocianina, ficoeritrina y aloficocianina, y constituyen el complejo antena en las Cianobacterias.

D) Feofitinas y bacteriofeofitinas. Son similares a las respectivas (bacterio)clorofilas, excepto queno están queladas con Mg⁺⁺. Actúan como aceptores inmediatos del electrón que pierde cada (bacterio)clorofila del centro de reacción.

E) Otros componentes. En el mismo centro de reacción se encuentran los primeros componentes de la c.t.e. fotosintética: quinonas especiales acomplejadas con Fe. Por lo demás, las c.t.e. fotosintéticas contienen moléculas de tipos parecidos a las ya estudiadas en las c.t.e. respiratorias: quinonas, citocromos y ferroproteínas no hémicas.

3.2 FUNCIONAMIENTO DE UN FOTOSISTEMA

Para estudiar el funcionamiento, hagámonos una idea de cómo están organizados los principales componentes que acabamos de citar dentro del aparato fotosintético:

Complejo antena

Es un conjunto de pigmentos captadores de luz, en gran número (desde unos 50 hasta miles). Sobre ellos incide la luz solar, de manera que se van transfiriendo la energía de unos a otros, en paquetes (excitones), pero sin oxidarse, en un fenómeno conocido como resonancia inductiva.

El complejo antena actúa como un "embudo", captando energía lumínica, y canalizándola hacia el centro de reacción, donde como veremos enseguida, esta energía podrá ser convertida a una forma útil.

Centro de reacción (C.R.)

Para hacernos una idea concreta de un centro de reacción, mostraremos uno de los mejor estudiados: el de la anoxifotobacteria purpúrea Rhodopseudomonas viridis (el primero en desentrañarse a nivel molecular, en el año 1985, mediante técnicas de difracción de rayos X).

• posee 4 bacterioclorofilas, de las cuales dos (denominadas P₈₇₀) son las fotoquímicamente activas, debido a su asociación con tres proteínas del centro de reacción (denominadas L, M y H). Todo el conjunto se encuentra en la bicapa lipídica.
• 2 bacteriofeofitinas
• 2 ubiquinonas y un Fe, que constituyen el complejo Q·Fe.

Antes de dar una visión más detallada, veamos un pequeño resumen del modo de funcionamiento del centro de reacción:

• Llega un cuanto de luz al par de bacterioclorofilas especiales. La bacterioclorofila (Bcfla.) se excita (Bclfla*);
• la Bclfla* excitada se oxida (pierde un electrón) à Bclfla⁺;
• el electrón es captado rápidamente por el aceptor inmediato (la bacteriofeofitina), que a su vez lo pasa a la quinona cercana.
• En todo este proceso se va produciendo una separación de cargas, porque el electrón va quedando cada vez más separado de la Bclfla⁺ oxidada. El electrón pasará a otra quinona situada fuera del C.R., convirtiéndose en un electrón de alta energía.

Veamos en detalle la secuencia de transferencias en el centro de reacción

1. Cada Bclfla. especial (P₈₇₀ en el ejemplo que estamos estudiando), tras excitarse (pasar Bclfla*), se oxida (pierde electrón), pasando a Bclfla⁺.
2. El electrón pasa a una Blcfla. "normal" (P₈₀₀, no asociada a proteínas).
3. El electrón original de cada una de las dos Blcflas. especiales es recogido por las bacteriofeofitinas.
4. Los dos electrones (uno por feofitina) pasan a una ubiquinona (Q_A) estrechamente ligada al centro de reacción (la quinona se reduce: Q_AH). Observar que se ha originado una separación de cargas, de modo que se ha formado una especie de "agujero" cargado positivamente: las bacterioclorofilas con carga positiva tienen ahora una alta afinidad por electrones.
5. La Bclfla⁺. captura un electrón de un citocromo cercano (cit c₂, ligado al centro de reacción). Normalmente este citocromo es un donador débil de electrones, pero ahora los cede, debido al intenso "agujero" de carga positiva representado por las Bclflas⁺.
6. Mientras tanto, el electrón de la Q_A pasa a una segunda ubiquinona del centro de reacción (Q_B).
7. El electrón abandona el centro de reacción y pasa a otra quinona, que se encuentra libre en la bicapa lipídica. Esta quinona, una vez reducida, es un buen reductor (donador de electrones). El electrón pasa a la c.t.e. (con citocromos b-c).
8. El funcionamiento de esta c.t.e. provoca una translocación de protones fuera de la membrana, o sea, un potencial electroquímico de protones o f.p.m., cuya disipación a favor de las ATP-asas se traduce en producción de ATP (fotofosforilación).

3.3 TIPOS DE FOTOFOSFORILACIÓN

Fotofosforilación cíclica

En la FFC, la (bacterio)clorofila del centro de reacción (fotosistema I) sirve tanto como donador primario de electrones como aceptor final de electrones procedentes de una c.t.e.

Los electrones no pueden salir del ciclo. Cuando los electrones pasan por la confluencia entre una quinona y un complejo de citocromos se produce translocación de protones al exterior, lo que suponeD p, que a su vez se puede convertir en ATP.

Como los electrones no pueden salir del ciclo, no se crea poder reductor. Por lo tanto, este poder reductor ha de venir de otra fuente, y no del funcionamiento del fotosistema. (Fuente química, que permite un flujo invertido de electrones).

Fotofosforilación acíclica

En Anoxifotobacterias: FFA anoxigénica

El fotosistema I (FSI) se excita y la Bclfla. se oxida (Bclfla⁺). Los electrones cedidos por el C.R. sirven para reducir (junto con protones) al NAD(P)⁺ hasta NAD(P)H + H⁺ (es decir, se crea poder reductor).

Ahora bien )cómo se regenera la bacterioclorofila, es decir, cómo se reduce la Bclfla⁺ oxidada? En la FFA existe un donador exógeno de electrones distinto del H₂O: SH₂, S⁰, H₂, ciertos compuestos orgánicos. Dicho donador cede electrones al C.R. a través de una c.t.e., que como es habitual, crea un potencial D p (f.p.m.) convertible en ATP.

En Oxifotobacterias, al igual que en algas verdes y plantas superiores: FFA oxigénica

Estos organismos usan H₂O como donador exógeno de electrones; la FFA es más compleja, ya que el H₂O requiere un elevado potencial de reducción para poder extraerle los electrones, y el FSI no es un oxidante suficientemente fuerte como para captar electrones directamente del agua.

La manera de resolver este problema es acoplar un fotosistema adicional (FSII),, dotado de un E₀' más alto que el FSI, y que funciona en paralelo con éste.

• El FSI se activa y se oxida por la luz, transfiriendo los electrones a una ferredoxina, que a su vez los cede al NADP⁺, para generar poder reductor (NADPH + H⁺).
• Ahora bien, como hemos dicho, el FSI⁺ no puede regenerarse directamente por el agua, sino que recibe los electrones desde el FSII, a través de una c.t.e. (por supuesto, con creación deD p y por lo tanto, ATP).

Esta c.t.e. consta de la serie de transportadores siguiente:
PQ (plastoquinona) -- citocromo b·f -- PC (plastocianina)

• El FSII se excita por la luz (y como acabamos de decir, envía los electrones al FSI vía c.t.e.). Este FSII⁺ sí puede regenerarse extrayendo los electrones del H₂O, desprendiéndose O₂.

En resumen, el FSI⁺ actúa como un aceptor final de electrones procedentes del FSII. . A su vez, el FSII⁺ (oxidado) se reduce directamente por el agua (merced a un complejo enzimático que contiene Mn, llamado complejo lítico del agua o "reloj oxidante del agua").

4. CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN HALOBACTERIUM

Algunas arqueobacterias halófilas (p. ej., Halobacterium) presentan una capacidad de síntesis de ATP mediada por la luz, pero sin implicación de clorofilas ni fijación de CO₂. Cuando estas bacterias se encuentran en condiciones de baja aireación (bajas tensiones de O₂), sintetizan una cromoproteína especial llamada bacteriorrodopsina, que forma "parches" de color púrpura en sus membranas citoplásmicas.

La bacteriorrodopsina consta de:

• porción proteica: bacteriopsina, que forma 7 hélices a atravesando la membrana;
• grupo cromóforo: retinal (el mismo de la rodopsina retiniana de los vertebrados). El retinal es un carotenoide C₂₀ que puede absorber la luz y catalizar la transferencia de protones a través de la membrana. Se encuentra unido como una base de Schiff a una determinada lisina de la bacteriopsina.

El retinal, como base de Schiff (con una carga positiva), tiene en principio la configuración 13-cis. Esta forma del retinal absorbe un cuanto de luz de l =565 nm, de lo que resulta un bombeo de un protón fuera de la membrana. Para regenerar la base de Schiff, la forma neutra anterior pasa conformación todo-trans, capta un protón y pasa a la forma protonada 13-cis.

El funcionamiento del sistema crea, pues, un gradiente de protones, cuya disipación a favor de ATP-asas de membrana es convertido a ATP. Obsérvese que funciona como una bomba de protones, que saca H⁺ al exterior.

5. EL OXÍGENO Y EL METABOLISMO BACTERIANO

5.1 REACCIONES MEDIADAS POR FLAVOPROTEÍNAS

Aparte de las bacterias que usan O₂ como aceptor terminal de electrones de sus c.t.e. respiratorias, todos los procariotas presentan algunos enzimas que pueden reaccionar directamente con este oxígeno. De estos enzimas, los más típicos son las flavoproteínas, que se pueden autooxidar en presencia de O₂, dando inevitablemente peróxido de hidrógeno (H₂O₂), que es un compuesto muy tóxico; también se pueden generar pequeñas cantidades de otro producto tóxico, el radicalsuperóxido (O₂ ^-). Por lo tanto, no es de extrañar que en bacterias haya evolucionado un arsenal de enzimas para detoxificar estas sustancias:

Protección respecto de los peróxidos:

En muchas bacterias aerobias existe el enzima catalasa:

catalasa

H₂O₂-----------------------------> H₂O + 2 O₂

Algunos anaerobios aerotolerantes producen peroxidasa, capaz de eliminar cualquier peróxido, incluyendo el de hidrógeno. Las peroxidasas catalizan la oxigenación de compuestos orgánicos por el peróxido de hidrógeno, que pasa a agua:

peroxidasa

H₂O₂ + NADH + H⁺ --------------------------> 2 H₂O + NAD⁺

Protección respecto del superóxido:

El radical superóxido se produce por:

• acción de oxidasas;
• autooxidación de quinonas, ferredoxinas y flavoproteínas.

Este radical es muy tóxico, de modo que todas las bacterias aerobias y anaerobias aerotolerantes presentan el enzima superóxido dismutasa (SOD), que cataliza la conversión del superóxido en oxígeno molecular y agua oxigenada, que a su vez se destruye por los mecanismos que acabamos de ver:

SOD

2 O₂^? - + 2 H⁺ -------------->O₂ + H₂O₂

5.2 RELACIONES DE LAS BACTERIAS CON EL OXÍGENO

Dependen en buena medida de la disponibilidad de las enzimas eliminadoras de peróxidos y superóxidos, que acabamos de estudiar. Veamos los tipos de bacterias según sus relaciones con el oxígeno:

Bacterias aerobias: Necesitan O₂ para crecer, ya que lo usan (al menos en algunas ocasiones) como aceptor final de electrones para la captación de energía química.

Algunos aerobios requieren para crecer tensiones de oxígeno inferiores a la atmosférica (del 2 al 10% de O₂, en lugar del 20%). A estas bacterias se las califica como microaerófilas.

• Algunas microaerófilas lo son permanentemente (microaerófilas estrictas).
• Otras se comportan como microaerófilas sólo cuando crecen usando determinadas fuentes de energía química o de nitrógeno (microaerófilas condicionales).

Bacterias anaerobias: Son aquellas que pueden crecer en ausencia de oxígeno, debido a que pueden usar aceptores finales distintos del oxígeno, o porque poseen metabolismo estrictamente fermentativo.

• Anaerobias estrictas: El oxígeno les resulta tóxico ya que carecen de catalasa, peroxidasa y SOD, y por lo tanto, no pueden eliminar los productos nocivos resultantes del oxígeno.(Por ejemplo, las especies de Clostridium, y las arqueobacterias metanogénicas).
• Anaerobias aerotolerantes (= aerodúricas): Al igual que las anteriores, presentan un metabolismo energético anaerobio, pero soportan el oxígeno debido a que poseen enzimas detoxificadores. Ejemplos típicos son las bacterias del ácido láctico, como Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus). También se les llama anaerobios indiferentes.
• Anaerobios facultativos: Pueden realizar metabolismo energético aerobio o anaerobio, dependiendo del ambiente y la disponibilidad de aceptores finales de electrones. Ejemplos son las enterobacterias como E. coli.