Estudios de la microbiología

CITOPLASMA. INCLUSIONES CITOPLÁSMICAS

 CITOPLASMA BACTERIANO: VISIÓN DE CONJUNTO | a Contenidos

El citoplasma bacteriano es la masa de materia viva delimitada por la membrana citoplásmica. En su interior se albergan:

• cuerpos nucleares (nucleoide);
• plásmidos (no en todas las cepas bacterianas);
• ribosomas;
• inclusiones (no en todas);
• orgánulos (no en todas).

Al igual que en los demás seres vivos, el citoplasma es un sistema coloidal cuya fase dispersante es agua junto con diversas sustancias en solución (citosol), y cuya fase dispersa está constituida por macromoléculas y conjuntos supramoleculares (partículas submicroscópicas). La viscosidad es mayor que la del citoplasma eucariótico, estando desprovisto de corrientes citoplásmicas.
Observación:A microscopía óptica, obviamente es poco lo que se puede distinguir en él. En las células jóvenes se suele teñir de modo uniforme, teniendo un carácter basófilo (debido a la abundancia de ARN). En las células viejas se tiñe irregularmente, debido a la aparición de inclusiones y a la acumulación de sustancias de desecho.
A microscopía electrónica destaca el carácter granulado, producido por los numerosos ribosomas (que a los aumentos habituales aparecen como partículas esféricas), aunque se observa una zona irregular hacia el centro, más transparente a los electrones, que se debe a los cuerpos nucleares (nucleoide). En los intersticios entre las partículas granuladas existe una sustancia amorfa en la que no se pueden distinguir más detalles, y que corresponde a la fase dispersante acuosa de la que hablábamos más arriba.
En este capítulo y en los próximos nos dedicaremos al estudio de las principales estructuras y macromoléculas que alberga el citoplasma. Comenzaremos con las inclusiones y orgánulos especiales que presentan algunas bacterias (este cap. 8), para abordar después la organización a gran escala del material genético bacteriano (cap. 9), y un rápido repaso al proceso de expresión de la información genética contenida en éste (cap. 10, con estudio de los ribosomas bacterianos).

2. INCLUSIONES DE RESERVA | a Contenidos

Son acúmulos de sustancias orgánicas o inorgánicas, rodeadas o no de una envuelta limitante de naturaleza proteínica, que se originan dentro del citoplasma bajo determinadas condiciones de crecimiento. Constituyen reservas de fuentes de C o N (inclusiones orgánicas) y de P o S (inclusiones inorgánicas).
Estudiaremos:

1. Inclusiones orgánicas:
   1. inclusiones polisacarídicas
   2. gránulos de poli-ß-hidroxibutírico (o, en general de poli-ß-hidroxialcanoatos)
   3. inclusiones de hidrocarburos
   4. gránulos de cianoficina
2. Inclusiones inorgánicas:gránulos de polifosfato
   
   1. glóbulos de azufre

 2.1 INCLUSIONES POLISACARÍDICAS

Son acumulaciones de a (1-->4) glucanos, con ramificaciones en a (1--> 6), principalmente almidón o glucógeno (según especies), que se depositan de modo más o menos uniforme por todo el citoplasma cuando determinadas bacterias crecen en medios con limitación de fuente de N, pero donde aún sean abundantes las fuentes de C y energía. En esta situación, se detiene prácticamente la síntesis de proteínas y de ácidos nucleicos, y la mayor parte del C asimilado se convierte rápidamente en estos materiales de reserva. Cuando a estas células las pasamos a un medio rico en N, pero carente de fuente de C, estas inclusiones se usan como fuente interna de C para la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas.
Estas inclusiones actúan, pues, como sistemas de almacenamiento de carbono osmóticamente inertes (la célula puede albergar grandes cantidades de glucosa que, si estuvieran como moléculas libres dentro del citoplasma, podrían tener efectos osmóticos muy negativos).
Síntesis (veamos el ejemplo del glucógeno):

fosfoglucomutasa

Glucosa-6-P --------------------------------> Glucosa-1-P

ADP-glucosa-pirofosforilasa

Glucosa-1-P + ATP ---------------------------------------> ADP-glucosa + PP

glucógeno sintetasa

ADP-glucosa + {a ,1-->4 glucano aceptor}_n -----------------------------------------> {a ,1-->4 glucano}_n+1

Sobre este polímero lineal actúa la enzima ramificadora (que introduce enlaces a (1-->6) con glucosa), de modo que se forma el glucógeno maduro.
Degradación:

glucógeno fosforilasa

Glucógeno --------------------------------> n {glucosa-1-P}

Para la total degradación del glucógeno se requieren también enzimas desramificadoras, capaces de romper los enlaces a (1-->6).
Observación:Para observarlas se recurre a la tinción con una solución de I₂ + IK:

• glucógeno: aparece de color pardo-rojizo;
• almidón (amilopectina): color azul.

 2.2 GRÁNULOS DE POLI-ß-HIDROXIBUTÍRICO (PHB) Y DE POLI-HIDROXIALCANOATOS (PHA)

Los gránulos de poli-b-hidroxibutírico son acúmulos del poliéster del ácido ß-hidroxibutírico (= 3-hidroxibutírico), rodeados de una envuelta proteínica, y que al igual que en el caso anterior, se producen en ciertas bacterias como reserva osmóticamente inerte de C en condiciones de hambre de N. Además de la protección osmótica, estos gránulos suponen la ventaja de neutralizar un metabolito ácido (el grupo carboxilo de cada unidad de ß-hidroxibutírico desaparece como tal, al intervenir en el enlace éster con la siguiente unidad). En las especies de Bacillus constituye la fuente de carbono y energía al inicio de la esporulación. Una función semejante parece implicada a la hora del enquistamiento de Azotobacter.
Una célula puede contener de 8 a 12 de estos gránulos, que miden unos 0.2-0.7 mm de diámetro, y que van provistos de una envuelta proteica de unos 3-4 nm de grosor. Pueden llegar a representar el 80% en peso de la célula.
Síntesis:Se produce por una rama lateral de la ruta de síntesis de los ácidos grasos, a través de ß-hidroxibutiril-CoA. En los gránulos, el polímero queda asociado a un sistema complejo que será utilizado en la degradación, pero este sistema habrá de activarse antes.
Degradación:

1. La degradación comienza con la actuación de un enzima proteolítico que desorganiza la envuelta proteica de los gránulos;
2. Los gránulos así "activados" sufren ahora la acción de una despolimerasa, que va generando dímeros de hidroxibutírico.
3. Actuación de una dimerasa específica, que genera ß-hidroxibutírico a partir de los ésteres diméricos.

Observación:A diferencia de los acúmulos de polisacáridos, los gránulos de PHB son visibles a microscopio óptico en fresco, debido a su elevado índice de refringencia. Se tiñen bien mediante Negro-Sudán.
Gránulos de poli-ß-hidroxialcanoatos (PHA):En los últimos años está quedando patente que los gránulos descritos de PHB son un ejemplo de una clase más amplia de gránulos de poli-ß-hidroxi-alcanoatos.

Por ejemplo: cuando determinadas especies de Pseudomonas crecen en n-octano como fuente de carbono, se acumula un polímero de ésteres del ácido ß-hidroxi-octanoico, con una función metabólica semejante a la del PHB.
Ciertas cepas de Alcaligenes eutrophus, cuando crecen en glucosa y propiónico producen copolímeros aleatorios de unidades de b-hidroxibutírico y b-hidroxivalérico (=3-hidroxipentanoico).
Existen interesantes perspectivas de aprovechamiento económico de estos polímeros, ya que los PHA se comportan como excelentes termoplásticos biodegradables. Por ejemplo, la empresa británica ICI tiene patentados procesos industriales para fabricar PHA donde casi el 90% de las unidades son de hidroxivalérico, que da un polímero flexible comercializado con el nombre de Biopol ®. Los polímeros a base de 4- o 5-hidroxibutírico y 3-hidroxibutírico son más largos, más elásticos y más biodegradables (se han empleado en la fabricación de envases)

2.3 INCLUSIONES DE HIDROCARBUROS

Son acúmulos de reserva (con envuelta proteinica) de los hidrocarburos que determinadas bacterias (especialmente Actinomicetos y relacionados) usan como fuente de C.

2.4 GRÁNULOS DE CIANOFICINA

Muchas cianobacterias (Oxifotobacterias) acumulan grandes gránulos refringentes de reservas nitrogenadas cuando se acercan a la fase estacionaria de crecimiento. Estos gránulos de cianoficina son acúmulos de un copolímero de arginina y aspártico: consta de un núcleo de poliaspártico, en el que todos los carboxilos de las cadenas laterales están unidos con L-arginina. Su síntesis no está basada en el mecanismo habitual en ribosomas, ya que no se ve inhibida por el cloramfenicol.

2.5 GRÁNULOS DE POLIFOSFATOS (= GRÁNULOS DE VOLUTINA, O GRÁNULOS METACROMÁTICOS

El nombre de "metacromáticos" alude al efecto metacromático (cambio de color): cuando se tiñen con los colorantes básicos azul de toluidina o azul de metileno envejecido, se colorean de rojo. A microscopio electrónico aparecen muy densos a los electrones.
Son acúmulos de polifosfato, polímeros lineales del ortofosfato, de longitud variable (por término medio, unas 500 unidades), que representan un modo osmóticamente inerte de almacenar fosfato. Parece ser que la parte central de estos gránulos constituye un núcleo formado por lípidos y proteínas. En algunos casos pueden constituir una fuente de energía, en sustitución del ATP (¿se trata en este caso de una especie de "fósil bioquímico?").
Se acumulan cuando algún otro nutriente distinto del fosfato se hace escaso (sobre todo cuando va desapareciendo el sulfato). En estas condiciones se detiene la síntesis de los ácidos nucleicos, y la volutina se acumula a la espera de su utilización para esta síntesis de nucleicos, cuando aparezca el nutriente originalmente limitante.
Su síntesis se produce por adición secuencial de restos de P a PP, actuando el ATP como donador:

P-P + ATP ------> P-P-P + ADP;

(-P-)_n + ATP -----> (-P-)_n+1 + ADP.

Los gránulos de polifosfatos tienen un interesante aspecto aplicado, en la eliminación de fosfatos en las aguas residuales. En los lodos activados de las plantas de procesamiento de aguas y residuos es muy abundante la bacteria Acinetobacter, que puede llegar a acumular el 24% de su biomasa bajo la forma de polifosfatos. Durante los periodos de aerobiosis, esta bacteria se asegura la energía a partir de sustratros extracelulares, y mientras tanto acumula gránulos de polifosfatos; en anaerobiosis, los niveles de ATP los mantienen a expensas de usar esos gránulos de polifosfato, por lo que el lodo libera fosfatos. Esto se aprovecha para eliminar concentraciones problemáticas de fosfatos en aguas residuales, derivadas del uso de fertilizantes y detergentes (proceso "Renpho").

2.6 GLÓBULOS DE AZUFRE

Las inclusiones de S aparecen en dos grupos de bacterias que usan sulfuro de hidrógeno (SH₂):

• las bacterias purpúreas del azufre (que usan el SH₂ como donador de electrones para la fotosíntesis);
• bacterias filamentosas no fotosintéticas como Beggiatoa o Thiothrix, que lo usan como donador de electrones para sus oxidaciones.

En ambos casos, el sulfuro de hidrógeno es oxidado a azufre elemental (S⁰), que en el citoplasma se acumula como glóbulos muy refringentes y rodeados de envuelta proteínica. Estos glóbulos son transitorios, ya que el S⁰ se reutiliza por oxidación hasta sulfato, cuando en el medio se agota el sulfuro.

3. OTRAS INCLUSIONES | a Contenidos

3.1 INCLUSIONES DE SALES MINERALES

Acúmulos grandes, densos y refringentes de sales insolubles de calcio (sobre todo carbonatos) que aparecen en algunas bacterias (como Achromatium), cuyo papel parece consistir en mantenerlas en el fondo de los lagos y ríos.

3.2 FICOBILISOMAS

Son estructuras supramacromoleculares, en forma de cilindros o bastones, adosadas a la superficie de la membrana tilacoidal de las Oxifotobacterias, confiriendo a ésta un típico aspecto "granuloso" en las micrografías electrónicas.
Como se puede ver en el esquema, están constituidas por pilas de discos a partir de ficobiliproteínas, cromoproteínas que sirven como "antenas" para la captación de luz en la fotosíntesis de estos procariotas. Los grupos cromóforos son: ficocianinas, aloficocianinas y ficoeritrina. Como veremos oportunamente, la disposición ordenada de los distintos pigmentos tiene un papel central en la "canalización" de la energía de la luz hacia los centros de reacción (ubicados ya en plena membrana tilacoidal) donde se localizan los complejos fotosintéticos proteínas-clorofilas.

4. ORGÁNULOS PROCARIÓTICOS CITOPLÁSMICOS | a Contenidos

Como ya dijimos, en procariotas no existen por regla general orgánulos citoplásmicos rodeados por unidad de membrana. Las únicas excepciones están constituidas por los tilacoides de las Oxifotobacterias, ya estudiados en el capítulo anterior. En algunos grupos bacterianos se pueden encontrar orgánulos citoplásmicos no rodeados por unidad de membrana (o sea, sin bicapa lipídica). Muchos de ellos presentan envueltas basadas en subunidades de proteínas:

• carboxisomas
• vacuolas de gas
• clorosomas
• magnetosomas.

4.1 CARBOXISOMAS (= CUERPOS POLIÉDRICOS)

Estructuras presentes en bacterias fotoautotrofas (Oxifotobacterias y ciertas bacterias purpúreas) y quimioautotrofas (nitrificantes, Thiobacillus), de apariencia poliédrica con tendencia a esférica. Su diámetro oscila entre 50 y 500 nm, y están rodeadas de envuelta monocapa proteinica de unos 3,5 nm. El interior tiene aspecto granular, debido a la acumulación de la enzima ribulosa-bifosfato-carboxilasa (RuBisCo, la carboxidismutasa, el enzima clave en el ciclo de Calvin de asimilación de CO₂). Aunque se pensó que eran los sitos de fijación del CO₂, parece más bien que se trata de reservas de dicha enzima.

4.2 VACUOLAS DE GAS

Son orgánulos muy refringentes al microscopio óptico, que al electrónico muestran una estructura a base de agrupaciones regulares de vesículas de gas. Cada vesícula tiene una forma de cilindro bicónico (200-1000 nm de longitud y unos 70 nm de diámetro), rodeado de una monocapa de unidades globulares de proteína ensambladas helicoidalmente que dan un aspecto a bandas ("costillas"). Esta envuelta es impermeable al agua, pero permeable a los gases, por lo que la composición y concentración del gas dentro de la vesícula depende de las que existan en el medio. Conforme se sintetizan y ensamblan las vesículas, el agua va siendo eliminada del interior (véase esquema).
La función de estas vacuolas es mantener un grado de flotabilidad óptimo en los hábitats acuáticos a las bacterias que las poseen, permitiéndoles alcanzar la profundidad adecuada para su modo de vida (según los casos, para obtener una intensidad adecuada de luz, concentración óptima de oxígeno o de otros nutrientes).
Las vacuolas de gas son muy frecuentes en Oxifotobacterias y Anoxifotobacterias; también se dan en algunas arqueobacterias (Halobacterium, algunas metanógenas) y en bacterias prostecadas (Ancalomicrobium, Prosthecomicrobium).

4.3 CLOROSOMAS

Son vesículas oblongas situadas por debajo de la membrana citoplásmica, que contienen los pigmentos antena de las bacterias fotosintéticas verdes (antigua familia Chlorobiaceae, dentro de la clase Anoxyphotobacteria). Son invisibles a microscopía óptica; miden 100-150 nm de longitud y unos 50 nm de anchura, estando rodeadas de una monocapa de proteínas. Se disponen por debajo de la membrana citoplásmica, sin estar en continuidad con ella, aunque en muchos casos aparecen conectadas a través de un pedúnculo de naturaleza no lipídica.

4.4 MAGNETOSOMAS

Son orgánulos sensores del campo magnético terrestre, que aparecen en ciertas bacterias acuáticas flageladas microaerófilas o anaerobias (p. ej., en Aquaspirillum magnetotacticum). Consisten en cristales homogéneos de magnetita (Fe₃O₄), de formas cubo-octaédricas o de prisma hexagonal, delimitados por una envuelta proteínica. Los diversos cristales suelen disponerse en filas paralelas al eje longitudinal de la bacteria, o en otras agrupaciones regulares de varios unidades, hasta varias decenas.
Fueron descubiertas en 1975, y se sabe que permiten la orientación magnética a las bacterias que las poseen (bacterias magnetotácticas), determinando la orientación de su natación. En el hemisferio Norte, el campo magnético está orientado hacia abajo, y en el sur hacia arriba. Las bacterias magnetotácticas del hemisferio septentrional se orientan al N, y las del meridional, al S. Por consiguiente, cuando las bacterias son removidas de los fondos donde viven, por magnetotaxia pueden volver al fondo, que es donde encuentran las concentraciones de oxígeno adecuadas para su modo de vida.

CUERPOS NUCLEARES. EL GENÓFORO BACTERIANO

EL NUCLEOIDE | a Contenidos    

El ADN es el material genético de los procariotas, al igual que del resto de seres vivos (celulares). Dicho ADN está contenido en una región concreta del citoplasma, denominada nucleoide, sin estar separado por membrana. El genoma es el conjunto de genes y secuencias de ADN de un organismo. En el caso de bacterias, el elemento obligatorio del genoma es el cromosoma, aunque es frecuente encontrar unidades de replicación autónomas llamadas plásmidos, que son dispensables (si se pierden, la bacteria sigue siendo viable).

1.1 MÉTODOS DE OBSERVACIÓN Y OBTENCIÓN DEL CROMOSOMA BACTERIANO

A microscopía ópticaEn las células en fresco, los nucleoides se pueden poner de manifiesto (usando microscopio de contraste de fases) ajustando el índice de refracción del medio (haciendo que dicho índice sea igual al del resto del protoplasma). Se logra más detalle usando los recientes microscopios confocales de barrido.
Usando tinciones (en preparaciones fijadas previamente): se pueden emplear colorantes básicos (como los de tipo Feulgen), siempre que previamente se destruya el ARNr (que podría enmascarar al nucleoide) mediante hidrólisis ácida o enzimática. Otro buen sistema es emplear el bromuro de etidio, colorante que se intercala en la doble hélice del ADN y que permite visualizar los nucleoides de color anaranjado con un microscopio provisto de luz ultravioleta.
A microscopía electrónica de transmisiónPara evitar artefactos de laboratorio, frecuentes en la fase de fijación para la microscopía electrónica, se recurre a un método de congelación rápida seguida de criosubsitución. Las imágenes (véase fotomicrografías de la Fig. 1) muestran al nucleoide como una región más o menos delimitada y libre de ribosomas, dentro del citoplasma, no rodeada de membrana, con muchos lóbulos y un aspecto fibroso. En algunas micrografías parece estar conectada a la membrana citoplásmica a través de un mesosoma.
Métodos de obtenciónPara obtener nucleoides "intactos" se recurre a la lisis suave de las células (con detergentes no iónicos) en altas concentraciones de sales (p ej., NaCl) con posterior ultracentrifugación en gradientes de densidad de sacarosa. Si el procedimiento se realiza a 25⁰C el nucleoide se aisla relativamente libre de restos de membrana, pero si se hace en frío (4⁰C) el nucleoide queda asociado a grandes restos de envueltas.
Estudios molecularesLa biología molecular, especialmente a través de las técnicas de ADN recombinante, permite la caracterización física detallada de los genomas. Muchos genomas de procariotas han sido cartografiados mediante mapas de restricción, pero en la actualidad ya contamos con unos 20 genomas totalmente secuenciados, lo que está permitiendo avances espectaculares en todos los ámbitos de la genética y bioquímica de estos microorganismos. (En otra parte de esta sede web dispongo de enlaces para navegar por algunos de los centros que realizan investigación genómica,incluida la de microorganismos).

1.2 COMPOSICIÓN QUÍMICA, ESTRUCTURA Y ORGANIZACIÓN DEL CROMOSOMA

Los nucleoides aislados muestran una composición de un 60% de ADN, 30% de ARN y 10% de proteínas.
El ADN sigue el modelo clásico de Watson y Crick: dos hebras antiparalelas en doble hélice de 2 nm de diámetro, paso de rosca de 3,4 nm y 10 pares de nucleótidos por cada vuelta de la espiral. La mayor parte de este ADN está en conformación B, aunque existen zonas donde se puede dar la configuración Z.
En la mayor parte de las bacterias este ADN constituye un solo cromosoma circular, cerrado covalentemente (ADN c.c.c.). Existen algunas excepciones:

• en el género Borrelia el cromosoma parece lineal con los extremos cerrados covalentemente (es decir, los extremos forman una especie de bucle de horquilla);
• bacterias del género Streptomyces también poseen un cromosoma lineal, pero sus extremos están acomplejados con proteínas;
• algunas bacterias parecen poseer dos cromosomas: Rhodobacter sphaeroides presenta dos cromosomas circulares, mientras que Agrobacterium tumefaciens cuenta con uno lineal y otro circular.

Las bacterias son organismos haploides: poseen un solo cromosoma. Sin embargo, cuando las células bacterianas se encuentran en crecimiento activo, y debido al desfase de la división celular respecto de la replicación, cada individuo puede contener de 2 a 4 copias de ese cromosoma.
Tamaño del cromosomaUna bacteria típica, como Escherichia coli posee un cromosoma con 4.700 pares de kilobases (kb). Pero los rangos de tamaño oscilan entre las 700 kb de Mycoplasma genitalium (una bacteria carente de pared y parásita) y las más de 12.000 kb de ciertas bacterias capaces de diferenciación celular y fenómenos de multicelularidad (cianobacterias, actinomicetos).
Organización del cromosoma y de la cromatina bacterianosSi desplegáramos el cromosoma de E. coli de modo lineal, mediría 1 mm, es decir, 1000 veces más de lo que mide la longitud de la bacteria. Si además tenemos en consideración que el cromosoma ocupa sólo 10% del volumen celular, nos daremos cuenta que debe de estar densamente empaquetado. ¿Cómo es la organización a gran escala de este cromosoma dentro de la célula? Esta es una cuestión que aún desconocemos en todos sus detalles. A continuación exponemos un resumen de lo que se sabe (o sospecha) actualmente:
La doble hélice está superenrollada negativamente sobre sí misma. Parte de este superenrollamiento se debe al equilibrio entre la actuación de dos enzimas:

• ADN girasa (= topoisomerasa-II) que tiende a introducir superhelicidad negativa;
• ADN topoisomerasa-I, que tiende a relajar la superhelicidad negativa.

Se ha descubierto que la girasa introduce cortes en sitios del cromosoma llamados topositios, separados entre sí una media de unas 75 kb. El grado de superenrollamiento parece ser de una "superhélice" por cada 20 vueltas de la doble hélice (valor= -0.05). En el nucleoide, cada "pétalo" de la "margarita" (o sea, cada uno de los bucles) constituye un dominio que puede ser superenrollado y relajado separadamente de los demás. El número de dominios in vivo parece rondar los 50, y cada uno de ellos parece estar estabilizado por proteínas específicas.
Aparte de este superenrollamiento producido por "topoenzimas", el material genético bacteriano presenta interacciones con una serie de proteínas estructurales. El conjunto de ADN y proteínas estructurales se denomina "cromatina", pero, nunca aparecen histonas. Salvo en algunas arqueobacterias, esta cromatina procariótica tiene menos densidad de proteínas que la cromatina de eucariotas. Veamos algunas de esas proteínas.

• En Escherichia coli, existe la proteína básica HU, un heterodímero (HU-a , HU-ß), que presenta cierto parecido con las histonas auténticas (pero sin guardar homología con ellas). No forma auténticos nucleosomas con el ADN. En otras bacterias, existen proteínas homólogas con la HU. En todos los casos se unen débilmente al ADN "normal", pero en cambio lo hacen con gran afinidad hacia ADN curvado o que forme bucles, induciendo mayores curvaturas en ese ADN. Parece que su papel no sólo es estructural, sino que también colaboran con otras proteínas en procesos de recombinación homóloga, recombinación específica, reparación del ADN y expresión genética.
• La IHF (llamada así por las iniciales inglesas de factor de hospedador para la integración) es una proteína que reconoce un tipo de secuencia de 13 pares de bases, y que al unirse al surco menor de la doble hélice provoca grandes curvaturas locales en ella. De esta forma colabora en procesos de recombinación específica (lo veremos en la sección de Genética) y de expresión de ciertos genes.
• La proteína H-NS de Enterobacterias se une específicamente al ADN intrínsecamente curvado (sobre todo aquel rico en trechos de poli-adenina y poli-timina), e inespecíficamente a otras zonas de ADN (aunque con menor afinidad). Al parecer, el principal papel de esta proteína es permitir la expresión de gran número de genes importantes para la supervivencia de estas bacterias en el hábitat intestinal, pero reprimir esos mismos genes cuando la bacteria sale del vertebrado hospedador, y las circunstancias ambientales son totalmente diferentes (osmolaridad, temperatura, pH, etc.).

Como se ve, tanto el superenrollamiento como la compactación generada por las proteínas estructurales tienen una notable influencia sobre las funciones del ADN, ya que modulan procesos tan importantes como la replicación, transcripción, recombinación y expresión génica, aunque estamos lejos de conocer exactamente los mecanismos implicados.
El papel biológico del ARN que se detecta en los nucleoides aislados in vitro tampoco está claro. Este no es un ARN especial, sino ARN naciente, y parece servir para mantener "sujetos" los diversos dominios superenrollados.
Finalmente, otro tema largamente debatido es el modo de asociación del cromosoma con la membrana citoplásmica (¿quizá a través de mesosoma?). Hay indicios de que el cromosoma, y concretamente su origen de replicación (oriC), se encuentra "anclado" a determinadas proteínas de la membrana (proteínas que probablemente estén implicadas en el inicio de la replicación cromosómica).

1.3 REPLICACIÓN DEL CROMOSOMA BACTERIANO

Remitimos al alumno a sus apuntes de Bioquímica y Genética. Cualquier buen texto (actualizado) de Microbiología, Genética, Bioquímica o Biología Molecular servirá para completar la visión de este apartado, así como la bibliografía pertinente al final de este capítulo. Recomiendo igualmente consultar mi lista de enlaces a sedes web donde se puede acceder a cursos "on-line" sobre este tema.

2. PLÁSMIDOS | a Contenidos

2.1 DEFINICIÓN Y CONCEPTOS GENERALES

Aunque en general es adecuado decir que el genomio de los procariotas consta de un solo cromosoma, muchas bacterias poseen, además, uno o varios elementos genéticos accesorios extracromosómicos, a los que denominamos plásmidos.
Se definen como elementos genéticos extracromosómicos con capacidad de replicación autónoma(es decir, constituyen replicones propios). Todos los plásmidos bacterianos estudiados son de ADN de cadena doble. La inmensa mayoría son circulares cerrados covalentemente (c.c.c.) y superenrollados (aunque en Borrelia y algunos Actinomicetos existen plásmidos lineares). Algunos plásmidos poseen, además, la capacidad de integrarse reversiblemente en el cromosoma bacteriano: en esta situación se replican junto con el cromosoma (bajo el control de éste), y reciben el nombre deepisomas.
En cuanto al tamaño, existe una amplia gama: desde plásmidos muy pequeños (de unas 2 kb) hasta plásmidos muy grandes (ciertos plásmidos de Pseudomonas tienen 500 kb). Incluso existen "megaplásmidos" en ciertos Rhizobium que llegan a tener 1600 kb (en este último caso ¿cabe hablar de plásmido, o no sería mejor denominarlo cromosoma auxiliar?).
Cada tipo de plásmido tiene un número medio de copias por célula característico. Por regla general, los grandes plásmidos tienen una o dos copias por célula (plásmidos con control estricto de la replicación), mientras que los pequeños suelen estar presentes como varias copias (>10), denominándose plásmidos de control relajado.
En función de que los plásmidos sean o no transmisibles de una bacteria a otra por medio de contactos intercelulares, se pueden distinguir:

• plásmidos conjugativos (autotransmisibles), que son aquellos que se transfieren entre cepas por medio de fenómenos de conjugación. Algunos de estos plásmidos no sólo se transfieren entre cepas de la misma especie, sino que son capaces de hacerlo entre especies y géneros muy diversos, recibiendo el muy apropiado nombre de plásmidos promiscuos o de amplio espectro de hospedadores, permitiendo transferencia horizontal de información genética entre grupos bacterianos filogenéticamente alejados.
• plásmidos no conjugativos, carentes de esta propiedad de conjugación. Dentro de esta categoría existe un subgrupo, el de los plásmidos movilizables: son aquellos no autotransmisibles que pueden ser transferidos por la acción de un plásmido conjugativo coexistente en la misma bacteria.

(Ampliaremos el estudio de los plásmidos conjugativos en la sección de Genética bacteriana).

2.2 MÉTODOS DE DETECCIÓN Y ESTUDIO

Se pueden detectar y aislar por una variedad de métodos, principalmente:

• Electroforesis de ADN total bacteriano (obtenido por algún método de lisis celular) en un gel de agarosa, tratado con bromuro de etidio e iluminado con luz UV. El ADN de cada tipo de plásmido aparece como una banda discreta de color naranja, que migra a una distancia inversamente proporcional al logaritmo de su tamaño.
• Ultracentrifugación de ADN en gradientes de equilibrio de densidad de cloruro de cesio + bromuro de etidio. Durante la fase previa de lisis celular, el ADN cromosómico se rompe en múltiples trozos (por cizallamiento), mientras que el plasmídico, más pequeño, queda intacto. El bromuro de etidio se intercala en las dobles hebras de ambos, pero el plásmido queda con más densidad, por lo que aparece como una banda más cercana al fondo del tubo, separada netamente de la banda superior de trozos de ADN cromosómico.

2.3 FENOTIPOS DETERMINADOS POR LOS PLÁSMIDOS

Los plásmidos no suelen ser indispensables para la viabilidad de la bacteria, y muchos de ellos se pierden en ausencia de una presión selectiva. Una bacteria puede ser "curada" de su(s) plásmido(s), es decir, se le pueden eliminar, bien de forma espontánea, bien por una serie de tratamientos en el laboratorio (incubando las bacterias a temperaturas cercanas a la máxima o por agentes químicos como el naranja de acridina, que se insertan entre las bases del ADN). La razón de esta curación de los plásmidos es que esos tratamientos interfieren con su replicación sin afectar a la replicación del cromosoma. Esto hace que en sucesivas divisiones de una bacteria, el plásmido se vaya "diluyendo" en la población resultante.
Los plásmidos no suelen determinar productos esenciales para el crecimiento (por eso son dispensables), pero en la naturaleza parece que resultan favorecidas las bacterias con algún plásmido, quizá porque acarrean ventajas selectivas en determinados ambientes o en determinadas condiciones. Existe una variedad de fenotipos y funciones determinados por plásmidos:

1. Resistencia a antibióticos (plásmidos R; los estudiaremos en la sección de Genética).
2. Resistencia a metales pesados (por ejemplo, resistencia a mercurio).
3. Plásmidos de virulencia: producción de toxinas, factores de penetración en tejidos, adherencia a tejidos del hospedador, etc., en ciertas bacterias patógenas.
4. Producción de bacteriocinas (proteínas tóxicas producidas por bacterias que matan a otras de la misma especie).
5. Producción de sideróforos (quelatos para secuestrar iones Fe³⁺).
6. Utilización de determinados azúcares.
7. Utilización de hidrocarburos, incluyendo algunos cíclicos recalcitrantes (degradación de tolueno, xileno, alcanfor, etc.) en Pseudomonas.
8. Inducción de tumores en plantas (plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens).
9. Interacciones simbióticas y fijación de nitrógeno en ciertos Rhizobium.
10. etc...

Obsérvese que la mayor parte de estos fenotipos no están directamente relacionados con el proceso de crecimiento bacteriano, sino que se pueden calificar como funciones para ocupar nichos ecológicos y resistir circunstancias adversas. Los dos fenotipos de "utilización de...(fuente alternativa de C)" nos recuerdan que muchas bacterias están sometidas a períodos alternos de hambrunas y de "festines de comida": ciertas bacterias, como Pseudomonas se adaptan a los períodos de hambre de las fuentes habituales de C recurriendo a fuentes "exóticas", como hidrocarburos cíclicos. La información para los enzimas degradativos correspondientes la llevan en plásmidos.
¿Por qué, entonces, si determinadas propiedades conferidas por plásmidos son tan útiles, no han pasado a lo largo de la evolución a ser codificadas por el cromosoma? No podemos contestar a ciencia cierta a esa pregunta, pero cabe especular que resulta ventajoso que algunas poblaciones bacterianas dispongan de ciertos genes en replicones distintos del cromosoma, de modo que los cromosomas no lleguen a ser demasiado grandes. Cuando no hay presión selectiva para los rasgos conferidos por un plásmido, éste se puede perder de parte de la población. Pero cuando existe dicha presión selectiva (p. ej., un antibiótico), sobreviven y se multiplican preferencialmente las bacterias portadoras del plásmido, de modo que en poco tiempo, la población contiene mayoritariamente dicho elemento. Además, como muchos plásmidos son autotransmisibles o movilizables, pueden transferirse a cepas que originalmente carecían de ellos. En resumen, se logra una gran flexibilidad adaptativa sin "cargar" demasiado el cromosoma o replicón principal.
Hay plásmidos que, aunque se pueden evidenciar por métodos físicos (p. ej., electroforesis), no se ha podido demostrar que determinen ningún rasgo fenotípico: tales plásmidos se califican comocrípticos.

2.4 REPLICACIÓN DE LOS PLÁSMIDOS

Como dijimos, los plásmidos son replicones, es decir, unidades de replicación autónoma, pero ello no significa que codifiquen toda la maquinaria para su propia replicación. De hecho, la mayoría de los plásmidos sólo codifican unas pocas proteínas para este fin, y aprovechan la maquinaria de replicación de la bacteria huésped (ADN polimerasas, ligasas, primasas, etc), que actúa sobre unas secuencias del plásmido denominadas secuencias oriV, donde tiene lugar el inicio de esa replicación. Cada tipo de plásmido se replica por uno de dos principales tipos de mecanismos:

1. Modelo de replicación en q (theta): comienza por la separación de las dos cadenas en el sitiooriV, creando una estructura que se parece a la letra griega q (theta). En algunos plásmidos, la replicación es unidireccional (sólo hay una horquilla de replicación , que avanza a lo largo de la molécula, hasta que vuelve al sitio oriV, en el que las dos moléculas hijas se separan). Otros plásmidos se replican en q por un modelo bidireccional (dos horquillas de replicación de sentidos opuestos, que se encuentran cerca de la mitad de la molécula). La replicación en q es frecuente en plásmidos de bacterias Gram-negativas.
2. Modelo de replicación en s (sigma), o modelo del círculo rodante: una de las dos cadenas es rota a nivel de oriV, de modo que el extremo 3’ suministra el cebador para la replicación de la "cadena adelantada". La cadena desplazada (cadena "menos") funciona como cadena retrasada ("lagging") y debe ser replicada a partir de sitios de cebado especiales. Este tipo de replicación es frecuente en plásmidos de bacterias Gram-positivas.

2.5 REGULACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS

La regulación del número medio de copias de cada plásmido en cada bacteria es una propiedad característica dependiente de cómo se controla el inicio de replicación, siendo diferentes los mecanismos en los plásmidos de alto número de copias (con control relajado) y en los plásmidos de bajo número de copias (de control estricto).

• En general, los plásmidos de control relajado tienen mecanismos que inhiben el inicio de replicación sólo cuando el número de copias ha llegado a un cierto nivel.
• En cambio, los plásmidos de control estricto tienen mecanismos que logran que sólo se repliquen una vez o un pequeño número de veces en cada ciclo celular.

Aunque no nos vamos a detener en los mecanismos de control del número de copias, que por lo demás son muy variados, sí vale la pena citar algunos ejemplos:

• El plásmido colicinogénico ColE1 posee un mecanismo de control basado en un pequeño ARN regulador: Para que ColE1 inicie su replicación, un gen de la zona ori se expresa hasta dar un ARN llamado ARN-II, que a su vez debe ser procesado por la ARN-asa H del hospedador, de modo que el ARN-II recortado suministra el extremo 3’-OH para cebar la síntesis de ADN del plásmido. Esto ocurre durante cierto tiempo, de modo que la célula va acumulando varias copias de ColE1. Sin embargo, mientras tanto, la célula ha ido acumulando un corto ARN que va a funcionar como regulador negativo: se trata del llamado ARN-I, que se produce a partir de la cadena opuesta a la que produce la síntesis del ARN-II. Por lo tanto, ARN-I y ARN-II son complementarios. Cuando ARN-I alcanza cierto nivel, se empareja con el ARN-II (formándose un ARN de cadena doble), de modo que ahora ya no puede actuar la ARN-asa H. Como el ARN-II no puede se procesado, no puede suministrar el cebador para el inicio de la replicación del plásmido.
• En otros plásmidos, como el R1, la regulación se logra a través de un ARN antisentido que desestabiliza el ARN mensajero de la proteína RepA, requerida para el inicio de la replicación.
• Muchos plásmidos de Gram-negativas se regulan por medio de una proteína que reconoce una serie de secuencias repetidas dentro de la región ori, denominadas iterones. La regulación se produce en dos niveles:

1. Retrorregulación transcripcional: Para el inicio de la replicación se requiere la proteína RepA, codificada por el plásmido. Pero la RepA actúa a su vez como represor de su propia transcripción (autorregulación negativa), al unirse a las secuencias de su propio promotor. De este modo, la replicación queda estrictamente controlada, ya que si aumenta el número de copias del plásmido, también aumenta la concentración de RepA, con lo se inhibe la síntesis de más proteína RepA.
2. Regulación por el modelo del "esposado" o acoplamiento de copias del plásmido. Si hay pocas copias del plásmido en la célula, la proteína RepA actúa promoviendo el inicio de la replicación. Pero si hay más copias, la proteína RepA puede ligar a dos plásmidos, uniéndose a sus respectivas secuencias repetidas del iterón. De este modo, las dos copias quedan "esposadas" o acopladas entre sí, y no pueden ser usadas para inicio de replicación.

2.5 REPARTO DE LAS COPIAS A LAS CÉLULAS HIJAS

Muchos plásmidos poseen sistemas de reparto (= partición), que tienden a aseguar que una vez que el plásmido ha sido replicado, cada una de las células hijas va a recibir al menos una copia. A falta de un tal sistema, y se el reparto fuera aleatorio, de vez en cuando, las propias fluctuaciones de la segregación aleatoria harían que parte de la progenie no recibiera una copia, con lo que quedaría curada de ese plásmido.
El reparto de las copias a las células hijas se suele deber a las llamadas funciones par, que están cerca de los genes rep y de la zona ori. Se trata de cortas secuencias de ADN que de alguna manera aún no aclarada, debe unirse a alguna zona de la membrana de la bacteria que se duplica durante la división celular, de modo que cada copia, unida a una de esas zonas, se segrega a una célula hija.

2.6. INCOMPATIBILIDAD ENTRE PLÁSMIDOS Y GRUPOS DE INCOMPATIBILIDAD

Cada plásmido, dentro de la amplia diversidad de los que se conocen, se suele clasificar según elgrupo de incompatibilidad al que pertenece (los grupos de incompatibilidad se suelen denominar con las siglas Inc seguidas de una letra mayúscula (por ejemplo IncP, IncFII, etc.). Se dice que dos plásmidos son incompatibles cuando no pueden coexistir establemente en la misma bacteria en ausencia de una presión selectiva permanente. Grupo de incompatibilidad es el conjunto de plásmidos incompatibles entre sí. La incompatibilidad depende del hecho de que los distintos miembros de un mismo grupo poseen el mismo tipo de sistema de control del número de copias y de reparto de dichas copias a las células hijas. En cada célula con dos plásmidos distintos del mismo grupo de incompatibilidad, el número total de copias n_A+n_B = N (determinado por el sistema de control) no varía, pero por fluctuaciones aleatorias en el reparto, algunas células heredan más copias de uno de los plásmidos que del otro, y tras varias generaciones aparecen células carentes de uno o del otro plásmido (n_A = 0 y n_B = N, o viceversa).

3. ELEMENTOS GENÉTICOS TRANSPONIBLES | a Contenidos

Son entidades genéticas discretas que forman parte de cromosomas y de plásmidos, capaces de moverse de un lugar a otro del genomio (pasando a otros lugares del replicón original, o a otros replicones presentes en la misma bacteria). Como estudiaremos oportunamente en la sección de Genética, esta capacidad de transponerse se debe a un tipo de recombinación específica denominadotransposición. Existen varias clases de mecanismos de transposición, pero muchas de ellas suponen la simultánea replicación del elemento, de modo que queda una copia en el sitio original y aparece una copia nueva en la nueva localización.
Los elementos genéticos móviles acarrean una serie de reorganizaciones en los genomios: inversiones de segmentos genéticos, delecciones, inversiones, cointegraciones entre dos replicones, etc. Hay que resaltar que estos elementos no son replicones, es decir, no poseen la capacidad de replicación autónoma que hemos visto en cromosoma y plásmido, sino que son partes integrantes de los genomios de muchas bacterias, confiriendo plasticidad genética sobre la que pueden actuar mecanismos evolutivos. Esto hace que los genomios bacterianos, y sobre todo los plásmidos, sean relativamente dinámicos y maleables a escala evolutiva.
Los elementos genéticos transponibles más sencillos son las llamadas secuencias de inserción (IS): miden de 700 pares de bases (pb) a unas pocas kb. Tienen extremos inversamente repetidos que son reconocidos por una enzima responsable de la transposición (transposasa) codificada por la porción central. No confieren caracteres fenotípicos a la bacteria, sino que su única función es transponerse con baja frecuencia entre lugares distintos del genomio. Las IS están distribuidas por el genomio, en localizaciones y números variables según especies y cepas. Algunas Arqueobacterias parecen ser bastante ricas en secuencias de inserción.
Los transposones (Tn) son de mayor tamaño (de 2 a 50 kb). Tienen también terminales inversamente repetidos, que en algunos casos forman parte a su vez de sendas copias casi idénticas de un tipo de secuencia de inserción. La porción no repetida del Tn tiene al menos dos genes: uno codifica la transposasa, y otro codifica una propiedad no relacionada con la transposición, y que se traduce en algún rasgo fenotípico detectable (p. ej., resistencia a algún antibiótico).
Existe una categoría de transposones, llamados transposones conjugativos que presentan la propiedad de promover su diseminación de una bacteria a otra por conjugación.