Estudios de la microbiología

BIOSÍNTESIS Y CRECIMIENTO DE LA PARED CELULAR

En el capítulo anterior estudiamos la composición química, estructura y funciones de los principales tipos de paredes celulares procarióticas. En este capítulo trataremos un aspecto dinámico del tema de las paredes: cómo se sintetizan los principales tipos de macromoléculas, cómo se ensamblan en la arquitectura global, y cómo se produce el proceso general de crecimiento de la pared, incluyendo el evento particular de formación del septo transversal que marca el "nacimiento" de dos células hijas. Nos concentraremos en la biosíntesis del peptidoglucano, debido a su interés intrínseco y aplicado (sobre este proceso actúan diversos antibióticos, algunos de gran importancia clínica).

• Desde el punto de vista topológico, todas las capas de las envueltas bacterianas (membranas, pared celular) son superficies cerradas sobre sí mismas, físicamente continuas para mantener la integridad y viabilidad de la célula.
• Pero por otro lado, deben de ser susceptibles de expandirse durante el crecimiento por incorporación de nuevos materiales. Además, todos los constituyentes deben crecer coordinadamente e incorporarse en los lugares precisos. Por ejemplo, en el caso de las bacterias Gram-negativas, distintos componentes deben de ir a parar a diferentes localizaciones: periplasma, PG, membrana externa, e incluso medio exterior.
• Durante cada ciclo celular, hay una fase en la que los materiales de las envueltas (y concretamente, de la pared celular que nos ocupa ahora) deben de facilitar la división de la célula en una descendencia de dos células hijas.
• Finalmente, queda el problema de la energía. Los procesos biosintéticos requieren aporte de energía química, pero el ATP y compuestos similares no pueden salir del protoplasto.

Precisamente en este capítulo vamos a ver algunas de las estrategias bioquímicas y moleculares que las bacterias han evolucionado para solventar estos puntos. El proceso en general es similar en Gram-positivas y en Gram-negativas, pero existen diferencias debido a la complejidad adicional representada por la membrana externa de Gram-negativas.
Podemos clasificar las estrategias de biosíntesis de componentes de la P.C. en tres grandes tipos:

• síntesis de la macromolécula en el citoplasma y transporte a través de la membrana. Ejemplo: proteínas de la P.C.
• síntesis de precursores en el citoplasma + ensamblaje parcial en membrana + transporte a la cara externa externa de la membrana + ensamblaje final en el exterior, mediante reacciones que no precisan energía. Ejemplos: síntesis de PG, de ácidos teicoicos, de polisacáridos.
• síntesis de precursores en el citoplasma + ensamblaje completo en la membrana citoplásmica + transporte al exterior. Ejemplo: síntesis del LPS.

1 BIOSÍNTESIS DE PROTEÍNAS DE PARED CELULAR | a Contenidos

Las proteínas de la P.C., tanto las estructurales como las enzimáticas del espacio periplásmico, se sintetizan por polisomas asociados a la cara interna de la membrana citoplásmica.
Las proteínas hidrofóbicas asociadas a la membrana externa (y aquellas que deben exportarse al periplasma) se sintetizan como pre-proteínas provistas en su extremo N-terminal de una secuencia líder (también llamada péptido-señal), con una porción de carácter hidrofóbico. Conforme el ribosoma va sintetizando la proteína, la secuencia líder se ancla a la membrana, y facilita el paso del resto de la proteína naciente al otro lado de la membrana. Esta proteína naciente no puede en principio plegarse tridimensionalmente, debido a la actuación de un complejo (complejo de reconocimiento de la señal). Una vez que toda o casi toda la proteína ha pasado al otro lado de la membrana, actúa una peptidasa del líder (localizada en el lado exterior de la membrana) que rompe la secuencia-señal. Esto facilita a su vez el que la proteína adquiera rápidamente su conformación madura y que, en su caso, interaccione con otros componentes de la pared.
Aquellas proteínas que en su forma madura están modificadas químicamente (por unión a azúcares, ácidos grasos o glicéridos) sufren estas modificaciones a nivel de membrana citoplásmica.
La lipoproteína de Braun se sintetiza a partir de una pre-proteína con péptido-líder, que se rompe a su paso por la membr. citopl., siendo modificado su extremo N-terminal a glicerol-tioéter. De esta forma se puede insertar, por dicho extremo en la membrana externa. Como ya dijimos, una tercera parte de la LPP de Braun se une covalentemente al PG, en una reacción de transpeptidación: el enlace entre la D-ala terminal(4) y el meso-DAP(3) del tetrapéptido del PG se sustituye por el enlace entre dicho meso-DAP y el grupo amino de la lisina C-terminal de la LPP.
Las porinas son una excepción al mecanismo de translocación de proteínas descrito arriba: estas proteínas adquieren su configuración definitiva a nivel de la membrana citoplásmica. Parece ser que alcanzan la membrana externa a través de las denominadas zonas de adhesión o junturas de Bayer.

2. BIOSÍNTESIS DEL PEPTIDOGLUCANO DE MUREÍNA | a Contenidos

Consta de 4 etapas:

1. Síntesis de precursores solubles en el citoplasma.
2. Estos precursores son transferidos a un transportador lipídico situado en la membrana citoplásmica (un poliisoprenol fosfatado llamado undecaprenil-fosfato), donde se forman las unidades disacarídicas con el pentapéptido.
3. Las unidades disacarídicas se polimerizan en cadenas lineales fuera de la membrana, pero aún unidas al undecaprenil-fosfato de la membrana.
4. Unión del polímero lineal así formado al peptidoglucano preexistente en la pared celular, por entrecruzamiento de (al menos) parte de sus péptidos respectivos.

A estas etapas hay que añadir una fase adicional de regeneración del transportador lipídico, una vez que ha cumplido su misión, para que pueda ser operativo en un nuevo ciclo de síntesis.
Veamos, pues, en más detalle, cómo ocurre este interesante proceso:
Fase 1: Desde glucosamina-1-P hasta UDP-NAM-pentapéptido, todo el ciclo ocurre en el citoplasma, catalizado por enzimas solubles. Se observará que los azúcares (tanto NAM como NAG) se activan bajo la forma de nucleósido-difosfatos (concretamente, de uridín difosfato, UDP). En general, los monosacáridos que han de incorporarse a polímeros de pared celular bacteriana se activan mediante su unión con nucleósidos-fosfato.
La NAG se activa por reacción del NAG-1-P con UTP, que libera pirofosfato (PP) y produce NAG-UDP.
Observar cómo se produce la síntesis del NAM activado: el grupo enol-pirúvico del fosfo-enol-pirúvico (PEP) se transfiere al -OH (3) de la NAG, y enseguida ocurre una reducción enzimática (con NADPH₂ como donador) que genera el 3-O-D-lactil-éter de la NAG, es decir, el NAM (por supuesto, unido siempre al UDP).
Luego se va produciendo la adición secuencial y ordenada de los distintos aminoácidos (en reacciones que requieren energía e iones Mn⁺⁺).
Observar que no se produce un tetrapéptido, sino un pentapétido. El último paso de adición de aminoácidos es la unión del dipéptido D-alanil-D-alanina, que se ha sintetizado en dos fases:

• una racemasa convierte la L-ala a D-ala;
• creación de enlace peptídico entre dos D-ala.

Fase 2: El UDP-NAM-pentapéptido se transfiere ahora a un transportador de membrana, llamadoundecaprenil-fosfato (que abreviaremos como Lip-P).
El undecaprenil-fosfato es un poliisoprenoide de 55 átomos de C (C₅₅, derivado de la repetición 11 veces de la unidad isoprenoide, con un fosfato terminal). Antiguamente se le conocía con el nombre de bactoprenol, pero esta denominación ha caído en desuso desde que se sabe que no es exclusivo de bacterias. El bactoprenol permite el transporte y ensamblaje de sustancias que, como los azúcares, son hidrofílicas, y no podrían pasar por sí mismas la barrera hidrofóbica de la membrana.
Una vez que el NAM-pentapétido está unido al undecaprenil (por medio de pirofosfato) se produce la unión con la NAG, en una reacción de transglucosidación que genera el enlace ß(1 --> 4) entre NAG-NAM. Por lo tanto, se obtiene: Lip-P-P-MAM(pentapéptido)-NAG.

En esta situación es cuando se producen la modificaciones que ya estudiamos en la estructura básica del PG. Por ejemplo: en Staphylococcus aureus el grupo -COOH del D-glutámico en posición (2) es amidado (pasa a --CO-NH₂. Por otro lado, se introducen los puentes peptídicos, que en el caso de esta bacteria consisten en una pentaglicina, que se une al grupo amino terminal de la L-Lys en posición (3).

Fase 3: Polimerización de varias unidades disacarídicas: ello se logra en una reacción detransglucosidación. Consiste en la unión de cada unidad disacarídica (con su pentapéptido) unida a su respectivo Lip-P-P, con el extremo libre (reductor) de una cadena preexistente que a su vez está unida a otra molécula de Lip-P-P.
En el proceso se libera uno de los Lip-P-P (o sea, el undecaprenil, pero en forma pirofosforilada). Sobre este Lip-P-P actúa una fosfatasa específica, que elimina el fosfato terminal, regenerándose el undecaprenil-fosfato, que queda dispuesto para otro ciclo como el descrito.

Fase 4: El polímero surgido de la fase anterior es una cadena lineal de PG sin entrecruzar, y unido aún al transportador lipídico de membrana. Ahora este polímero naciente (con sus pentapéptidos) reacciona, por transpeptidación, con un PG aceptor preexistente. En esta reacción se ven implicados el grupo C=O de la D-ala (4) del PG naciente y el grupo -NH₂ libre del diaminoácido (3) del PG aceptor (o del último aminoácido del puente peptídico).

Esto es lo mismo que decir que el enlace peptídico entre D-ala (4) y D-ala (5) del PG naciente se ve sustituido por otro enlace peptídico, entre dicha D-ala (4) y el diaminoácido del PG naciente.

La energía para esta reacción la suministra la hidrólisis concomitante del enlace peptídico entre las dos D-ala terminales. Es decir, en cada reacción de transpeptidación se libera una D-ala, correspondiente a la que ocupaba la posición (5).
Ya dijimos en el capítulo anterior que no todos los tetrapéptidos participan en entrecruzamientos. Las D-ala terminales (en 5) de los péptidos no implicados en tales entrecruzamientos son eliminadas por una enzima llamada D-D-carboxipeptidasa. Esta enzima explica no sólo que en el PG maduro existan tetrapéptidos (y no los pentapéptidos originales), sino también la existencia de tripéptidos.
Muchas bacterias controlan el grado de entrecruzamiento de su PG maduro. Incluso algunas pueden eliminar totalmente muchos de los péptidos originalmente unidos al NAM, mediante enzimas conocidas genéricamente con el nombre de autolisinas. Así por ejemplo, Micrococcus luteus -un coco Gram-positivo-, merced a su actividad NAM-L-ala-amidasa, presenta un PG que no está entrecruzado en un 50-70%.

Antibióticos que actúan a nivel de la biosíntesis de peptidoglucano:Estos antibióticos tienen un efecto bactericida sobre bacterias en crecimiento. Ello se debe a que, al inhibir determinados pasos del ciclo de síntesis y ensamblaje del PG, provocan la acumulación de precursores de dicho PG, lo que a su vez desencadena la activación de las autolisinas de la bacteria, que degradan el PG y que finalmente provoca la lisis celular (en medios hipotónicos), por entrada masiva de agua a la célula.

1. Fosfomicina: actúa inhibiendo la formación del 3-O-D-lactil-éter de la NAG (o sea, del NAM). Parece ser que la base molecular estriba en la semejanza estructural entre el este antibiótico y el PEP (es decir, la fosfomicina es análogo estructural del PEP, lo que lleva a la inactivación de la enzima correspondiente a esta reacción).
2. Cicloserina: Se comporta como análogo estructural de la D-alanina, por lo que inhibe la actuación de la racemasa que convierte la L-ala a D-ala, así como de la reacción de unión de dos D-ala.
3. Vancomicina y ristocetina: inhiben la segunda transglucosidación (fase 30), es decir, la unión de diversas unidades disacarídicas.
4. Bacitracina: se une al undecaprenol-pirofosfato, bloqueando su desfosforilación, e impidiendo por lo tanto, la regeneración del transportador de membrana.
5. Antibióticos ß-lactámicos (p. ej.: penicilinas, cefalosporinas): inhiben la reacción de entrecruzamiento por transpeptidación. (Estudiaremos su mecanismo de acción en más detalleen el capítulo de Quimioterápicos y Antibióticos).

3. BIOSÍNTESIS DE LOS ÁCIDOS TEICOICOS | a Contenidos

Los ácidos glicerol- y ribitol-teicoicos se sintetizan según el siguiente modelo:
Fase 1: En el citoplasma, activación de los polioles por unión a nucleósidos difosfatos:

D-ribitol-1-P + CTP -------> CDP-ribitol + PP

Fase 2: Generación del esqueleto de poliol-P, a nivel de la membrana citoplásmica, por sucesivas reacciones de unidades de CDP-ribitol con lipoteicoico (LTC):

CDP-ribitol + LTC (ribitol-P)_n -------> LTC (ribitol-P)_n+1 + CMP

Es decir, los LTC actúan simultáneamente como aceptores de nuevas unidades de poliol-P y comotransportadores de las cadenas nacientes.
Los sustituyentes glucídicos y/o de D-ala se añaden ulteriormente a los -OH del poliol, después de la polimerización.
Fase 3: Unión covalente de los teicoicos así sintetizados con el PG naciente a través de la unidad de enlace, interviniendo como transportador el undecaprenil-P .

4. BIOSÍNTESIS DEL LIPOPOLISACÁRIDO | a Contenidos

El lípido A (junto con la parte proximal del núcleo) se sintetiza en la membrana citoplásmica, por unión de ácidos grasos y KDO a la unidad de glucosaminil-glucosamina.
El resto del LPS se sintetiza y se ensambla en la membrana citoplásmica, por medio de dos procesos paralelos:

• Una ruta va produciendo las cadenas laterales repetitivas polisacarídicas, que se encuentran unidas a una unidad de undecaprenil-P.
• La otra ruta genera (por adición secuencial de los azúcares pertinentes) el oligosacárido medular, usando como cebador y como transportador de membrana al lípido A.

Ambas rutas acaecen en el lado interno (citoplásmico) de la membrana citoplásmica. Una vez sintetizada la cadena lateral (unida a undecaprenil-P) y el oligosacárido medular (unido al lípido A), pasan a la cara externa (periplásmica) de la membrana citoplásmica, merced a la translocación de los respectivos transportadores.
Finalmente, una enzima específica favorece la unión de la cadena específica polisacarídica al oligosacárido medular-lípido A. Las distintas moléculas de LPS se atraen entre sí, y pasan a la cara externa de la membrana externa (su localización definitiva) merced a las zonas de adhesión (junturas de Bayer) donde las dos membranas coalescen.
Veamos en más detalle la síntesis del LPS:
4.1 Síntesis del Lípido A:

1. La glucosamina-1-P es convertida en dihidroximiristil-glucosamina-1-P (por adición de dos restos de hidroximirístico al N del C-2 y en el C-3, respectivamente).
2. Reacción con UDP-dihidroximiristil-glucosamina-1-P, para generar el disacárido N-ß-hidroximiristil-glucosaminina-P.
3. Unión de arabinosamina al C-4' y de fosforil-etanolamina al C-1, lo que da un lípido A aún sin esterificar.
4. Esterificación con ácidos grasos:

• láurico
• palmítico
• mirístico

De esta forma se obtiene el lípido A esterificado en todos sus grupos hidroxilo originales.
4.2 Síntesis del oligosacárido medular:Los azúcares se van añadiendo secuencialmente al lípido A. La secuencia de adición viene fijada por el reconocimiento específico que realizan las enzimas tanto de la molécula aceptora (lípido A-secuencia "x" previa) como del donador nucleotidil-azúcar.
Se desconocen aún cuáles son los precursores nucleotídicos de las heptosas.
Los precursores de las hexosas derivan del UTP, que genera la forma activa UDP-hexosa.
4.3 Síntesis de las cadenas específicas laterales (antígeno O)

1. Cada unidad repetitiva se ensambla en forma de un intermediario undecaprenil-P-unidad, a partir de los correspondientes precursores nucleotídicos solubles de los azúcares (p. ej., UDP-galactosa, TDP-ramnosa, GDP-manosa, CDP-abecuosa).
2. Las unidades repetitivas se polimerizan entre sí, con liberación de undecaprenil-pirofosfato:

Lip-P-P-{unidad} + Lip-P-P-{unidad}_n -----> Lip-P-P-{unidad}_n+1 + Lip-P-P

3. El polímero de la cadena lateral se transfiere, desde el Lip-P-P que lo transportaba, hasta el extremo del oligosacárido medular unido a su vez al lípido A:
   Lip-P-P-{cad. lat} + LipA-oligosac ----> LipA-oligosac-{cad. lat.} + Lip-P-P.
4. Regeneración del undecaprenil-P por medio de la acción de la fosfatasa específica del Lip-P-P.

5. CRECIMIENTO DE LA PARED CELULAR | a Contenidos

Como ya dijimos al comienzo de este tema, aunque la P.C. es una estructura cerrada y sin solución de continuidad, debe permitir su expansión (crecimiento), y esto supone que se han de romper ciertos enlaces si se quiere que el nuevo material se ensamble con el preexistente mediante nuevas uniones.
El crecimiento y septación del peptidoglucano están basados en la actividad controlada y localizada en puntos determinados, de una batería de autolisinas, especialmente las dotadas de actividad transglucosidasa y/o transpeptidasa. Debido a que estas enzimas son los sitios de acción de las penicilinas (y otros antibióticos ß-lactámicos), se les conoce también con el nombre de PBP (depenicillin-binding proteins; véase la tabla 6.1).

TABLA 6.1: Propiedades de las PBPs de Escherichia coli

núm. de moléculas por cél.	actividad enzimática	PBP	posibles funciones
100 cada una	transglusosidasa/transpeptidasa	PBP1a, 1b	síntesis del PG durante la enlongación celular
20	transpeptidasa	PBP2	crecimiento de la forma bacilar
50	transglucosidasa/transpeptidasa	PBP3	síntesis del PG durante la septación (tabique)
110	D-D endopeptidasa/D-D carboxipeptidasa	PBP4	hidrólisis de los entrecruzamientos durante la elongación
1800	D-D carboxipeptidasa	PBP5	destrucción del PG no entrecruzado

5.1 CRECIMIENTO DE LA PARED EN UNA BACTERIA GRAM-NEGATIVA: Escherichia coli

El crecimiento de la pared en E. coli se puede considerar dividido en dos fases:

1. Crecimiento en longitud (elongación), mientras la célula crece en tamaño.
2. Producción del tabique transversal (septación), que conduce a la formación de dos células hijas.

Elongación

• Las PBPs 1 son las encargadas de la elongación de las cadenas de PG naciente (por transglucosidación de las unidades disacarídicas) y simultáneamente, por transpeptidación, logran el entrecruzamiento.
• Las cadenas nacientes del PG se intercalan en la parte cilíndrica del sáculo de PG gracias a que las PBP4 y PBP5 cortan enlaces del PG preexistente. La PBP2 interviene aquí también para transpeptidación. La cadena de PG se va elongando unidireccionalmente alrededor de la circunferencia de la célula. Se calcula que existen unos 200 sitios de inserción de nuevo material en cada célula, dispersos de forma más o menos uniforme por toda la superficie de la célula. La maquinaria biosintética tarda 8 minutos en completar cada circunferencia de elongación.

Formación del tabique transversalLa división de la bacteria por fisión binaria simétrica se logra por medio de una invaginación circular de las envueltas (membrana citoplásmica y peptidoglucano) en mitad de la célula madre. En el inicio de este proceso tiene un papel esencial la proteína FtsZ.
FtsZ es una proteína imprescindible, presente tanto en eubacterias como en arqueobacterias, que muestra parecido con las tubulinas eucarióticas. Al parecer, al igual que las tubulinas, la FtsZ se une a GTP, con lo que se promueve su polimerización. Bajo control del ciclo celular, la FtsZ se ensambla poco antes de la división en el centro de la célula, formando un "anillo citocinético" en el lado citoplásmico de la membrana celular. Existen indicios fuertes de que la formación de este anillo de FtsZ señaliza el sitio por donde se producirá la división y se activará el crecimiento del peptidoglucano del tabique transversal.

En las fotografías a microscopio electrónico se ve cómo bajo la invaginación de membrana que constituye la "avanzadilla" del septo, se localizan las moléculas de FtsZ.

La hipótesis señala que los polímeros de FtsZ se van "contrayendo", de modo que "tiran" de las envueltas hacia el interior, provocando la típica invaginación alrededor del centro del bacilo, y que simultáneamente, la FtsZ provoca la activación de la PBP3, que es una transglucosidasa/transpeptidasa específica del tabique transversal.
A microscopio electrónico se observa que este tabique está formado por dos láminas de PG (densas a los electrones) separadas entre sí por otra transparente. El final de la división ocurre como consecuencia de la invaginación de la membrana externa entre las dos láminas de PG.
¿Cómo se ensambla la membrana externa con relación al PG? Parece ser que esta membrana se ensambla en buena medida por procesos espontáneos guiados por interacciones entre el LPS y proteínas, sirviendo el PG subyacente como andamio que facilita el montaje de toda la estructura. Parece ser que las zonas de adhesión (junturas de Bayer) son importantes para la correcta colocación de LPS y proteínas de la membrana externa.
Recientemente se han descubierto zonas especiales donde la membrana externa contacta con la citoplásmica. Se denominan anillos perisépticos, debido a que rodean la superficie de la bacteria a ambos lados del septo transversal Se desconoce aún su papel, pero parece que delimitan zonas distintas de las envueltas de la bacteria, y algunos autores proponen que participan en la segregación de los cromosomas.

5.2 CRECIMIENTO Y SEPTACIÓN EN UNA BACTERIA GRAM-POSITIVA:Enterococcus faecalis

A diferencia de lo visto en E. coli, en el enterococo (Enterococcus faecalis) el crecimiento del PG no es difuso, sino zonal, comenzando en el centro (zona ecuatorial) y avanzando hacia afuera.
Véase en la figura el experimento de marcado de P.C. con anticuerpos fluorescentes, con ulterior seguimiento del marcaje al microscopio:

• tras unos 15 minutos después del marcado se observa que existe una banda ecuatorial oscura (no marcada, por lo tanto está constituida por material nuevo recién insertado), mientras que los polos de las células siguen enteramente marcados.
• Tras 30 o 60 minutos observamos células enteramente sin marcar, intercaladas entre células con uno de sus polos marcados.

El proceso se puede describir así:

1. En la célula adulta antes de la división aparece una banda ecuatorial donde la P.C. se hace más gruesa.
2. Debajo de esta zona engrosada (hacia el interior del citoplasma) se va depositando nuevo material, lo que marca el inicio de la formación del tabique transversal. Enseguida aparece una muesca en la banda ecuatorial.
3. El tabique, con un grosor doble al de la pared celular de la superficie celular, sigue avanzando, hasta que...
4. ... se completa. Simultáneamente a los pasos 31 y 41 la zona de nueva síntesis de P.C. superficial alcanza el ecuador de las celúlas hijas nacientes.
5. El tabique completo de doble grosor va siendo escindido en dos mitades desde el exterior hacia el centro, por acción de autolisinas. De esta forma se le adjudica a cada célula hija la nueva pared correspondiente a uno de sus polos (el otro procede, intacto, de la célula madre).

Véase igualmente la figura que muestra en más detalle la formación del tabique. La idea que se saca del proceso en esta bacteria es que posee una sola zona de crecimiento de PG, con dos regiones de deposición de nuevo material: la región del tabique transversal propiamente dicho, y la región adyacente, ya en la superficie celular, responsable de la expansión de la pared periférica, a ambos lados del tabique.

6. PROTOPLASTOS Y ESFEROPLASTOS | a Contenidos

Mediante procedimientos de laboratario se puede lograr eliminar total o parcialmente la pared celular bacteriana. Se denominan protoplastos las células bacterianas a las que se ha desprovisto totalmente de pared celular, mientras que esferoplastos son aquellas células bacterianas que poseen restos de pared.
Obtención. Existen dos posibles métodos alternativos:

1. Por destrucción del entramado del PG mediante enzimas líticas (lisozima, peptidasas). En el caso de bacterias Gram-negativas, previamente hay que desorganizar la membrana externa para hacerla permeable a estas enzimas. Ello se logra usando el quelante EDTA y/o sometiendo las células a bajas temperaturas.
2. Por inhibición de la formación de nuevo PG en las células en crecimiento, tratándolas p. ej., con penicilina. Si se parte de un mutante auxotrofo para un componente del PG basta hacer crecer a la bacteria en un medio carente de dicho componente.

Estos métodos permiten:

• en el caso de Gram-positivas, la desorganización total de su pared, por lo que se obtienenprotoplastos;
• en el caso de las Gram-negativas, quedan restos de membrana externa y de peptidoglucano atrapados en ella, por lo que se obtienen esferoplastos.

En ambos casos, protoplastos y esferoplastos pueden revertir a la forma normal eliminando el tratamiento (retirando la lisozima, o la penicilina).
Protoplastos y esferoplastos son formas osmóticamente sensibles debido precisamente a que al no existir o estar desorganizado parcialmente el PG, ya no se pueden contrarrestar las fuerzas de presión osmótica existentes en los medios hipotónicos en que normalmente se cultivan o suspenden las bacterias. Por lo tanto, si se quieren obtener suspensiones estables de estas formas, hay que obtenerlas en medios o soluciones isotónicos o ligeramente hipertónicos, para evitar su lisis:

• soluciones de NaCl 0,25-0,5 M;
• sorbitol o sacarosa 0,1-0,5 M;
• polietilénglicol (PEG) al 7,5%.

En estos medios los protoplastos y esferoplastos poseen formas esféricas, independientemente de la forma que tuviera la bacteria con pared de que proceden.
Se emplean en varios aspectos de investigación básica:

• método suave para luego obtener extractos libres de células y fracciones subcelulares.
• en algunas bacterias, método para hacerlas permeables al ADN, en experimentos de transformación genética.
• para realizar fusión entre protoplastos de diferentes cepas de la misma especie e incluso entre especies distintas. Se trata de un método de obtención de "recombinantes somáticos" usado para determinados estudios genéticos en bacterias que no tengan sistemas naturales de transferencia genética.

7. FORMAS L | a Contenidos

Son células bacterianas carentes total o casi totalmente de P.C., con formas pleomórficas, irregulares y globulares, que se producen de forma espontánea en algunas especies bacterianas (p. ej.,Streptobacillus moniliformis) cuando se cultivan en medios a base de suero (que son hipertónicos).
Las colonias de las formas L naturales son muy características: en "huevo frito", bifásicas.
Se pueden obtener de forma inducida formas L en diversas bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, tratándolas con penicilina en medios hipertónicos.
Las formas L inestables se generan por tratamientos breves, y pueden revertir con frecuencia a la forma normal con pared. Poseen algo de PG, aunque éste se encuentra alterado respecto al PG de la célula normal.
Las formas L estables se producen por tratamientos más prolongados, y no suelen revertir al tipo normal. La mayoría carecen totalmente de PG.
Así pues, en las formas L el PG ha sido eliminado totalmente o parcialmente, pero de manera que ya no pueden servir de aceptor de nuevo PG.

LA MEMBRANA CITOPLÁSMICA Y EL TRANSPORTE DE NUTRIENTES

MEMBRANA CITOPLÁSMICA | a Contenidos

1.1 COMPOSICIÓN QUÍMICA

La membrana citoplásmica bacteriana es la estructura de tipo bicapa proteo-lipídica que delimita al protoplasto. Su proporción proteínas: lípidos es superior a la de las membranas celulares eucarióticas, llegando a alcanzar valores relativos de 80:20.

Las membranas procarióticas, por lo general carecen de esteroles

Las membranas procarióticas, a diferencia de las de eucariotas, carecen de esteroles (con las salvedades de Oxyphotobacteria, ciertas bacterias metilotrofas, y de los Mollicutes). Pero en cambio, en muchas bacterias existe una peculiar clase de compuestos policíclicos, denominados hopanoides (triterpenoides pentacíclico) que parecen condicionar parte de la rigidez de las membranas citoplásmicas.

Lípidos . Abundan sobre todo los fosfolípidos derivados del ácido fosfatídico:

• fosfatidiletanolamina
• fosfatidilglicerol
• cardiolipina

En bacterias Gram-positivas, además se encuentran glucolípidos y glucofosfolípidos.

La composición y proporción concretas de los distintos tipos de lípidos son variables entre distintas cepas bacterianas, y dentro de cada cepa, en función de las condiciones de cultivo (temperatura, pH, etc.).

Los ácidos grasos esterificados con el glicerol en los fosfolípidos son principalmente:

1. saturados, como p. ej.:
   1. palmítico
   2. mirístico
   3. de cadena ramificada (muy frecuentes en muchas bacterias Gram-positivas)
2. monoinsaturados (sobre todo en Gram-negativas), como p. ej.:
   1. palmitoleico
   2. cis-vaccénico

A diferencia de eucariotas, no existen ácidos grasos poliinsaturados, con la excepción de las Oxifotobacterias. Este grupo de bacterias fotosintéticas tiene, además, la capacidad de modificar mediante desaturasas el grado de saturación de sus ácidos grasos, lo que representa un mecanismo adaptativo frente a cambios de temperatura.

Las bacterias pueden modificar la proporción entre ácidos grasos insaturados y saturados, con objeto de mantener un estado de fluidez adecuado en la membrana, como adaptación a cambios de temperatura: a altas temperaturas, aumenta la proporción de ácidos grasos saturados, mientras que a bajas, aumenta la de los insaturados. Las bacterias psicrófilas (amantes del frío) presentan casi todos sus ácidos grasos de tipo insaturado.

En Arqueas, en lugar de los habituales lípidos a base de ésteres de ácidos grasos con glicerol, existenlípidos a base de éteres de alcoholes de cadena larga con glicerol (p. ej., difitanil-glicerol-diéteres).Los alcoholes suelen ser derivados poliisoprenoides. Este tipo de membranas son más rígidas que las de eubacterias. Incluso existen arqueobacterias con membranas a partir de tetrafitanil-diglicerol-tetraétereres, que consituyen bicapas monomoleculares.

Como ya vimos en el tema anterior, la membrana citoplásmica alberga un transportador lipídico de tipo politerpenoide, llamado undecaprenil-fosfato, presente en pequeña cantidad (<1 b="" dan="" igualmente="" nbsp="" se="">quinonas isoprenoides

 (como la menaquinona o la ubiquinona) que, como veremos en otro capítulo, participan en cadenas de transporte de electrones. En algunas bacterias existen igualmente variedades de pigmentos carotenoides.

Proteínas: Constituyen la mayor parte de la membrana bacteriana (hasta el 80% en peso seco). Existe una gran variedad de tipos de proteínas en una misma bacteria (hasta 200), pero la composición y proporción concreta varía según las condiciones de cultivo. Según su localización en la membrana, y su grado de unión con la porción lipídica, se distingue entre:

• proteínas integrales de membrana (= endoproteínas): son proteínas estrechamente unidas a la membrana, por lo general atravesadas en plena bicapa lipídica. Son difíciles de extraer, teniéndose que recurrir a detergentes y/o disolventes orgánicos para separarlas respecto de los lípidos.
• Proteínas periféricas (= epiproteínas): unidas a la superficie de la membrana, de forma más débil, por lo que son más fáciles de extraer y purificar. Incluso algunas establecen contactos sólo transitorios con la membrana.

1.2 ESTRUCTURA

Métodos de observación y estudio

A microscopio óptico, se recurre a la tinción con Azul Victoria. A microscopio electrónico, en cortes ultrafinos, se observan una estructura de unos 7 nm de grosor, con dos capas externas densas a los electrones limitando una capa central transparente.

Los estudios mediante difracción de rayos X y de resonancia magnética nuclear (RMN) demuestran una estructuración básica a base de cadenas de fosfolípidos en una bicapa, según se describe a continuación.

Estructura

Consiste en una bicapa lipídica, con los grupos polares (hidrófilos) hacia afuera, y las cadenas hidrofóbicas de ácidos grasos (o, en el caso de Arqueobacterias, de alcoholes) hacia adentro, ajustándose al modelo de mosaico fluido de Singer y Nicholson. Inmersas en esta bicapa se encuentran las abundantes proteínas, que pueden moverse lateralmente en el mosaico de moléculas de lípidos, igualmente dotados de una rápida movilidad. Parece ser que no existe movilidad de lípidos entre las dos capas.

La membrana citoplásmica es asimétrica (aunque no tanto como la membrana externa de Gram-negativas). Esto se traduce en el hecho de que muchos de los procesos que tienen lugar en la membrana sean vectoriales (tengan una dirección determinada).

 1.3 FUNCIONES DE LA MEMBRANA CITOPLASMICA

La membrana citoplásmica de los procariotas es una notable estructura multifuncional (como uno podría esperar de la constatación del gran número de tipos de proteínas), siendo el sitio donde se producen muchos procesos metabólicos complejos, en un grado desconocido en el resto del mundo vivo.

De manera telegráfica, se puede decir que básicamente, la membrana citoplásmica bacteriana es unabarrera osmótica (que mantiene constante el medio interno), pero que merced a sistemas de transporte, permite selectivamente el paso de sustancias entre el exterior y el interior, y que interviene, además, en procesos bioenergéticos, en la biosíntesis de componentes de membrana, de pared y de cápsulas, y en la secreción de proteínas. Desglosaremos brevemente estos diversos tipos de papeles de la membrana.

Participación en procesos bioenergéticos (obtención de energía)

Contiene todos los componentes requeridos para la transducción de energía y la producción de ATP, por procesos respiratorios. En el caso de una bacteria quimiotrofa, esto incluye:

• deshidrogenasas
• cadenas de transporte de electrones (con quinonas, citocromos, etc.)
• ATP-asas (ATP sintasas/hidrolasas)

Algunas bacterias fotosintéticas (de las Anoxifotobacterias) también incluyen este tipo de componentes en la membrana citoplásmica.

En el tema 15 veremos en más detalle cómo explica la teoría quimiosmótica de Mitchell el acoplamiento entre el funcionamiento de las cadenas de transporte electrónico (o de la ATP-hidrolasa) y la generación de un gradiente de protones a través de la membrana (potencial electroquímico o fuerza protón-motriz), el cual a su vez puede:

• generar ATP (desarrollo de un trabajo químico)
• promover transporte de ciertos nutrientes (trabajo osmótico)
• promover movimiento flagelar (trabajo mecánico).

Participación en biosíntesis de polímeros de las envueltas. Como ya hemos visto en temas anteriores(capítulo 6), la membrana alberga transportadores (como el undecaprenil-P) y enzimas relacionados con fases de la biosíntesis de polisacáridos de la cápsula, peptidoglucano, ácidos teicoicos y teicurónicos y lipopolisacárido. Igualmente en ella se localizan los enzimas implicados en la síntesis de los lípidos de la propia membrana.

Participación en la secreción y modificación postraduccional de las proteínas cuya localización final es extraprotoplástica. Esto ya lo vimos en referencia a las proteínas de la pared, y lo mismo es aplicable a proteínas secretadas al medio (recuérdese lo dicho sobre los polisomas asociados a la cara interna de la membrana, y cómo el complejo de reconocimiento de señal colaboraba en el paso de la proteína a través de la membrana).

Punto de anclaje del cromosoma y de algunos plásmidos. Como veremos, sigue estando debatido si un tipo de invaginación de la membrana, llamado mesosoma (ver más adelante, en este capítulo,apartado 3.1) es o no un artefacto, pero parece fuera de duda que el cromosoma se ancla de alguna manera a la cara interna de la membrana (sea a los mesosomas, o como proponen otros, a la cara interna de los anillos perisépticos). En la zona de anclaje parecen residir algunos de los enzimas encargado de la replicación. La membrana tiene igualmente un papel en la separación (segregación) de las dos copias del cromosoma replicado a las células hijas.

Barrera selectiva: Mantiene la constancia del medio interno (impidiendo la salida de iones, metabolitos y macromoléculas), pero simultáneamente permite o promueve activamente la entrada de nutrientes y la salida de los productos de desecho. Esta función de transporte es la que ocupará la siguiente sección.

2. TRANSPORTE DE NUTRIENTES | a Contenidos

Tradicionalmente se viene considerando tres métodos principales de transporte de sustancias a través de la membrana:

• transporte pasivo inespecífico (= difusión simple);
• transporte pasivo específico (= difusión facilitada);
• transporte activo.

2.1. TRANSPORTE PASIVO INESPECÍFICO O DIFUSIÓN SIMPLE

Este transporte consiste en la difusión pasiva de ciertas sustancias para las que la membrana es impermeable, debido a la diferencia de concentración (DC) a ambos lados de dicha membrana. Aparte de esta diferencia de concentración, en la difusión pasiva influyen:

• la constante de permeabilidad (P), es decir, el grado de permeabilidad de la membrana a la sustancia en cuestión;
• el área o superficie total (A) a través de la que se produce el transporte.

Las membranas citoplásmicas son impermeables en sí mismas a la mayor parte de las moléculas. Sólo se da en el caso de O₂, CO₂, NH₃, agua y otras pequeñas sustancias polares no ionizadas.

La difusión simple se produce por el paso de estas sustancias a través de poros inespecíficos de la membrana citoplásmica.

2.2 TRANSPORTE PASIVO ESPECÍFICO O DIFUSIÓN FACILITADA

Es un proceso que permite el paso de compuestos por difusión a través de transportadores estereoespecíficos y (al igual que en el caso anterior) sobre la base de un gradiente de concentración (en la dirección termodinámicamente favorable).

El transportador suele ser una proteína integral de membrana (permeasa), cuya conformación determina un canal interior, y por el cual un determinado sustrato puede alcanzar el interior, sin gasto de energía. Se piensa que cuando el soluto se une a la parte de la permeasa que da al exterior, esta proteína sufre un cambio conformacional que libera la molécula en el interior. La difusión facilitada exhibe propiedades similares a las de las reacciones enzimáticas:

• Especificidad de sustrato: cada permeasa transporte un solo tipo de sustratos químicamente parecidos.
• Cinética de saturación de tipo Michaelis-Menten, es decir, la velocidad de transporte aumenta con la concentración de sustrato, hasta un valor límite (V_max) por encima del cual ulteriores aumentos del soluto no aumentan dicha velocidad (debido a que todas las porinas disponibles están ya totalmente ocupadas):

Velocidad de entrada: V_ent = V_máx · [S_ext] /(K_m + [S_ext])
Velocidad de salida: V_sal = V_máx · [S_int] /(K_m + [S_int])

Aunque este sistema de transporte es muy común en eucariotas, es muy raro encontrarlo en bacterias. La explicación evolutiva es que los procariotas suelen vivir en ambientes con pocas concentraciones de nutrientes, y por lo tanto no es frecuente que se den gradientes adecuados. Una de las pocas excepciones la constituye el glicerol, que es transportado por difusión facilitada en una amplia gama de bacterias, tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Conforme el glicerol entra, es rápidamente convertido a glicerol-fosfato; por lo tanto, la concentración interna de glicerol como tal es prácticamente nula, lo que facilita esta difusión incluso a bajas concentraciones exteriores de esta sustancia.

2.3 TRANSPORTE ACTIVO

Consiste en el transporte de sustancias en contra de un gradiente de concentración, lo que requiere un gasto energético. En la mayor parte de los casos este transporte activo (que supone un trabajo osmótico) se realiza

• a expensas de un gradiente de H⁺ (potencial electroquímico de protones) previamente creado a ambos lados de la membrana, por procesos de respiración y fotosíntesis;
• por hidrólisis de ATP mediante ATP hidrolasas de membrana (F₁F₀)

Los sistemas de transporte activo son los más abundantes entre las bacterias, y se han seleccionado evolutivamente debido a que en sus medios naturales la mayoría de los procariotas se encuentran de forma permanente o transitoria con una baja concentración de nutrientes.

Los sistemas de transporte activo están basados en permeasas específicas e inducibles. El modo en que se acopla la energía metabólica con el transporte del soluto aún no está dilucidado, pero en general se maneja la hipótesis de que las permeasas, una vez captado el sustrato con gran afinidad, experimentan un cambio conformacional dependiente de energía que les hace perder dicha afinidad, lo que supone la liberación de la sustancia al interior celular.

Estudiaremos los siguientes tipos de transporte activo:

• transporte activo ligado a simporte de protones;
• transporte activo ligado a simporte de iones Na⁺;
• transporte activo sensible a choque osmótico;
• transporte acoplado a translocación de grupos.

2.3.1. TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE PROTONES

Como se recordará, el simporte se puede definir como el transporte simultáneo de dos sustratos en la misma dirección, por un mismo transportador sencillo. En el caso del transporte activo ligado a simporte de protones, lo que ocurre es que uno de los sustratos (H⁺) ha creado previamente un gradiente de concentración, cuya disipación es aprovechada por el otro sustrato para entrar con él. Este otro sustrato puede ser:

• una molécula de carga negativa: en este caso, su simporte ligado a protones tiende a disipar sólo el gradiente de concentración. Ejemplos: transporte de iones fosfato, de glutamato, etc.
• una molécula neutra: en este caso, su simporte tiende a disipar no sólo el gradiente de concentración, sino también el gradiente eléctrico. Ejemplo: en Escherichia coli, la lactosa usa una ß-galactósido-permeasa, que es una de las permeasas bacterianas más intensamente estudiadas.

Por otro lado, ciertas moléculas catiónicas (iones K⁺, lisina), son transportadas directamente a través de permeasas, en ausencia de simporte de protones.

 2.3.2. TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE IONES SODIO

Se puede considerar una versión modificada del anterior: algunas sustancias no son transportadas activamente de forma directa por el potencial electroquímico de protones, sino indirectamente, a través de un gradiente de Na⁺ que a su vez se origina a expensas de dicha fuerza protón-motriz.

El sustrato entra por una permeasa, junto con iones Na⁺, pero a su vez este sodio se recicla por un sistema de antiporte, a expensas de la disipación del potencial de protones.

Ejemplo: el azúcar melibiosa, en el caso de la enterobacteria E. coli.

Estos dos tipos de transporte activo ligados a simporte quedan inhibidos si tratamos las células con algún agente ionóforo (p. ej., el antibiótico valinomicina), que destruye el potencial electroquímico de protones.

2.3.3. TRANSPORTE ACTIVO SENSIBLE A CHOQUE OSMÓTICO

Este transporte, propio de bacterias Gram-negativas, queda puesto de manifiesto cuando lo impedimos por algún procedimiento que altere o elimine la membrana externa (conversión a esferoplastos):

Por ejemplo: tratemos E. coli con el quelante EDTA en una solución tamponada isotónica (con un 20% de sacarosa). Centrifugamos y el sedimento de células lo resuspendemos en una solución de MgCl₂ en frío (0ºC). El resultado es que las proteínas del periplasma escapan al medio externo. Esto es un caso de tratamiento por choque osmótico que origina pérdida de contenidos del periplasma. Se comprueba que ciertos sistemas de transporte quedan inutilizados, debido a que requieren para su funcionamiento, amén de proteínas de membrana citoplásmica, otras específicas del espacio periplásmico. Por contra, este sistema no se ve afectado por los agentes ionóforos. La energía requerida la suministra el ATP.

El tipo paradigmático de este tipo de transporte se denomina de transportadores ABC dependientes de proteínas de unión periplásmicas o ATPasas de tráfico. Se trata de sistemas de varios componentes, en los que existen proteínas periplásmicas que captan el sustrato con gran afinidad, y lo llevan hasta unass proteínas de membrana, las cuales acoplan el paso de dicho sustrato hasta el citoplasma (sin alteralo químicamente) con la hidrólisis de ATP. Este tipo de sistemas está muy extendido, dentro de las Gram-negativas, entre las Enterobacterias.

La denominación de "transportadores ABC" se debe a que en todos ellos existe una o dos proteínas periféricas de membrana citoplásmica que posee un dominio (de unos 200 aminoácidos) conservado evolutivamente, denominado "cassette de unión a ATP" (las iniciales de ATP-binding cassette generan la sigla "ABC"). Existen muchos ejemplos de proteínas ABC, tanto en procariotas como eucariotas (incluido humanos), y todos ellos están implicados en transportar sustancias a uno u otro lado de la membrana. En el tema 10 veremos ejemplos de transportadores ABC que funcionan "al revés" de los de este tema: son "exportadores" de proteínas recién sintetizadas que deben insertarse en las envueltas bacterianas o ser excretadas al medio.

Elementos de este tipo de sistema:

• Porinas o proteínas de membrana externa para lograr la difusión del sustrato desde el medio hasta el espacio periplásmico.
• Proteína(s) solubles de espacio periplásmico que se unen al sustrato con gran afinidad.
• Un heterodímero formado por dos proteínas integrales de membrana (cada una de ellas posee 5 o 6 trechos en a-hélice que atraviesan la membrana citoplásmica), que son la permeasa propiamente dicha del sistema (el canal por donde pasa el sustrato).
• Dos proteínas periféricas de membrana citoplásmica, adosadas al lado citoplásmico, que incluyen el módulo ABC que acopla la hidrólisis de ATP con el transporte unidireccional del sustrato a través de la membrana.

Modelo del mecanismo de este sistema:

1. El sustrato exógeno normalmente entra al periplasma a través de algún canal inespecífico o porina de membrana externa.
2. La proteína periplásmica específica, antes de su unión al sustrato tiene una determinada configuración (denominada "abierta"). Cuando el sustrato pasa al periplasma, la correspondiente proteína de unión periplásmica se une a él con gran afinidad, y al unirse cambia de conformación. En esta configuración, llamada "cerrada", el sustrato se encuentra "enterrado" entre dos lóbulos de la proteína.
3. Mientras tanto, el dímero de proteínas integrales de membrana (antes de la unión con la proteína periplásmica) se encuentra en un estado energizado pero incapaz de transportar sustrato. En esta situación, puede unirse (por la parte que da al periplasma) al complejo formado por la proteína periplásmica (en configuración "cerrada") ligada al sustrato. Al hacer esto, el heterodímero de membrana cambia de conformación, de modo que ahora muestra mayor afinidad hacia la proteína periplásmica y se abre su canal para el sustrato.
4. Entonces, el complejo de membrana alcanza su estado de mínima energía, y con ello descarga el sustrato en el citoplasma y se logra la separación de la proteína periplásmica (que vuelve a su configuración "abierta").
5. Finalmente, la hidrólisis de ATP catalizada por las proteínas periféricas ABC (adosadas a la membrana y asociadas a las proteínas integrales) suministra la energía para que el heterodímero de membrana vuelva a su estado energizado inicial, preparado así para otro ciclo de transporte.

Mediante este tipo de sistema de transporte muchas bacterias Gram-negativas, y especialmente las Enterobacterias (como Escherichia coli o Salmonella typhimurium) logran introducir numeros tipos de sustancias:

• Azúcares como arabinosa, galactosa, maltosa, ribosa, xilosa, etc.
• Aminoácidos como histidina, glicina, leucina, etc.
• Oligopéptidos
• Algunas vitaminas y metales.

2.3.4. TRANSPORTE ACOPLADO A TRANSLOCACION DE GRUPOS

Es un sistema de transporte que acopla la entrada del sustrato con su modificación química por unión covalente con un grupo químico. Estrictamente hablando, no es un transporte activo, porque no funciona en contra de un gradiente de concentración, pero se considera de hecho como activo, ya que la concentración del sustrato modificado dentro de la célula supera con creces a la del sustrato sin modificar en el exterior.

Este sistema supone un ahorro de energía metabólica: aunque en el transporte se gasta un enlace rico en energía, el sustrato queda modificado en su paso a través de la membrana en la forma que la bacteria emplea como primer intermediario de su ruta metabólica. Es decir, con un solo proceso se cumplen dos funciones distintas: transporte y preparación química para la ruta, que de todas formas habría que realizar. No es de extrañar que este tipo de transporte haya sido seleccionado frecuentemente en la evolución bacteriana, y que hoy lo encontremos en muchos procariotas, especialmente en bacterias anaerobias o aerobias facultativas que recurren a fermentaciones (recordar que las fermentaciones tienen un rendimiento energético menor que los procesos respiratorios; por lo tanto, es "lógico" que se seleccionen mecanismos ahorradores como el descrito).

El caso mejor estudiado de esta clase de transporte lo constituye el llamado sistema de fosfotransferasa de azúcares (según las casi inevitables iniciales inglesas: PTS). En E. coli el sistema PTS permite el transporte de glucosa, manosa, fructosa y los polioles sorbitol y manitol. Consta de varios componentes que funcionan como una cadena de transportadores del grupo fosfato de alta energía del fosfoenolpirúvico (PEP) hasta el azúcar a transportar en cuestión.

Las dos primeras proteínas son inespecíficas respecto del azúcar (son comunes a los diversos sustratos a transportar), tienen localización citoplásmica y su síntesis es constitutiva. Se conocen como

• Enzima-I (EI)
• HPr (esta última es una pequeña proteína termoestable, rica en histidina).

El otro componente, llamado Enzima II (EII) es específico de cada azúcar, y su síntesis es inducible por el correspondiente sustrato: Suele estar compuesto por tres subunidades o dominios:

• EIIA (hasta hace poco llamado EIII) es citoplásmico y soluble;
• EIIB es un dominio periférico de membrana: aunque es hidrófilo, se liga al lado citoplásmico de la membrana a través de EIIC.
• EIIC es una proteína integral de membrana

Veamos cómo funciona el sistema:

1. Por un lado, el azúcar se une al enzima EIIC específico, pero éste por sí mismo no puede liberar al azúcar sin modificar en el interior celular.
2. Mientras tanto, la EI cataliza (en presencia de Mg⁺⁺) la transferencia del fosfato de alta energía del PEP a la HPr.
3. La HPr fosforilada (HPr-P) transfiere el fosfato al enzima IIA específico del azúcar [p. ej., la glucosa (EIIA^Glc ) o el manitol (EIIA^Mtl)].
4. La EIIA-P rápidamente, y en presencia de Mg⁺⁺, transfiere el fosfato a la enzima-IIB específica con la que se asocia (p. ej., EIIB^Glc), que a su vez fosforila el azúcar (en el caso de la glucosa convirtiéndola en glucosa-6-P): en este momento la EIIC pierde su afinidad por el azúcar modificado, que de esta forma entra en el citoplasma, preparado ya para actuar como sustrato de la primera reacción del catabolismo de este azúcar.

Otros ejemplos de transporte acoplado a translocación de grupos:

• Entrada de ácidos grasos mediante un sistema de transferencia de Coenzima A, que los transforma en acil-CoA.
• Entrada de purinas y pirimidinas, mediante un sistema de fosforribosil-transferasas:

purina o pirimidina (exterior) + PRPP ---------> NMP (interior) + P

(PRPP = fosforribosil-pirofosfato)

(NMP = nucleósido monofosfato)

En bacterias es frecuente encontrar varios sistemas de transporte para un mismo nutriente (p. ej.,Escherichia coli posee cinco sistemas para transportar la galactosa y tres sistemas para algunos de los aminoácidos. Los diversos sistemas se diferencian en cuanto a su requerimiento energético, su afinidad, su regulación, etc. Lógicamente, la evolución ha debido seleccionar esta redundancia de sistemas de transporte con objeto de permitir que el microorganismo sobreviva bajo diversas circunstancias ambientales.

 2.4 TRANSPORTE DE HIERRO

El hierro es un cofactor de muchas enzimas y citocromos, por lo que las bacterias necesitan captarlo. Las bacterias que viven dentro de animales superiores tienen un problema: en los fluidos y tejidos de sus patrones el hierro libre es muy poco abundante, por lo que se vuelve vital aprovisionarse con este elemento de alguna manera. Muchas bacterias secretan unas moléculas llamadas en generalsideróforos, que son capaces de formar quelatos (complejos) con el hierro férrico. Por ejemplo,Escherichia coli secreta el sideróforo enterobactina. Cuando la enterobactina se une al hierro, forma un complejo octaédrico, que luego se engarza con un receptor específico de la membrana externa, tras lo que el hierro se libera al espacio periplásmico, desde donde entra al citoplasma por medio de un sistema sensible a choque osmótico similar al ya estudiado más arriba.

3. ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS INTRACITOPLÁSMICAS | a Contenidos

3.1 MESOSOMAS

Son estructuras membranosas intracitoplásmicas que se observan en la mayor parte de las bacterias, constituidas por invaginaciones de la membrana citoplásmica.

Observación: A microscopio óptico se pueden detectar con tinción negativa con ácido fosfotúngstico. A microscopio electrónico se observa que, por lo general, el mesosoma se ubica en determinadas localizaciones: sitios donde se inicia la división celular; tabiques transversales en crecimiento (incluyendo los que delimitan el compartimento de la endospora); zonas cercanas a los nucleoides (cuerpos nucleares). Desde hace mucho tiempo se viene discutiendo si los mesosomas son en realidad estructuras auténticas de la bacteria, o como dicen otros, meros artefactos de las técnicas microscópicas empleadas. El debate aún no está apagado, según algunos destacados microbiólogos.

Estructura y composición: Los mesosomas más característicos y patentes son los de bacterias Gram-positivas. Su aspecto al microscopio electrónico es el de repetidas invaginaciones de la membrana: una invaginación primaria en forma de sáculo irregular, de la que surge una invaginación secundaria, llamada túbulo mesosómico, que rellena el hueco de la invaginación primaria. El túbulo mesosómico suele consistir en un conjunto de pequeñas vesículas arrosariadas, o túbulos, conectados entre sí, a veces con aspecto de cebolla.

Cuando se obtienen protoplastos en Gram-positivas, la invaginación primaria desaparece, y el túbulo mesosómico se evagina y se fractura, liberándose una serie de vesículas membranosas huecas (no rellenas de citoplasma).

Los mesosomas de Gram-negativas son menos conspicuos y menos complejos: se manifiestan como pequeñas invaginaciones de la membrana, con forma laminar o a base de tubos dispuestos de forma verticilada.

Funciones:

La porción de membrana del mesosoma correspondiente a la invaginación primaria (pero no así a la secundaria) posee una composición semejante a la de la membrana citoplásmica, por lo que se le pueden aplicar los papeles que ya hemos estudiado (transporte de electrones, síntesis de componentes de las envueltas...).

Probable papel en la síntesis del septo transversal, quizá regulando las autolisinas implicadas en la división celular (ver apartado 5 del capítulo 6).

Puntos de anclaje del cromosoma bacteriano (y quizá de algunos plásmidos), actuando en la segregación de los cromosomas hijos a las células hermanas (y en el caso de las bacterias esporuladas, en la segregación de los cromosomas a los compartimentos de la célula madre (esporangio) y de la preespora.

Zonas de secreción de ciertas exoenzimas (p. ej., penicilinasa en Bacillus).

3.2 CROMATÓFOROS

Son invaginaciones de la membrana citoplásmica de las bacterias purpúreas (dentro de las Anoxifotobacterias) que albergan su aparato fotosintético. Dependiendo de las especies, pueden adoptar formas variadas:

• A modo de vesículas huecas;
• capas de repliegues concéntricos, a modo de láminas paralelas, cercanas a la membrana citoplásmica;
• formando túbulos, aislados o en haces.

Los cromatóforos suponen obviamente una adaptación para aumentar la superficie de membrana útil capaz de realizar las funciones propias de la fotosíntesis.

3.3 OTRAS INVAGINACIONES

En muchas bacterias quimioautrofas (especialmente las nitrificantes) existen invaginaciones de la membrana (a menudo denominadas citomembranas) que permiten una mayor superficie para la realización de sus actividades respiratorias. Sus formas y disposiciones son igualmente muy variadas.

En Azotobacter, una bacteria aerobia fijadora de nitrógeno atmosférico, y que presenta una altísima tasa respiratoria, se pueden detectar también invaginaciones de membrana que aumentan la superficie disponible para sus intensos procesos de oxidación.

4. TILACOIDES | a Contenidos

Son sacos membranosos aplastados presentes en las Oxifotobacterias, que no están en continuidad con la membrana citoplásmica; en su cara externa se disponen filas de ficobilisomas (véase capítulo 8). El conjunto de membrana tilacoidal + ficobilisomas es el responsable de la fotosíntesis oxigénica en este grupo de procariotas.