Estudios de la microbiología

DIFERENCIACIONES DE LA CÉLULA PROCARIÓTICA

 LA ENDOSPORA BACTERIANA Y LA ESPORULACIÓN

1.1 INTRODUCCIÓN A LA ESPORULACIÓN BACTERIANA

Algunas especies de bacterias Gram positivas (principalmente de los géneros Bacillus, Clostridium, Sporosarcina y Thermoactinomyces), disponen de una serie de estrategias adaptativas cuando se ven sometidas a privación de nutrientes en su medio ambiente:

1. en principio, intentan alcanzar un medio ambiente más propicio,
2. pero si finalmente la situación de hambre de nutrientes se mantiene, las células se preparan para un largo período de carencia nutricional. En este caso se embarcan en un proceso de diferenciación celular que conduce a la producción de una estructura especial llamadaendospora, que es una forma de reposo, durmiente (criptobiótica, es decir de metabolismo prácticamente detenido), y que es capaz de resistir una amplia gama de agentes agresivos ambientales, físicos y químicos.

En el primer caso antes citado, las respuestas consisten en lo siguiente:

1. En principio, cuando las células de Bacillus están creciendo activamente en un medio rico en nutrientes, carecen de flagelos. Cuando los nutrientes comienzan a escasear, se induce la síntesis de flagelos à las células se mueven, en virtud de quimiotaxis positiva, hacia zonas donde detecten mayores concentraciones de nutrientes.
2. Si aun así, los nutrientes ricos vuelven a escasear, se inducen una serie de enzimas intracelulares y extracelulares, destinadas a aprovechar nutrientes menos ricos:
1. enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, que permiten aprovechar el acetato que previamente las células habían "desechado" como consecuencia de la utilización de la glucosa.
2. enzimas hidrolíticas extracelulares destinadas a degradar polímeros presentes en el medio. Entre las enzimas excretadas encontramos proteasas, nucleasas, amilasas, fosfatasas, etc.à los monómeros obtenidos son transportados al citoplasma, donde son metabolizados o empleados en los procesos biosíntéticos de mantenimiento.
3. En el segundo caso (apartado 2 citado antes), si la bacteria sigue pasando hambre, concretamente, si los niveles de fuentes de C, N, o P caen por debajo de un umbral, esto constituye una señal a la célula de que se avecina un largo período de privación de nutrientes. Entonces, la célula se implica en una serie de complejos cambios genéticos, metabólicos, estructurales, etc. (proceso de esporulación), que conducen a la diferenciación, en el interior de la célula vegetativa original, de una célula durmiente (la endospora). La célula-madre (o sea, la célula vegetativa original que generó la endospora) finalmente se autolisa, liberando la espora, que es capaz de permanecer en estado criptobiótico, durmiente, varios decenios, -incluso siglos. Las esporas son fácilmente diseminadas por el aire; cuando caen en medios ricos en nutrientes, se desencadena su germinación, se reinicia la actividad metabólica, de modo que cada espora genera una nueva célula vegetativa, capaz de divisón binaria, etc.

O sea, la esporulación se puede considerar como un proceso de supervivencia "en última instancia", la "última carta" que se juegan ciertas bacterias Gram positivas cuando se enfrentan a condiciones severas de hambre de nutrientes.

Significado adaptativo: Estas bacterias suelen vivir en medios nutricionalmente pobres (suelos, hierba seca, etc.). La esporulación es un proceso muy refinado que ha aparecido evolutivamente en una línea filogenética de bacterias Gram-positivas, y que les permite sobrevivir largos períodos de carencia nutricional. (¡Atención!: La endospora bacteriana NO es una forma de resistencia).

La esporulación bacteriana es un sistema modelo donde se pueden estudiar, con relativa sencillez, determinados problemas biológicos más generales: ¿qué bases moleculares y genéticas tiene ladiferenciación de un tipo de célula a otro tipo distinto?, ¿cómo se regula el proceso en función del tiempo y del espacio?, ¿cómo se "reparten los papeles" los tipos celulares implicados?, etc. Por esta razón, presenta un enorme interés para los biólogos, interesados en escudriñar las bases íntimas de este tipo de importantes cuestiones, tan frecuentes en los organismos superiores.

Las endosporas son formas de reposo (y no formas reproductivas), que representan una etapa del ciclo de vida de ciertas bacterias, y que se caracterizan por una estructura peculiar, diferenciada respecto de las células vegetativas, por un estado metabólico prácticamente detenido, y por una elevada resistencia a agentes agresivos ambientales.

1.2 OBSERVACIÓN DE LAS ESPORAS

Al microscopio óptico, en fresco (sin teñir), aparecen como cuerpos esféricos, ovoides e incluso en algunas especies, cilíndricos, muy refringentes, libres, o aún incluidos en la célula vegetativa (célula madre).

Esporangio = célula madre + espora

El tamaño relativo de la espora, y su situación en el esporangio, son criterios taxonómicos importantes en las bacterias esporulantes.

Según que el diámetro de la espora sea o no mayor que el de la célula vegetativa:

• Esporas deformantes
• Esporas no deformantes

Según la localización de la espora dentro del esporangio:

• Terminal
• Subterminal
• Central

Los esporangios deformantes de Clostridium son característicos:

en forma de cerilla o palillo de tambor (plectridios)
en huso (clostridios)

Tinción: No se tiñen por los colorantes normales. Hay que forzar por calor y/o mordientes (por ejemplo, tras teñir reforzadamente con fuchsina, resisten decoloración por alcohol-ClH). Otra tinción muy empleada es la reforzada con verde de malaquita.

1.3 ESTRUCTURA Y COMPOSICION QUIMICA DE LA ENDOSPORA

Partes que comprende la endospora:

• Protoplasto o núcleo ("core", en inglés), con la membrana citoplásmica de la espora (membrana esporal interna).
• Pared de la espora (= Germen de la pared de la futura célula vegetativa).
• Corteza o córtex, rodeado externamente de la membrana esporal externa.
• Cubiertas.
• Exosporio (no universal: las esporas de algunas especies carecen de él).

PROTOPLASTO O NÚCLEO

El citoplasma de la espora está muy deshidratado. Sus componentes están inmovilizados en unamatriz de quelatos de iones Ca⁺⁺ y ácido dipicolínico.

El citoplasma de la espora contiene altas concentraciones de ion Ca⁺⁺ (1-3% del peso seco de la espora), y de ácido dipicolínico (DPA) (10% en peso); ambos están formando un quelato, llamado dipicolinato cálcico (DPC), una sustancia exclusiva de las esporas bacterianas.

(El DPA se sintetiza por una desviación especial de la ruta que conduce a la biosíntesis de la lisina y mesodiaminopimélico, a partir de aspártico)

Papel del DPC: Como veremos, es una "reserva de Ca²⁺", que durante la esporulación secuestra este ión, lo que tendrá un papel importante en la deshidratación del protoplasto; durante la germinación, la liberación del Ca⁺⁺ será fundamental en este proceso.

El protoplasto contiene un cromosoma completo, condensado, y todos los componentes indispensables para reiniciar el crecimiento vegetativo cuando la espora germine, pero carece de muchos componentes típicos de la célula vegetativa:

• posee una pequeña dotación de ribosomas, junto con componentes estables de la maquinaria de síntesis de proteínas (ARNt, cofactores, etc.)
• ARN polimerasa.
• nucleósidos mono- y difosfatados, pero no NTP (no hay ATP)
• carece de componentes inestables: no hay ARNm, ni enzimas biosintéticas, ni aminoácidos ni bases nitrogenadas libres, ni cofactores reducidos (NADH; CoA).
• pero en cambio, existe una gran cantidad de una serie de pequeñas proteínas especiales (llamadas SASP, del inglés "small acid-soluble proteins"). Cuando se produzca la germinación, estas proteínas serán hidrolizadas rápidamente, y los aminoácidos resultantes serán empleados en la síntesis de nuevas proteínas necesarias en la germinación y crecimiento ulterior. Además, las SASPs están acomplejando al ADN (induciendo en él un cambio conformacional hacia la rara forma A, en vez de la B habitual), protegiéndolo del daño por luz UV.

Las diversas SASPs son muy parecidas en secuencia de aminoácidos. Constituyen la primera familia multigénica que se ha descrito en procariotas. Cada proteína está sintetizada por un gen monocistrónico (genes ssp). Los diversos genes de la familia (que posiblemente han surgido por diversas duplicaciones génicas y diversificación de secuencias) se encuentran dispersos por diversas regiones del cromosoma de la bacteria.
Las proteínas SASPs tienen de 60 a 75 aminoácidos, y pueden llegar a constituir el 5% de la proteína total de la espora. Cubren y acomplejan todo el nucloide de la espora, a razón de un monómero de SASP por cada 5 pares de bases, protegiendo el esqueleto del ADN, que pasa de configuración B a A.

• la "moneda energética" de la espora es el 3-fosfoglicerato, otra molécula estable del protoplasto, que será convertido rápidamente a 2-fosfoglicerato, y de él a PEP (fosfo-enol-pirúvico) al germinar la espora (el PEP es donador de P para generar ATP).

Rodeando al protoplasto está la membrana citoplásmica (membrana interna de la espora), una bicapa lipídica carente de fluidez, posiblemente como resultado de su estructura policristalina.

PARED DE LA ESPORA (= GERMEN DE LA PARED CELULAR DE LA CÉLULA VEGETATIVA)

Situación: inmediatamente por encima de la membrana interna de la espora (ver micrografía a microscopio electrónico, o el esquema de la ultraestructura).

Composición: a base de un peptidoglucano (PG) similar al de la célula vegetativa, con sus característicos enlaces entre los tetrapétidos.

Funciones: al germinar la espora, dará lugar a la pared celular de la nueva célula vegetativa, confiriéndole, mientras tanto, resistencia osmótica.

Origen: se sintetiza a partir de la prespora, atravesando los precursores la membrana interior que hemos citado arriba.

CORTEZA O CÓRTEX

(Obsérvese su aspecto a microscopio electrónico: transparente a los electrones, gruesa, a base de láminas concéntricas).

Composición: un peptidoglucano (PG) especial, diferente en composición al PG de la célula vegetativa:

• 30% del NAM tiene tetrapéptidos normales, pero el grado de entrecruzamiento es muy bajo (6%).
• 15% del NAM tiene solo la L-ala inicial, en lugar de tetrapétido.
• 55% de una modificación del ácido murámico (lactama del ácido murámico), producida por condensación del -COOH lactilo con el -NH₂, para formar la lactama correspondiente).

Origen: Se sintetiza a partir de la célula madre, con sus intermediarios ensamblados a nivel de la membrana externa que rodea a la corteza.

Propiedades de la corteza:

1. Tiene un bajo grado de puentes entre tetrapéptidos (sólo un 6%). Ello condiciona:
1. una estructura más laxa, floja y flexible que el PG normal, capaz de expandirse en ausencia de cationes que neutralicen sus grupos negativos (sobre todo del mDAP y del glutámico de los tetrapéptidos). Esto es la base de su apariencia de gel.
2. su rápida autolisis, durante la germinación de la espora.
2. la lactama del murámico condiciona una gran resistencia a la lisozima.

La corteza está limitada por la membrana esporal externa, procedente de invaginación de la membrana citoplásmica de la célula vegetativa madre. Posee una polaridad opuesta a la de la membrana esporal interna.

CUBIERTAS

(Obsérvese, en las micrografías, su aspecto muy voluminoso: pueden llegar a representar hasta 50% del volumen de la espora). Su aspecto es distinto según las especies. Véanse las cubiertas de B. cereus (3 capas, dos granuladas, en una matriz más transparente a los electrones), y de B. subtilis(capa interna laminada, y capa externa muy densa a los electrones).

Composición: depende de las especies, pero en general, a base de una o varias proteínas de tipo queratina, todas muy ricas en cisteína y en aminoácidos. hidrófobos, y que llegan a constituir el 60% en peso seco de la espora. Buena parte de la cisteína se añade post-traduccionalmente, por modificación de la proteína inmadura.

En B. cereus: un solo tipo de proteína, de 12 kD, muy rica en cys, lo que supone abundancia de puentes disulfuro, y enlaces hidrófobos e iónicos.

En B. subtilis, 14 tipos de proteínas, igualmente ricas en cys y aminoácidos. hidrófobos.

Propiedades: son muy insolubles e impermeables, e impiden la entrada de numerosos agentes químicos, incluyendo sustancias tóxicas. La abundancia de puentes S-S las hace muy compactas y muy estables químicamente.

EXOSPORIO

(No universal; ausente en esporas de ciertas especies).

En B. cereus es una estructura membranosa transparente, a modo de saco cerrado, delgado y flojo, envolviendo al resto de la espora de una forma "suelta", despegado en principio respecto de las cubiertas (tras la liberación de la espora, al perderse el contenido acuoso que había entre exosporio y cubiertas, aquel se pega a éstas).

En B. subtilis y B. megaterium, el exosporio está envolviendo a la espora de una forma más estrecha, estableciendo algunos contactos físicos con la superfie de las cubiertas.

Composición química: mezcla de proteínas, polisacáridos complejos, y lípidos.

Estructura: Capa interna, de 16 nm de grosor, formada por el ensamblaje de subunidades de simetría hexagonal, que dejan unas perforaciones de 7,6 nm de diámetro. Capa externa, de 6 nm de grosor, de la que salen hacia el exterior unas protuberancias a modo de pelos, de unos 25 nm de longitud.

Propiedades: muy resistente a enzimas proteolíticas, lo que sugiere (pero no prueba directamente) que el exosporio puede representar algún papel como barrera de defensa externa de la espora. También se ha sugerido (pero no comprobado) que pudieran actuar concentrando las proteínas que constituyen las cubiertas.

1.4 DESENCADENAMIENTO DE LA ESPORULACIÓN

Para que se produzca la esporulación, se necesitan dos condiciones previas:

1. los cultivos bacterianos han de estar en buenas condiciones;
2. cuando cesa el crecimiento exponencial, la mayoría de las células entran en esporulación, aunque el proceso no es sincrónico (hay desfases entre unas células y otras), de modo que en un lapso de tiempo relativamente breve (5,5-8 horas en Bacillus subtilis) casi todo el cultivo aparece en forma de esporas, habiendo desaparecido las células vegetativas. La división celular típica de la fase de crecimiento exponencial y la esporulación son procesos mutuamente excluyentes.

¿Qué estímulo es el responsable de desencadenar la esporulación? En principio, se pueden plantear dos hipótesis distintas:

1. la esporulación se debería a la acumulación de sustancias tóxicas o productos de desecho en el medio de cultivo;
2. la esporulación se debería a la carencia de algún tipo de nutriente.

Veamos cómo se demuestra que la hipótesis a) es falsa:

Si se añaden sustancias tóxicas o moléculas de desecho a un cultivo joven, no se induce la esporulación (al contrario, ésta se ve inhibida).

Realicemos un sencillo experimento que apoya la hipótesis b):

Tomemos un cultivo que aún esté en mitad de la fase exponencial; lo lavamos y lo transferimos a agua destilada o a un medio pobre en nutrientes. Comprobamos que al cabo de poco tiempo se induce la esporulación. Este fenómeno se puede calificar deesporulación endotrófica, es decir, estamos comprobando que la bacteria desencadena la esporulación porque debe de estar agotando algún nutriente interno (en el agua destilada no hay nutrientes, como es lógico, ni hay productos de desecho ni sustancias extrañas).

Es decir, lo que detiene el crecimiento de estas bacterias y dispara la esporulación es un estado de inanición, de carencia de nutrientes. Si en el experimento anterior añadimos el nutriente limitante al medio o al agua destilada antes de que la bacteria alcance la fase estacionaria, se puede evitar que el cultivo entre en esporulación (hasta que se agote el nutriente que se haga limitante).

El nutriente limitante que puede desencadenar la esporulación puede ser: la fuente de carbono, la fuente de nitrógeno o incluso la carencia de fosfatos.

¿Qué ocurre a nivel intracelular para que se desencadene la esporulación? Esta es una de las facetas más oscuras aún. Se han venido manejando varias hipótesis:

1. Hipótesis del "gatillo disparador" único: Propugna la existencia de algún factor de la célula vegetativa que induce la esporulación al llegar el cultivo a un determinado estado, o bien la existencia de un factor vegetativo que está bloqueando la esporulación, pero que se inactiva cuando el cultivo llega a ese estado.
Por ejemplo, se maneja la posibilidad de que se vaya produciendo durante el crecimiento vegetativo un nucleótido especial tetrafosforilado (ppGpp) que provocara una disminución de los niveles de NTP y NDP, lo que a su vez induciría los genes de la esporulación que hasta ese momento se habían mantenido silenciosos.
2. Hipótesis de los pasos múltiples acumulativos: Conforme la bacteria va cambiando de sustratos (conforme va agotando unos y recurriendo a otros) va acumulando una serie de cambios metabólicos internos, hasta que se llega a un determinado "umbral" o cambio clave, desencadenante.
3. Hipótesis "mixta" con elementos de las dos anteriores: El desencadenamiento sería resultado de una serie de cambios interconectados del metabolismo biosintético, pero además, en algún momento, entraría en juego algún evento regulatorio concreto. Existiría un "punto de no retorno" en el que el proceso se hace irreversible. Ese punto de irreversibilidad consiste, quizás, en la irreversibilidad acumulada de una serie de procesos individuales.

De hecho, hoy se sabe que Bacillus subtilis entra en esporulación una vez que ha integrado una amplia variedad de señales ambientales y fisiológicas, que conducen finalmente a la activación de la proteína Spo0A, que es un regulador transcripcional esencial en el desencadenamiento de esta esporulación.
Estas señales son encauzadas a un sistema de repetidores basados en fosforilaciones sucesivas, hasta que llegan a la Spo0A, que queda convertida en la forma activa Spo0A-P. La ruta de repetidores es más o menos así:

1. Hay al menos 3 histidín-proteínquinasas que donan su fosfato a la Spo0F.
2. De Spo0F el P pasa a la Spo0B
3. De la Spo0B el P pasa a la Spo0A.

Además, la Spo0A-P está sometida a la modulación de fosfatasas específicas, como la Spo0E.
Una vez fosforilada, la Spo0A-P pone en marcha una serie de circuitos reguladores positivos y negativos, y entre otros, activa la transcripción de al menos 7 genes que determinan la entrada en esporulación. (Ello lo hace interaccionando con los correspondientes promotores y con formas de ARN con subunidades s especiales).

1.5 FASES DE LA ESPORULACIÓN

Vamos a estudiar la esporulación en Bacillus subtilis o en B. megaterium, dos de las bacterias esporuladas mejor investigadas, y que completan la esporulación al cabo de unas 7-8 horas de su inicio, a 37⁰C. Se pueden distinguir siete fases consecutivas (además de la fase "0" anterior a la esporulación). Cada fase se denota con un número romano, y su duración en horas se expresa como subíndice de t, p. ej., t₂. Como veremos enseguida, cada fase se distingue por un(os) evento(s) citológico(s) peculiar(es) y por una serie de cambios bioquímicos propios:

Fase 0 (célula vegetativa):

Al final del periodo de crecimiento exponencial, la célula vegetativa contiene dos cromosomas.

Fase I (t₀-t₁):

• El material genético (los dos cromosomas) se condensa constituyendo un filamento axialancho, que ocupa el centro de la célula, según su eje longitudinal. Cada nucleoide está unido a uno de los extremos de la célula.
• En vez de iniciarse una división celular simétrica (con septo central), se forman dos espículas de la pared celular cerca de los polos hacia el interior, rodeadas de la correspondiente invaginación de la membrana citoplásmica. Cada espícula está señalando una zona donde se está formando el anillo de FtsZ (proteína contráctil de tipo tubulina: véase el tema 6)
• Se sintetizan y se liberan al medio antibióticos y varias exoenzimas. Una serie de proteasas se encargan del turnover de proteínas intracelulares, cuyos aminoácidos constituyentes serán empleados para sintetizar nuevas proteínas específicas de la esporulación.

Fase II (t₁-t₂):

Se termina por formar un septo transversal acéntrico, cerca de un polo de la célula, por invaginación de la membrana citoplásmica, y deposición de nuevo PG entre las dos membranas adyacentes.

Cada nucleoide queda segregado en uno de los dos compartimentos que se han formado:

1. un cromosoma va al compartimento pequeño (compartimento de la preespora);
2. la otra copia del cromosoma va al compartimento grande (célula madre).

La segregación del cromosoma que queda en el compartimento de la preespora es muy interesante: Conforme el septo acéntrico se va cerrando, la mayor parte del cromosoma (un 70%) queda "fuera" de lo que será el límite entre preespora y célula madre: es decir, por sí mismo, sólo un 30% de ese cromosoma quedaría en la preespora. Pero la proteína SpoIIIE actúa como una translocasa de ese cromosoma, y lo "empuja" al interior del compartimento de la preespora antes de que éste se cierre. Parece ser que el mecanismo guarda cierto parecido con el de transferencia de ciertos plásmidos conjugativos deStreptomyces.

En esta fase continúa la síntesis de los antibióticos y de las exoenzimas (serina-proteasas, metalo-proteasas, ribonucleasas, a-amilasa, etc).

Fase III (t₂-t₃):

• Independización del protoplasto de la preespora respecto de la célula madre. Para ello, lo primero que ocurre es la degradación selectiva del PG del septo que se había depositado en la fase II (esta degradación comienza por el centro, es decir, por donde se había cerrrado, y sigue hacia la periferia, y en ella intervienen los productos de varios genes). Entonces, la membrana citoplásmica de la célula madre va creciendo unidireccionalmente alrededor de la preespora, hasta que ésta queda libre en el citoplasma del esporangio.

Obsérvese que el citoplasma de la preespora queda rodeado por dos membranas de polaridad opuesta: la interior tiene la polaridad normal, pero la exterior, derivada del crecimiento de la membrana de la célula madre, tiene polaridad invertida

• A partir de esta fase el turnover (renovación) de proteínas sólo tendrá lugar en la célula madre, deteniéndose en el compartimento de la preespora.

Fase IV (t₃-t₄):

• Se forma casi por completo la corteza de la espora, por deposición de peptidoglucano entre las dos membranas. Sin embargo este PG aún no está "maduro" (no tiene todavía las características que estudiamos en el apartado 1.3.3).
• También se deposita el peptidoglucano de la pared celular (que constituye el germen de la pared celular de la futura célula vegetativa).
• Coincidiendo con esto, la preespora adquiere su aspecto refráctil al microscopio óptico en fresco.
• Comienza la síntesis del ácido dipicolínico (DPA), así como la acumulación de Ca²⁺.
• En las bacterias que lo poseen, en esta fase comienza la síntesis del exosporio.

Fase V (t₄-t_5,5):

• Los materiales de las cubiertas (que se habían ido sintetizando durante las fases II y III en el compartimento de la célula madre), comienzan a depositarse por fuera de la membrana esporal externa.

Las cubiertas de B. subtilis están formadas por unos 14 tipos de proteínas, que se van ensamblando por etapas sucesivas, dando diversas capas, cada una con una composición de polipéptidos característica. La incorporación postraduccional de grandes cantidades de cisteína completará la estructura. El proceso no consiste en una deposición ordenada de capas desde el interior al exterior, sino más bien una construcción con andamiaje:

• La proteína SpoIVA (que no es una proteína de la cubierta, propiamente dicha), se dispone sobre la membrana esporal externa, y recluta proteínas de andamiaje desconocidas.
• Entonces se ensambla la proteína CotE en la parte externa de este andamio, y a su vez va a reclutar otras proteínas mayoritarias: proteína de cubierta interna (CotD), que dará la estructura que se ve laminar a microscopio electrónico, y proteína de cubierta externa (CotA) que interviene en las capas externas densas a los electrones.
• Luego se van incorporando las demás proteínas de las cubiertas.
• Al final de esta fase se adquiere la resistencia al octanol.
• Continúa la acumulación de DPA, que sigue secuestrando iones Ca⁺⁺ (formación del quelato de dipicolinato cálcico, DPC).

La célula madre sintetiza el DPA, que es transportado a la preespora. El Ca²⁺ es captado por transporte activo por el esporangio, pero pasa por difusión facilitada desde la célula madre a la preespora, donde rápidamente es quelado por el DPA, lo que a su vez es un estímulo para la entrada de más Ca⁺⁺. Esta difusión facilitada es consecuencia de que la polaridad de la membrana esporal externa está invertida: el Ca⁺⁺ no puede pasar por transporte activo.

Fase VI (t_5,5-t₇):

• La preespora madura hasta espora.
• Madura la corteza (para generar el característico PG cortical, más laxo, con su bajo porcentaje de entrecruzamientos -por actuación de endopeptidasas- y la lactama del NAM).
• Maduran las cubiertas.
• El citoplasma de la espora se hace más homogéneo y más denso a los electrones.
• Por una serie de razones aún no totalmente aclaradas, la espora se hace resistente al calor y al cloroformo.
• Se adquiere resistencia a las radiaciones ultravioleta (UV).
• Se adquiere resistencia a la lisozima.

Fase VII (t₇-t₈):

• Liberación de la espora madura por autolisis de la célula madre.
• En las bacterias que han producido exosporio, cuando la espora sale al exterior, este exosporio pierde su contenido de citoplasma (procedente de la célula madre), quedando como un saco vacío y plegado, unido a las cubiertas.

1.6 GENÉTICA MOLECULAR DE LA ESPORULACIÓN

Las células pueden detener el proceso de la esporulación si durante las 4 primeras fases se les suministra el nutriente que estaba limitando y que fue responsable del desencadenamiento (efecto dedesbloqueo metabólico). Pero a partir de la fase V el aporte de nutrientes no tiene ya ese efecto inhibidor: el proceso de la esporulación ya es irreversible, y se dice que la célula está comprometida (= obligada) a esporular.

El proceso de la esporulación es muy ordenado en el tiempo y en el espacio. En su base genética existe un conjunto de varios operones específicos de la esporulación (operones spo), sometidos a un finísimo control genético espacial y temporal. El conjunto de estos operones (que se encuentran en cuatro zonas distintas del cromosoma), se denomina esporulón, y comprende más de 125 genes. Las principales características de los operones del esporulón son:

• Los operones están inactivos durante el crecimiento vegetativo;
• se van activando de modo ordenado y secuencial, para luego ser reprimidos (una vez han actuado);
• están sometidos a interacciones pleiotrópicas unidireccionales;
• existe una "comunicación" regulatoria entre el compartimento de la espora y de la célula madre (interacciones espaciales);
• dentro de los mecanismos genéticos implicados en la expresión y regulación de los distintos operones correspondientes a fases distintas de la esporulación, un papel muy importante es el jugado por las subunidades sigma (s ) alternativas de la ARN-polimerasa.

Como se recordará, la holoenzima de la ARN-polimerasa reconoce el promotor merced a la subunidad s . En la célula vegetativa existe un tipo "estándar" de esta subunidad, capaz de reconocer los promotores de genes vegetativos. Pues bien, durante la esporulación asistimos a una sustitución de subunidades s en distintas fases del proceso. Cada subunidad desplaza a la que actuó en la fase anterior, de modo que en la fase actual la ARN polimerasa reconoce nuevos tipos de promotores, y transcribe los genes específicos de esa fase. Aún más, existen subunidades s diferentes en la célula madre y en la preespora.
Si queremos resumir la regulación genética de la esporulación desde el punto de vista de las distintas subunidades s y del "diálogo" entre la prespora y la célula madre, podríamos tener el siguiente cuadro (adaptado de Stragier & Losick, 1996):
Al final del crecimiento exponencial, y durante la fase estacionaria, una serie de cambios fisiológicos y ambientales son detectados y esa información es canalizada hacia el "repetidor de fosfatos", lo que lleva a que se acumule Spo0A-P.
Esta Spo0A-P induce (junto con las holoenzimas provistas de s^A y s^H) la expresión de una serie de genes y operones, lo que permite la entrada en esporulación. Uno de los primeros indicios de esto es la formación de un septo acéntrico (polar).
La formación del septo polar está implicada en activación de una nueva subunidad s, la llamada s^F, que actúa desde la preespora.
La s^F de la prespora induce a su vez la aparición de la s^E en la célula madre.
A su vez, la s^E, junto con el englobamiento de la prespora por la célula madre, ocasiona la aparición de s^Gen la prespora.
Finalmente, s^G pone en marcha una cadena de acontecimientos que conducen a la aparición de s^K en la célula madre.
Al mismo tiempo, los dos compartimentos siguen rutas paralelas de control de transcripción:

• En la prespora, s^F dirige la transcripción de s^G, que a su vez dirige la transcripción del gen de la proteína de unión a ADN, SpoVT.
• De igual manera, en la célula madre, la s^E conecta el gen de otra proteína de unión a ADN, la SpoIIID, que a su vez logra la transcripción y construcción del gen de la s^K, que a su vez activa el gen de factor transcripcional final, GerE.

1.7 CUERPOS PARASPORALES

Algunas bacterias esporuladas, como Bacillus thuringiensis, B. popiliae y algunas especies deClostridium, forman cristales proteicos en el esporangio simultáneamente a la formación de la endospora: son los llamados cuerpos parasporales.

Cada célula madre exhibe una sola inclusión, que se puede presentar libre en el citoplasma, o bien englobada en el exosporio de la espora. Los cuerpos parasporales pueden ser amorfos, pero los más típicos son pseudocristales octaédricos (bipiramidales). Están compuestos de la agregación regular de subunidades de una glucoproteína de unos 120 kDa, sintetizada durante la fase IV.

La función de estos cuerpos parasporales en la esporulación es desconocida (e incluso puede que de hecho, no tenga tal tipo de función). Bajo condiciones alcalinas, se disuelven y la proteína se convierte en una poderosa toxina para larvas de lepidópteros y otros insectos, cuando las ingierenvía oral (pero no por vía parenteral). Veamos cómo se produce el proceso de la toxicidad:

1. La oruga come materia vegetal que lleva bacterias esporuladas. El cuerpo parasporal se libera junto con la espora, cuando la célula madre se autolisa.
2. Los cuerpos parasporales se disuelven en el tracto digestivo de la oruga (que es alcalino), la proteína sufre proteolisis, lo que la transforma en una toxina.
3. Esta toxina altera la permeabilidad del epitelio intestinal de la oruga, de modo que los líquidos alcalinos del intestino pasan a la hemolinfa, que incrementa su pH por encima de 8, lo cual termina provocando la parálisis rápida del insecto.

El significado biológico más probable de este fenómeno es que la producción de cuerpos parasporales sea una variante de la esporulación que evolucionó durante la adaptación de estas bacterias a sus nichos ecológicos, como una manera de asegurar la germinación de las endosporas: la oruga ingiere los cristales junto con las esporas. Los cristales parasporales matan a la oruga, que se pudre. La oruga muerta y en putrefacción aseguraría un entorno adecuado en nutrientes para que se alimentaran y multiplicaran las células vegetativas que surgieran de la germinación de esas esporas.

Desde hace tiempo ciertos grupos de agricultores vienen usando inóculos de bacterias esporuladas de las especies productoras de cuerpos parasporales para rociar sus plantas y protegerlas de insectos: estamos ante un auténtico insecticida biológico, biodegradable, selectivo hacia las plagas e inofensivo para los seres superiores.

La moderna Ingeniería Genética ha logrado insertar y expresar genes codificadores de las toxinas parasporales de Bacillus thuringiensis en plantas de cultivo. Hoy día existen millones de hectáreas de cultivo de plantas transgénicas (sobre todo algodón, maíz y patata) que dependen menos de los insecticidas químicos merced a estos genes bacterianos (aunque ello no ha evitado las críticas de ciertos grupos ecologistas opuestos por sistema a todo lo que suene a manipulación genética por técnicas de ADN recombinante).

(En otras partes de este sitio web se habla de estos aspectos biotecnológicos y sus polémicas)

1.8 PROPIEDADES BIOLÓGICAS DE LAS ESPORAS: SU FUNDAMENTO

Las endosporas son células en estado de dormancia, con una bajísima tasa metabólica(hipometabolia, la menor que existe en el mundo vivo), y capaces de conservar su vitalidad durante larguísimos períodos. Son muy resistentes a la acción de diversos agentes químicos (octanol, cloroformo) y físicos (altas temperaturas, congelación, desecación, radiaciones).

1. Hipometabolia: Poseen la más baja tasa respiratoria de todos los seres vivos. Por ello son capaces de sobrevivir en ausencia de nutrientes durante largos períodos de tiempo.
2. Dormancia: Esta propiedad se refiere al hecho de que la espora tiene una gran inercia a los sustratos exógenos. Como veremos, la espora sólo perderá la dormancia cuando se haya activado para la germinación.
3. Resistencia al calor: Las esporas de ciertas especies resisten 120^oC durante 15 min, lo cual condiciona los parámetros para esterilizar materiales (véase el capítulo 17 titulado "Acción de agentes físicos sobre las bacterias"). Esta elevada resistencia a las altas temperaturas es un subproducto de los cambios evolutivos que condujeron a la deshidratación como medio para lograr la hipometabolia y la dormancia.
4. Deshidratación: El muy bajo contenido en agua de la espora (0.3 g de agua/g de peso seco frente a los 3-4 g de agua/g de peso seco de la célula vegetativa) hace que la espora sea muy refráctil al microscopio óptico en fresco. Ello condiciona las propiedades 1, 2 y 3. ¿Cuál es el mecanismo de la deshidratación, base a su vez de tantas propiedades biológicas de las endosporas? El tema es aún objeto de debate. Vamos a exponer brevemente una hipótesis (1989), según la cual habría 3 etapas en la consecución de la espora deshidratada y resistente al calor:
1. Desmineralización osmótica inicial. Durante la fase III de la esporulación se produce una acidificación del espacio cortical que conduce a la acidificación del protoplasto de la prespora. Para equilibrar la entrada de H⁺, del protoplasto sale gran cantidad de iones K⁺, junto con moléculas de agua.
2. Remineralización con Ca⁺⁺ (fases IV-V). El ácido dipicolínico va entrando al protoplasto de la prespora. Simultáneamente el Ca⁺⁺ entra a la célula madre por transporte activo, y de ella al protoplasto de la prespora por difusión facilitada. Se forma el correspondiente quelato de dipicolinato cálcico (DPC). Como vimos, este es un proceso con retroalimentación positiva, ya que conforme el Ca⁺⁺ queda "secuestrado" en forma de quelato (lo que significa que no hay de hecho iones Ca⁺⁺ libres en el interior de la prespora), se facilita más la entrada de mayores cantidades de Ca⁺⁺. Parte del Ca⁺⁺ y de otros cationes se acomplejan también con macromoléculas del protoplasto. Todo ello redunda en que la corteza se queda sin cationes; por lo tanto, no hay posibilidad de neutralizar las cargas negativas del PG cortical à las cargas negativas se repelen à se produce la expansión del PG cortical à en su expansión, la corteza se "topa" con las cubiertas rígidas, por lo que presiona sobre el protoplasto àsale más agua del protoplasto.
3. Resultado final: termoestabilización (= termorresistencia) del protoplasto. La gran pérdida de agua hace que los diversos compuestos del protoplasto se compacten entre sí, lo que facilita sus interacciones con los cationes. El resultado es la formación de un gel a base de una matriz constituida por complejos supramoleculares, macromoléculas y pequeñas moléculas densamente empaquetados, unidos entre sí e inmovilizados. Parece ser que esta es la base principal de la enorme resistencia a las altas temperaturas de la endospora.
5. Resistencia a los rayos UV: Parece que depende de varios componentes:
1. absorción de luz UV por las cubiertas;
2. por el DPC;
3. pero cada vez está más claro que las proteínas SASPs tienen un papel central en esta resistencia a los UV. Como ya dijimos, las SAPS acomplejan al ADN. Se ha comprobado que evitan la depurinización de ese ADN, y provoca un cambio en su fotoquímica (ver apartado siguiente);
4. cambio en la fotoquímica del ADN de la espora: se puede explicar parcialmente por la misma deshidratación del protoplasto, que impide que se formen dímeros de pirimidina entre pirimidinas adyacentes de una misma cadena del ADN. Como veremos en el capítulo 18, estos dímeros de pirimidina constituyen el principal tipo de fotoproductos generados por rayos UV en el ADN de la célula vegetativa, base de la mayor parte de los efectos deletéreos de estas radiaciones. Sin embargo, en la espora la luz UV genera otro tipo de alteración, llamada fotoproducto de la espora (que consiste en 5-timinil-5,6,dihidrotimina) que se produce en menor cantidad. Recientemente está quedando cada vez más claro que el principal responsable de ese cambio en la fotoquímica son las proteínas SASPs: al acomplejar al ADN, esas proteínas provocan un descenso marcado de la susceptibilidad a la formación de dímeros de pirimidina y el que aparezca el fotoproducto de la espora. La acumulación de fotoproductos de la espora puede ser igualmente letal, pero cuando germina la espora se pone inmediatamente en marcha un eficiente sistema de reparación específico de ese fotoproducto.
6. Resistencia a agentes químicos: La resistencia de la endospora a agentes como octanol, cloroformo, etc. se debe a la impermeabilidad de las cubiertas, gracias a su gran grosor y su peculiar composición a base de proteínas ricas en aminoácidos hidrófobos y con abundantes puentes disulfuro (cistinas).

1.9 GERMINACIÓN DE LA ENDOSPORA

La germinación es el proceso por el cual una espora se convierte al estado vegetativo. Es mucho más rápida que la esporulación (dura unos 90 minutos). Podemos considerar en ella cuatro etapas, según el modelo de Foster y Johnstone (1990)

1. preactivación
2. activación
3. iniciación (o germinación en sentido estricto)
4. crecimiento ulterior (entrada en fase vegetativa)

PREACTIVACIÓN

Antes de que la espora esté en condiciones de germinar se requiere que sus cubiertas se alteren. En la naturaleza esto ocurre por erosión por envejecimiento progresivo. Artificialmente, en laboratorio, se puede recurrir a algún procedimiento para alterar esas cubiertas:

• tratando las esporas a altas temperaturas, pero inferiores a su inactivación (100oC durante unos minutos);
• por radiaciones ionizantes;
• por pH bajos;
• por tratamiento con sustancias que posean grupos -SH libres (p. ej., mercaptoetanol).

ACTIVACIÓN

La activación es una etapa aún reversible, desencadenada por un agente químico externo (germinante) presente en el medio. Este agente es variable según las especies:

• iones inorgánicos (Mn⁺⁺, Mg⁺⁺);
• L-alanina en B. subtilis;
• glucosa u otros azúcares;
• adenina u otras bases nitrogenadas.

El germinante es detectado por un receptor alostérico a nivel de la membrana esporal interna. Una vez que dicho receptor se activa, adquiere una capacidad proteolítica específica que le permite romper una proenzima que hasta ese momento se encontraba unida covalentemente al PG de la corteza. La enzima resultante reconoce la lactama del NAM y comienza a hidrolizar el PG cortical. La consecuencia es que comienza a entrar agua al protoplasto de la espora, por lo que la espora pierde su característica refringencia, y se comienza a perder la resistencia al calor.

Durante toda esta etapa el metabolismo está aún latente.

INICIACIÓN O GERMINACIÓN EN SENTIDO ESTRICTO

En esta etapa la germinación se hace ya irreversible, y se rompe definitivamente el estado de dormancia, si bien el metabolismo es endógeno (no depende todavía de sustancias externas). Los principales acontecimientos bioquímicos son:

• se pierde DPA, lo que supone pérdida de Ca²⁺
• este Ca²⁺ pasa al córtex, donde neutraliza las cargas negativas --> se favorece la rehidratación del protoplasto y su hinchamiento, favorecido por la concomitante contracción del córtex, mientras continúa y se completa rápidamente la hidrólisis del PG cortical;
• el 3-fosfoglicérico (3-PG) se convierte en 2-PG, y éste en PEP, que a su vez dona su fosfato de alta energía para producir ATP;
• las pequeñas proteínas SASPs se hidrolizan por una proteasa específica (llamada GRP) que hasta ese momento estaba inactiva. De este modo los aminoácidos constituyentes de las SASPs se reutilizan para la síntesis de nuevas proteínas por parte de la pequeña dotación de ribosomas y demás moléculas accesorias;
• La ARN polimerasa comienza a sintetizar ARN (comienza la transcripción de genes vegetativos).

TERMINACIÓN Y CRECIMIENTO ULTERIOR

Aparece ya el metabolismo exógeno, de modo que la espora puede tomar nutrientes del exterior y metabolizarlos. Los eventos bioquímicos y estructurales más notorios son:

• se sintetiza ADN;
• el protoplasto crece aún más;
• la pared de la espora sirve como cebador (germen) para la producción de la pared de la célula vegetativa naciente;
• la célula vegetativa sale por rotura de las cubiertas, que puede ser de tipo polar o ecuatorial. Hay que aclarar que al salir, esta célula vegetativa se tiñe como Gram-negativa, y sólo adquirirá su típica grampositividad después de la primera división.

2. EXOSPORAS

Determinadas bacterias (Methylosinum, Rhodomicrobium) forman esporas reproductivas porgemaciones sucesivas al final de sus prostecas. Estas exosporas poseen una envuelta a base de pared rodeada de una cápsula o cubierta gruesa.

3. DIFERENCIACIONES EN LOS ESTREPTOMICETOS Y OTROS ACTINOMICETOS

Los actinomicetos constituyen un grupo amplio y complejo de bacterias Gram positivas con tendencia a un tipo de crecimiento micelial y un estilo de vida similar a los hongos (de ahí el nombre de Thallobacteria para esta clase). Muchos de los taxones de Actinomicetos y bacterias relacionadas poseen células diferenciadas de tipo reproductivo, genéricamente conocidas como esporas. Estudiaremos brevemente la diferenciación en dos géneros típicos.

Género Actinoplanes

Las especies de este género producen micelios vegetativos de sustrato (subterráneos). Algunos de estos micelios generan hifas verticales que sobresalen a la superficie. El extremo de cada una de estas hifas se diferencia para constituir un saco llamado esporangio, que se fragmenta en un conjunto deesporas móviles (flageladas) llamadas zigosporas o esporangiosporas.

Género Streptomyces

Forma un micelio de sustrato ramificado, interrumpido de vez en cuando por pared transversal (son por lo tanto organismos cenocíticos, es decir, el segmento de micelio limitado por dos tabiques sucesivos contienen varios cuerpos nucleares). Cuando hay limitación de nutrientes se comienza a formar un micelio aéreo a partir de ramificaciones de las hifas subterráneas. En los extremos de algunas de estas hifas aéreas las células se diferencian en cadenas de esporas. Durante la formación de estos micelios aéreos y de las esporas la población de micelios subterráneos sufre una lisis masiva.

Propiedades de las esporas de los estreptomicetos:

• la pared celular de la espora es más gruesa que la de la célula vegetativa;
• no hay cambio cualitativo en el PG;
• no hay córtex ni cubiertas;
• son muy hidrofóbicas: se resisten a ser suspendidas en agua. Esto parece que se debe a unavaina que rodea a la P.C., compuesta a base de túbulos auto-ensamblables.
• resisten más al calor y a la desecación en comparación a las células vegetativas, pero menos que las endosporas.
• son metabólicamente durmientes (células en reposo).

4. QUISTES BACTERIANOS

Son células que se producen en algunas especies por engrosamiento de la P.C. de la célula vegetativa, por deposición de nuevos materiales externamente a la membrana citoplásmica, al mismo tiempo que se acumulan materiales de reserva en el citoplasma. Poseen metabolismo endógeno, y resisten al calor, a la desecación y a agentes químicos más que la correspondiente célula vegetativa (pero menos que las endosporas).

Ejemplos:

• Quistes de Azotobacter y Bdellovibrio.
• Microquistes de Mixobacterias, llamados mixosporas: sus envueltas constan de una corteza, rodeada de cubiertas (interna y externa). Estas cubiertas se componen de una glucoproteína muy rica en polisacáridos.

5. DIFERENCIACIONES EN CIANOBACTERIAS

En las cianobacterias filamentosas (que forman tricomas) se pueden observar dos tipos principales de células diferenciadas a partir de las vegetativas: heteroquistes y acinetos.

Heteroquistes (= heterocistes)

Son células de término, sin función reproductiva, especializadas en la fijación de nitrógeno molecular (N₂), de mayor tamaño que las células vegetativas.

La conexión entre células vegetativas y heteroquistes se establece a través de un estrangulamiento de los polos de éstas. La unión está atravesada por una serie de finos canales llamadosmicroplasmodesmos, que reducen al mínimo el intercambio de sustancias entre ambas células.

Por fuera de la P.C. (que es de tipo Gram-negativo), existen tres cubiertas:

• una capa laminada interna a base de glucolípidos exclusivos de cianobacterias;
• una capa homogénea central a base de polisacáridos;
• una capa fibrosa externa, también polisacarídica, pero menos compactada.

Estas tres capas evitan la difusión del O₂ al interior del heteroquiste, lo que representa uno de los mecanismos para la protección de la nitrogenasa (complejo enzimático que reduce el N₂ a NH₄⁺, y que es muy sensible al oxígeno).

Pero el heteroquiste dispone de más "estrategias" para la protección de la nitrogenasa:

• aparte de los microplasmodesmos, en las uniones con las células vegetativas adyacentes se forman sendos "tapones" de cianoficina;
• los tilacoides se disponen como un retículo polar y periférico, y carecen de ficobilisomas, por lo que no pueden realizar la fase II de la fotosíntesis. Por lo tanto, los heteroquistes no generan oxígeno, ya que sólo realizan la fotofosforilación cíclica.

Acinetos (=aquinetos)

Son formas de reposo que se originan a partir de células vegetativas, por acumulación de nuevas capas de materiales polisacarídicos por fuera de la pared celular, y por formación de acúmulos de reserva en el citoplasma.

Resisten más que las células vegetativas los períodos de desecación y de congelación, pero no al calor.

Cuando las condiciones ambientales mejoran, se producen sucesivas divisiones transversales en el acineto, que finalmente se convierte en un filamento más corto y menos grueso que los tricomas, llamado hormogonio.

CRECIMIENTO Y DIVISIÓN CELULAR

INTRODUCCIÓN AL CRECIMIENTO BACTERIANO

Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biológico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicación celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento del tamaño del individuo, mientras que en unicelulares lo que ocurre es un aumento de la población. El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista:

• A escala individual
• A escala poblacional

Los eventos de crecimiento en el ámbito individual hacen referencia al ciclo celular, y dentro de éste podemos abordar los siguientes temas:

• inicio y transcurso de la replicación cromosómica y de plásmidos (véase tema 9);
• segregación de cromosoma y plásmidos a las células hijas;
• síntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre todo de pared celular (tema 6);
• señales que coordinan la replicación genómica con la división celular.

El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tópicos:

• cinética del crecimiento;
• factores que afectan al tiempo de generación (g);
• factores ambientales que limitan el crecimiento.

En el presente capítulo nos dedicaremos al estudio de algunos aspectos del ciclo celular procariótico, incluyendo referencias a algunas técnicas de investigación especiales. En el capítulo 14 nos centraremos en el crecimiento de poblaciones (que es el más frecuentemente empleado al trabajar con microorganismos), con una visión de los métodos para obtener crecimientos balanceados así como conceptos sobre los medios de cultivo en laboratorio. La influencia de los factores ambientales sobre el crecimiento son el objeto de los temas 17-20, una vez que nos hayamos hecho una idea del metabolismo energético (cap. 15) y de la nutrición bacteriana (cap. 16).

2. CICLO CELULAR

Los ciclos celulares se describen generalmente atendiendo a una serie de eventos identificables que se van produciendo en una secuencia fija, de modo que para que se produzca cada uno de ellos hace falta que se complete el anterior.

Ciclo eucariótico

Los eventos clave son la fase S, de síntesis de ADN, y la fase M (mitosis y división celular). Las fases S y G₂ son relativamente constantes en sus proporciones. Cuando se altera la duración del ciclo total (por modificación de la velocidad de crecimiento), lo que cambia es el tiempo de la fase G₁ y, en menor medida, de la fase M.

Ciclo procariótico

Hasta hace unos 20 años se pensaba que los ciclos bacterianos carecían de eventos clave. Ello se debía a que en bacterias no existe mitosis y porque en los medios de cultivo ricos empleados entonces la síntesis de ADN parecía continua durante todo el ciclo.
Pero hoy sabemos que sí existen fenómenos clave, que se pueden poner mejor de manifiesto cuando el crecimiento se estudia en medios menos ricos que permiten sólo crecimientos lentos. Los periodos del ciclo procariótico son:

• fase C (equivalente a la S eucariótica): replicación del ADN cromosómico;
• fase D (equivalente a G₂ + M): se distingue porque su terminación coincide con el final de división celular;
• fase innominada, equivalente a la G₁ eucariótica.

Lo característico del ciclo es que las fases C y D son relativamente constantes, y por lo tanto, cuando disminuye el tiempo de generación (g), lo hace a expensas de la fase "G₁". Por ejemplo, en Escherichia coli, C = unos 40 min, y D = unos 20 min.

2.1 CICLO CELULAR EN FUNCIÓN DEL TIEMPO DE GENERACIÓN

Vamos a estudiar con el ejemplo de E. coli qué ocurre con el ciclo celular a distintos tiempos de generación

Cuando g>C+D	existe fase "G1" (intervalo que precede a la replicación). En estas condiciones podemos observar nítidamente periodos diferenciados entre sí (de síntesis de ADN y de división celular).
Cuando g=C+D	ya no existe G1, y cada ronda de replicación comienza inmediatamente tras la precedente división celular (es decir, cada célula hija recién nacida se embarca inmediatamente en replicar el cromosoma, y una vez que ha terminado de replicarlo, la célula inicia la división celular).
Cuando g	las rondas de replicación de un ciclo se inician antes de que haya terminado la división celular del anterior (superposición parcial entre fases C y D).
Cuando g	ya no se puede detectar fase D como tal. La síntesis de ADN escontinua durante todo el ciclo. Se inician rondas de replicación cromosómica antes de que haya terminado la anterior. Esto se traduce en que los cromosomas muestran un típico patrón de replicación dicotómica y en que dichos cromosomas pasan a cada célula hija ya embarcados en una nueva ronda de replicación.

2.2 CONTROL DE LA REPLICACIÓN DEL ADN CROMÓSOMICO

De lo anterior se deduce que debe de existir algún tipo de acoplamiento entre las ondas de replicación y la división celular.
Nosotros, sobre el esquema que hemos comentado, podemos inferir cuándo se debe de iniciar una nueva ronda siempre que sepamos los valores de g, C y D:
Contamos C+D minutos a partir de g, y entonces podemos prever que la ronda de replicación tendrá lugar g--(C+D) minutos antes de la próxima división celular (o bien, G₁-g minutos si existe periodo G₁).
Pero, por supuesto, la célula no es tan "lista" (no sabe contar hacia atrás en el tiempo) ni tiene el don de la predicción (los humanos tampoco, para la mayor parte de las cosas importantes). La bacteria tampoco sabe "contar hacia adelante", ya que el tiempo de inicio de una ronda de replicación no guarda una relación sencilla con la división celular previa.
Entonces, )cómo se acoplan división celular y replicación cromosómica? Una clave hacia la respuesta a esta pregunta es que la razón (proporción) entre orígenes de replicación y masa celular en el inicio (inmediatamente antes de la replicación) es igual para todas las tasas de crecimiento. Hé aquí un modelo hipotético sobre el mecanismo de coordinación entre ambos eventos del ciclo celular:
El sistema de coordinación detecta la concentración de orígenes de replicación; conforme la bacteria crece, esta concentración va descendiendo, hasta que se alcanza un valor umbral crítico que desencadena una nueva onda de replicación. Ello hace que se doble el número de orígenes. Una ulterior ronda no se pone en marcha hasta que el crecimiento haga de nuevo descender la concentración de orígenes.
Se trataría, pues, de una especie de reloj biológico y "oscilador" que usaría como medida del tiempo el pararámetro de masa celular, volumen, u otro equivalente, de tal modo que la concentración crítica de un factor iniciador o la dilución de un represor servirían para disparar la replicación a una concentración determinada.

2.3 RELACIONES ENTRE VELOCIDAD DE CRECIMIENTO Y TAMAÑO CELULAR

Es fácil comprobar en los cultivos bacterianos que cuanto más rico es un medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generación (g), mayor es el tamaño medio de las células.

1. bacterias creciendo en un medio relativamente pobre (supongamos que en este medio g=60 min, C+D=g);
2. si transplantamos una célula recién dividida procedente del cultivo anterior a un medio más rico (por ejemplo, que permite un tiempo de generación g=35 min) podemos observar que:
1. la primera división ocurre C+D (60 minutos) después; es decir, con un tiempo idéntico al que tenía en el medio anterior;
2. pero como en este medio g=35 min, la iniciación de una nueva ronda de replicación ocurre antes de dicha replicación celular (es decir, C y D se superponen);
3. se observa que se alcanza un nuevo equilibrio, con un tamaño celular mayor que en el medio pobre, y una masa de inicio (tras la división celular) mayor, alterándose igualmente el tiempo de inicio.

2.4 SEGREGACIÓN DE CROMOSOMAS Y PLÁSMIDOS

Existe un mecanismo eficiente que asegura la segregación de los cromosomas bacterianos a las células hijas. Como se recordará, el cromosoma se encuentra unido a la membrana citoplásmica, al parecer a través de un mesosoma. Existen indicios de que durante la replicación, el vértice de la horquilla de replicación va pasando por ese punto de anclaje.
La replicación cromosómica se inicia en una región especial denominada oriC, a partir de la cual se efectúa una replicación bidireccional, hasta que ambas horquillas se encuentran en un punto situado a 180^orespecto de oriC. Cuando el mesosoma llega a ese término de replicación se escinde en dos mesosomas, cada uno de los cuales constituye el punto de anclaje de cada copia del cromosoma. Cuando se forme el septo transversal, cada mesosoma va a parar a cada célula hija, de modo que las copias de los cromosomas quedan segregadas. Parece ser que algunos plásmidos se segregan por este mismo mecanismo.
Así pues, el mesosoma parece actuar como un análogo primitivo del aparato mitótico.

2.5 PRODUCTOS ANÓMALOS DE LA DIVISIÓN CELULAR

Existen diversos tipos de mutantes cuyos fenotipos implican serias alteraciones del proceso de división celular y de replicación o segregación del material genético a las células hijas. Algunos de estos mutantes han encontrado útiles aplicaciones en estudios genéticos y moleculares.
Células sin cuerpos nucleares (= maxicélulas)Determinados mutantes termosensibles son incapaces de iniciar la replicación a temperaturas elevadas, de modo que siguen creciendo en tamaño y se dividen mucho después de que se haya completado la última replicación cromosómica (iniciada a una temperatura más baja, permisiva). El resultado de la división celular a la temperatura no permisiva es que se producen células de tamaño normal, pero sin cromosoma, aunque poseen los demás componentes celulares, incluyendo copias de plásmidos.
Por estos mutantes se puede deducir que no existe una relación directa entre la septación (o sea, la fase D de división celular) y la replicación cromosómica anterior (fase C).
MinicélulasSe producen en ciertos mutantes que forman septos anómalos acéntricos (asimétricos, cerca de un extremo y no en el centro). En las minicélulas tampoco se segrega cromosoma, pero pueden "heredar" copias de plásmidos.
De estos mutantes se deduce otro rasgo del ciclo celular: el lugar habitual donde se produce la septación está programado genéticamente, y esta programación se puede alterar por mutaciones.
Uso de maxicélulas y minicélulas en estudios moleculares y genéticos:Un empleo habitual de estas "células" anómalas en el laboratorio se deriva del hecho de que durante cierto tiempo pueden sintetizar proteínas codificadas por los únicos genes que poseen: los del plásmido o plásmidos que alberguen. Por marcaje radiactivo y electroforesis en gel de proteínas, se detectan unas pocas bandas, correspondientes sólo a las proteínas de los pocos genes existentes, con la ventaja de que no hay interferencia de los cientos o miles de proteínas de la célula normal.

3. MÉTODOS PARA EL ESTUDIO Y MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO A ESCALA INDIVIDUAL

3.1 Por microscopía

Se basan en la observación microscópica de microcultivos a temperatura constante.

• seguimiento de células individuales por microfotografía secuencial
• por inmunofluorescencia: se observa en microscopio de fluorescencia la incorporación de materiales de P.C. o de membrana marcados con algún colorante fluorescente.

3.2 Por obtención de cultivos sincrónicos

Como veremos en el próximo capítulo, en un cultivo bacteriano habitual, las distintas células se encuentran en fases distintas del ciclo celular, es decir, no están sincronizadas. Por lo tanto, del estudio de la población no es posible sacar conclusiones sobre eventos del ciclo celular. Sin embargo, por una serie de procedimientos, es factible producir cultivos sincrónicos, en los que durante cierto tiempo (casi) todas las células están en la misma fase, de modo que tienen la misma edad, el mismo tamaño, y se dividen y replican el cromosoma al mismo tiempo. Entonces, el comportamiento de la población (más fácil de estudiar que el de un solo individuo) es una "imagen ampliada" del individual.
Los principales métodos de obtención de cultivos sincrónicos se basan en seleccionar, a partir de un cultivo estándar no sincrónico, aquellas células que o bien son del mismo tamaño, o bien son de la misma edad. Las técnicas principales son:

• selección por tamaños: se suele recurrir a gradientes de densidad, sobre todo los formados por mezclas de agua normal y agua deuterada (H₂O/D₂O).
• selección por edades: el método más empleado es la selección por filtración (técnica de Helmstetter-Cummings), aunque sólo se puede aplicar a ciertas cepas (en E. colifunciona con la cepa B/r, pero no con la K12).
Procedimiento
• Se filtra un cultivo asincrónico que esté en fase exponencial a través de una membrana de nitrocelulosa: las células se adhieren al filtro.
• Se invierte el filtro.
• Se va pasando medio fresco (=nuevo) precalentado. Cada célula unida al filtro se nutre y crece, y finalmente se divide: una de las células hijas queda unida al filtro y la otra pasa al eluato, que se recoge. En cada momento concreto de esta operación, las células hijas eluidas y recogidas corresponden a células "recién nacidas". Las células eluidas en cada momento concreto (y por lo tanto, de la misma edad) sirven como "fundadoras" de un cultivo sincrónico.
• Obsérvese la cinética de un cultivo "sincrónico" expresada como número de individuos en función del tiempo:
• durante unas pocas generaciones el cultivo es más o menos sincrónico;
• las mesetas indican las fases en que el número de células no varía, porque todas están creciendo en tamaño antes de dividirse;
• las subidas bruscas (casi verticales) en el número de individuos nos indican que todas las células del cultivo se están dividiendo a (casi) el mismo tiempo.

pero la sincronía se va perdiendo paulatinamente, de modo que al cabo de unas generaciones la gráfica se convierte en una recta con pendiente. La explicación estriba en que el tiempo exacto de división, o más concretamente C y D no duran exactamente lo mismo en los distintos individuos. Estas pequeñas variaciones estadísticas se van acumulando, generando desfases cada vez mayores entre células, hasta que la sincronía se pierde irreversiblemente.