Estudios de la microbiología

nutrición microbiana

CONCEPTOS BASICOS

             La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman del medio donde habitan las sustancias químicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominannutrientes, y se requieren para dos objetivos:

	fines energéticos (reacciones de mantenimiento);
	fines biosintéticos (reacciones plásticas o anabolismo).

            Las biosíntesis de nuevos componentes celulares son procesos que requieren energía procedente del medio ambiente. En el capítulo anterior vimos los principales modos de captación y obtención de energía existentes en las bacterias.

            Es importante tener claro desde el principio una serie de conceptos y nomenclaturas relacionados con los principales tipos de nutrición bacteriana. Puesto que, como acabamos de ver, la nutrición presenta un aspecto de aprovisionamiento de energía y otro de suministro de materiales para la síntesis celular, podemos hablar de dos “clasificaciones” de tipos de nutrición:

1)      Desde el punto de vista de los fines de aprovisionamiento de energía, las bacterias se pueden dividir en:

a)      litotrofas: son aquellas que sólo requieren sustancias inorgánicas sencillas (SH₂ S⁰, NH₃, NO₂^-, Fe, etc.).

b)      organotrofas: requieren compuestos orgánicos (hidratos de carbono, hidrocarburos, lípidos, proteínas, alcoholes...).

2)      Desde el punto de vista biosintético (o sea, para sus necesidades plásticas o de crecimiento), las bacterias se pueden dividir en:

a)      autotrofas: crecen sintetizando sus materiales a partir de sustancias inorgánicas sencillas. Ahora bien, habitualmente el concepto de autotrofía se limita a la capacidad de utilizar una fuente inorgánica de carbono, a saber, el CO₂.

b)      heterotrofas: su fuente de carbono es orgánica (si bien otros elementos distintos del C pueden ser captados en forma inorgánica).

Otros conceptos:

	autotrofas estrictas son aquellas bacterias incapaces de crecer usando materia orgánica como fuente de carbono.
	Mixotrofas son aquellas bacterias con metabolismo energético litotrofo (obtienen energía de compuestos inorgánicos), pero requieren sustancias orgánicas como nutrientes para su metabolismo biosintético.

            Sean autotrofas o heterotrofas, todas las bacterias necesitan captar una serie de elementos químicos, que se pueden clasificar (según las cantidades en que son requeridos) como

	macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg), y
	micronutrientes o elementos traza (Co, Cu, Zn, Mo...)([1])

            En la naturaleza, estos elementos se encuentran combinados, formando parte de sustancias orgánicas o inorgánicas. Algunos de los nutrientes serán incorporados para construir macromoléculas y estructuras celulares; otros solo sirven para la producción de energía, y no se incorporan directamente como material celular; finalmente, otros pueden ejercer ambos papeles.

            El mundo bacteriano, como conjunto, exhibe una gigantesca versatilidad metabólica de uso de nutrientes: desde autotrofos que obtienen su carbono por reducción del CO₂ y los demás elementos a partir de fuentes igualmente inorgánicas, hasta heterotrofos capaces de usar amplia gama de fuentes orgánicas de carbono.

            A su vez, dentro de los heterotrofos, podemos encontrar muchos y variados tipos de nutrición, desde bacterias metilotrofas que sólo usan metano o metanol como fuente de carbono y energía, hasta los muy versátiles Pseudomonas, que pueden recurrir a degradar más de 100 tipos de fuentes de C (incluyendo entre ellas sustancias tan “exóticas” como hidrocarburos alifáticos y cíclicos). De cualquier modo, entre los heterotrofos, una de las fuentes más típicas de carbono consiste en glucosa.

            En los heterotrofos-organotrofos, los sustratos carbonados (con un nivel de oxidación no muy distinto del material celular -CH₂O-) entran simultáneamente a:

	metabolismo energético (donde la fuente de C se transforma en CO2, o en CO2 junto con otras sustancias no totalmente oxidadas);
	metabolismo plástico (anabolismo = biosíntesis de nuevo material celular).

            Aunque dentro del mundo de los procariotas se encuentre tanta variedad de nutriciones, las bacterias que pueden nutrirse solamente de sustancias inorgánicas sencillas (H₂O, CO₂, N₂, NO₃^--, NH₃, SO₄⁼, fosfatos, etc.) son minoría, pero sus procesos metabólicos son muy interesantes. De hecho, existen tipos metabólicos que sólo han evolucionado en procariotas. Como paradigma de esto citaremos los microorganismos quimioautotrofos (o quimiolitoautotrofos): obtienen su energía de la oxidación de sustancias inorgánicas sencillas, el carbono procede del CO₂, y el resto de elementos a partir de sales inorgánicas, por lo que pueden vivir en soluciones de sales minerales en ausencia de luz.

            Lo habitual, sin embargo, es que muchas bacterias recurran, siempre que puedan, a tomar del medio ciertos compuestos más complejos, ya que carecen de ciertas rutas biosintéticas.

2          CLASES DE NUTRIENTES

Podemos clasificar los nutrientes en las siguientes categorías:

	Universales (es decir, aquellos que son requeridos por todos los procariotas): agua, CO2, fosfatos y sales minerales;
	Particulares;
	Factores de crecimiento.

2.1        NUTRIENTES UNIVERSALES

2.1.1        EL AGUA

            Las bacterias necesitan grandes cantidades de agua. De hecho, salvo excepciones, se pueden considerar como organismos acuáticos. Requieren cierto grado de humedad para crecer. Desde el punto de vista de sus posibles papeles, el agua es:

	el principal constituyente del protoplasto bacteriano;
	el medio universal donde ocurren las reacciones biológicas;
	un reactante en exceso (es decir, un producto resultante de algunas reacciones bioquímicas).

Las fuentes de agua pueden ser:

	endógena: procedente de procesos de oxido-reducción;
	exógena (la más importante): procedente del medio, y que difunde a través de las membranas.

Ahora bien, no toda el agua de un ambiente está disponible para la bacteria:

	Existen determinadas sustancias que absorben y superficies que adsorben de modo más o menos intenso moléculas de agua, dejándolas inasequibles para la bacteria.
	Los solutos disueltos en agua (p. ej., sales, azúcares) tienen afinidad por las moléculas de H2O que los rodean, por lo que éstas tampoco estarán a disposición del microorganismo.

La disponibilidad de agua se mide por un parámetro llamado actividad de agua o potencial de agua, indicativo del agua libre, y que se expresa como

a_W= P_S/P_W

donde P_S es la presión parcial de vapor de agua en la solución problema y P_W es la presión parcial de vapor del agua destilada.

¿Cómo medir el potencial de agua de un medio líquido determinado? Se mide la humedad relativa del aire que hay encima del medio (en frascos), y este valor se refiere al valor de 100, que es la humedad del aire encima del agua destilada. O sea, la a_W = humedad relativa/100).

Las bacterias tienen valores de a_W normalmente entre 0.90 y 0.99.

	Bacterias de hábitats oligotróficos (como Caulobacter, Spirillum) tienen aW cercanos a 1.
	Bacterias como Escherichia y Streptococcus, que viven en sangre y fluidos corporales, tienen aW de alrededor de 0.995.
	Bacterias marinas como ciertos Vibrio y Pseudomonas encuentran valores de 0.980.
	Ciertos bacilos Gram-positivos que resisten mejor la sequedad poseen valores de 0.950.
	En el extremo de resistencia encontramos ciertas bacterias xerófilas, capaces de vivir a aW muy bajos (en torno a 0.75). Muchas de estas bacterias viven de hecho en medios acuosos, pero donde gran parte del agua no está disponible por las razones arriba citadas: procariotas halófilos extremos, como la arquea Halobacterium, que habita en lagunas hipersalinas; bacterias (y sobre todo, ciertos microrganismos eucarióticos como levaduras) sacarófilos, que viven en jugos y zumos con altas concentraciones de azúcares.

2.1.2        EL CO₂

El anhidrido carbónico es requerido por todo tipo de bacterias:

	Las autotrofas lo requieren como fuente de carbono, y lo reducen usando como fuente de energía la luz (en el caso de las fotoautotrofas) u oxidaciones de determinadas sustancias inorgánicas (los quimioautolitotrofos).
	Las arqueas metanogénicas pueden usar el CO2 como aceptor de los electrones procedentes de la oxidación del H2, proceso por el que obtienen su energía de modo litotrofo:

CO₂ + 4H₂ --> CH₄ + 2H₂O    (DG'₀<0 span="">

Además, algunas arqueas no sólo usan CO₂ como aceptor de electrones para obtener energía, sino que, además lo usan como fuente de carbono celular (arqueas metanogénicas autotrofas).

Los heterotrofos, aunque no usan el CO2 como fuente de C ni como aceptor de electrones, necesitan pequeñas cantidades para las carboxilaciones en determinadas rutas anabólicas y catabólicas.

El origen del CO₂ puede ser:

	endógeno: procedente de descarboxilaciones que ocurren al degradar la fuente orgánica de carbono;
	exógeno: el CO2 de la atmósfera o disuelto en las soluciones acuosas.

Normalmente, las bacterias crecen a la concentración de CO₂ atmosférico (0.03%), pero algunas bacterias (Neisseria, Brucella), cuando se aislan por primera vez, requieren atmósferas enriquecidas, con 5-10% de CO₂. Ello parece deberse a que poseen alguna enzima con baja afinidad hacia el carbónico; sin embargo, tras varios subcultivos, suelen adaptarse a crecer a tensiones normales.

2.1.3        FÓSFORO

            Suele requerirse en forma de fosfatos, sea orgánicos o inorgánicos. Las bacterias que pueden usar los fosfatos orgánicos (merced a la posesión de fosfatasas) no dependen absolutamente de ellos, ya que pueden recurrir igualmente a los fosfatos inorgánicos. Los fosfatos orgánicos son hidrolizados por fosfatasas extracelulares o (en las Gram-negativas) periplásmicas (p.ej., la fosfatasa alcalina).

            El fósforo se usa principalmente para la síntesis de los ácidos nucleicos y los fosfolípidos, pero aparece también en coenzimas y en proteínas.

2.1.4        SALES MINERALES

Las sales minerales son la fuente de aniones (p. ej. el Cl^-) y de cationes para la célula. Los siguientes cationes, concretamente, se necesitan en cantidades relativamente grandes: K⁺, Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, Fe⁺⁺.

	El ión potasio (K+): interviene en la activación de una variedad de enzimas, incluyendo las que participan en la síntesis de proteínas. En Gram-positivas está asociado con los ácidos teicoicos de la pared.
	El ión magnesio (Mg++): estabiliza ribosomas, membranas y ácidos nucleicos; como cofactor en muchas reacciones, especialmente las que implican transferencia de grupos fosfato. Por ejemplo, en las reacciones que requieren ATP, el Mg++ puede unir la enzima al sustrato durante el mecanismo de acción de la primera. Participa de las clorofilas y bacterioclorofilas de bacterias fotosintéticas.
	El ión calcio (Ca++): es un cofactor de ciertas enzimas, como proteinasas.
	El hierro (principalmente como ión ferroso, Fe++) suele estar acomplejado en la naturaleza, formando sales insolubles. Las bacterias disponen de una serie de moléculas, denominadas sideróforos, capaces de captar ese hierro (p.ej., hidroxamatos y enterobactina). El hierro participa en muchas moléculas implicadas en procesos de respiración, como citocromos y ferroproteínas no hémicas (proteínas con Fe-S); interviene como cofactor en ciertas enzimas.

Aparte de estos iones que se requieren en cantidades relativamente grandes, las bacterias necesitan minúsculas cantidades de otros elementos (oligoelementos), a los que también se denomina como micronutrientes o elementos traza:

	El manganeso (Mn++) es un cofactor de ciertas enzimas, y a veces puede sustituir al Mg++.
	El cobalto (Co++) se requiere casi exclusivamente para la vitamina B12 (de hecho, si suministramos esta vitamina al medio, la bacteria se vuelve independiente del Co++ libre).
	El zinc interviene en la estabilización de complejos enzimáticos como las ADN- y ARN-polimerasas.
	El molibdeno participa en las llamadas molibdoflavoproteínas, implicadas en la asimilación de nitratos. Por otro lado, participa como cofactor, junto con el Fe, en el complejo nitrogenasa de las bacterias fijadoras de N2 atmosférico.
	El níquel participa en hidrogenasas, enzimas que captan o liberan H2.

2.2       NUTRIENTES PARTICULARES

2.3.1            NITRÓGENO Y AZUFRE

             Se trata de elementos que pueden ser cubiertos de modo muy distinto, dependiendo del tipo de bacteria que consideremos. Concretamente, los elementos N y S (que requieren todos los seres vivos) pueden ser captados por las bacterias de modos muy distintos, dependiendo de sus capacidades biosintéticas.

Tanto el N como el S se encuentran en la célula en estado reducido:

	el radical -NH2 forma parte de los aminoácidos (que a su vez son los sillares de las proteínas) y de las bases nitrogenadas (que participan en los ácidos nucleicos y en algunas coenzimas);
	el radical -SH interviene en determinados aminoácidos y en coenzimas como la CoA.

¿En qué formas químicas entran N y S a las bacterias?

La mayoría de bacterias fotosintéticas y muchas heterotrofas asimilan estos elementos en forma combinada inorgánica oxidada: como NO3--, merced a la actuación secuencial de nitrato-reductasas y nitrito-reductasas asimilatorias. como SO42-. Este sulfato se activa con ATP, y luego se reduce hasta sulfito y finalmente sulfhídrico, que ya tiene el estado de reducción adecuado para la incorporación del S.

Muchas bacterias heterotrofas pueden usar alguna forma reducida de N inorgánico: amonio (NH4+) de S inorgánico: sulfuros (S2-, SH-) de N orgánico: aminoácidos, péptidos de S orgánico:cisteína.

Muchas de las bacterias que pueden usar amonio como única fuente de nitrógeno también pueden usar nitratos.

2.3.2        FIJACIÓN DE NITRÓGENO

            La atmósfera contiene enormes cantidades de nitrógeno no combinado (libre) en estado gaseoso: el nitrógeno molecular o dinitrógeno (N₂), que procede de microorganismos desnitrificantes (véase el capítulo 10). Sin embargo, esta gran reserva sólo puede servir de fuente de nitrógeno a ciertos procariotas, las llamadas bacterias fijadoras de nitrógeno o diazotrofos. Esta notable capacidad bioquímica no ha evolucionado en eucariotas. (Lo más a que ha llegado la evolución es a seleccionar ciertos tipos de asociaciones simbióticas entre procariotas diazotrofos y ciertos eucariotas, como p. ej., la simbiosis entre raíces de leguminosas y bacterias del grupo de Rhizobium).

            La fijación del N₂ es un proceso de reducción que convierte el nitrógeno molecular en amoniaco, según la siguiente ecuación:

 N₂ + 8H⁺ + 8e + 18 ATP ---------> 2NH₃ + H₂ + 18 (ADP + P_i)

Esta reacción está catalizada por un complejo enzimático denominado nitrogenasa o dinitrogenasa, que consta de dos componentes:

	Componente I o nitrogenasa propiamente dicha; posee un cofactor de hierro y molibdeno (FeMoCo) que forma parte del centro activo. Por ello, a este componente también se le conoce como molibdoferroproteína. (En realidad existen dos copias del cofactor, cuya estequiometría es MoFe7S8-homocitrato)[2]
	Componente II o nitrogenasa-reductasa, que posee átomos de Fe acomplejados con S de determinadas cisteínas (por lo que este componente se denomina a vecesferroproteína).

Mecanismo del complejo dinitrogenasa:

Los electrones para la reducción llegan al complejo por medio de una ferredoxina o una flavodixina (FeS proteínas no hémicas), que los transfiere al componente II, que queda reducido. El componente II reducido se une a dos moléculas de ATP, y cambia su conformación, lo que le permite unirse al componente I. Entonces se produce la transferencia de electrones desde el componente II al componente I, con hidrólisis de ATP, lo que a su vez provoca la separación del componente II respecto del I. Una vez reducido el componente I (la molibdoferroproteína), éste transfiere los electrones (y los protones) al N₂, hasta convertirlo en dos moléculas de amoniaco. (El centro activo es FeMoCo). El amoniaco entra entonces en las rutas biosintéticas para convertirlo en N orgánico, incorporable a las macromoléculas.

Mecanismo de la nitrogenasa

Dos cosas llaman la atención de la reacción de la nitrogenasa:

	Obsérvese que la reacción requiere un gran aporte de energía en forma de al menos 18 ATP (en ocasiones puede llegar a 24 ATP). Ello se debe a que el dinitrógeno (NºN) es una molécula extremadamente inerte (su energía de disociación es de 940 kJ), y su reducción precisa una gran energía de activación para transferirle 6 electrones.
	Parte de la actividad nitrogenasa (así como ATP y electrones) “se pierden” en reducir dos iones H+ hasta H2. Se desconoce la razón de este “despilfarro”, pero se sabe que es un efecto intrínseco de este complejo enzimático.

            Un aspecto muy importante del complejo nitrogenasa es su extrema sensibilidad al oxígeno, de modo que queda rápida e irreversiblemente inactivado por este gas. Ahora bien, esto no significa que la capacidad de diazotrofía esté relegada a bacterias anaerobias, ya que, como veremos en la sección de taxonomía, la evolución ha “inventado” distintas estrategias para proteger a la nitrogenasa en fijadores aerobios:

	Eliminando rápidamente el O2 por una intensa respiración (ej: Azotobacter)
	Produciendo capas mucosas que retardan la entrada del oxígeno a la célula (en Azotobacter, Beijerinkia)
	En células especiales dotadas de mecanismos protectores, como el heteroquiste de las cianobacterias o los bacteroides de Rhizobium dentro de los nódulos radicales de las leguminosas
	Protección conformacional: en Azotobacter:  la nitrogenasa se une con proteínas protectoras

            Debido a lo “caro” que resulta fijar nitrógeno, no es extraño comprobar que este proceso esté regulado de forma muy estricta ante la presencia en el medio de fuentes combinadas de nitrógeno (nitratos, amonio, aminoácidos):

	la actividad nitrogenasa se ve inhibida ante la presencia de N combinado (nitratos, amonio, aminoácidos);
	ante N combinado, se reprime la transcripción de los genes codificadores de la nitrogenasa y demás funciones relacionadas (genes nif).

La nitrogenasa es una enzima relativamente “inespecífica”, ya que puede reducir otras pequeñas moléculas provistas de triples enlaces, como cianuros (NºC-) y acetileno (HCºCH). La reducción de acetileno a etileno sirve de base al método más usual de medir la actividad nitrogenasa, el llamado ensayo de reducción del acetileno, que se registra mediante aparatos de cromatografía gaseosa.

2.4       FACTORES DE CRECIMIENTO

             Los factores de crecimiento son moléculas orgánicas específicas que, en muy pequeña cantidad, algunas bacterias necesitan para crecer. Salvo excepciones no tienen función plástica (no son sillares de macromoléculas) ni sirven como fuente de energía. Suelen ser coenzimas o sus precursores, vitaminas, que determinadas bacterias no pueden fabricar por sí mismas, al carecer de parte o toda una ruta biosintética.

             Ejemplos: las bacterias del género Brucella requieren como factores de crecimiento en sus medios de cultivo la biotina, niacina, tiamina y ácido pantoténico. Haemophilus necesita suplementos de grupos hemo y piridín-nucleótidos.

            En la siguiente tabla se muestran algunas de las vitaminas y cofactores requeridos por algunas bacterias:

Factor o vitamina	funciones principales
p-aminobenzoico (PABA)	precursor del ácido fólico
Acido fólico	metabolismo de compuestos C1, transferencia de grupos metilo
Biotina	biosíntesis de ácidos grasos; fijación de CO2
Cobalamina (vitamina B12)	reducción y transferencia de compuestos C1; síntesis de desoxirribosa
Niacina (ácido nicotínico)	precursor del NAD; transferencia de electrones en reacciones redox
Riboflavina	precursor de FAD y FMN
ácido pantoténico	precursor de la CoA
Tiamina (vitamina B1)	descarboxilaciones; transcetolasas.
Complejo B6 (piridoxal, piridoxamina)	transformaciones de aminoácidos y cetoácidos
Grupo Vitamina K, quinonas	transportadores de electrones (ubiquinonas, menaquinonas, etc.)

3         MEDIOS DE CULTIVO

(NOTA: esta parte del tema es para que te sirva de cara a las prácticas de la asignatura, que es el sitio ideal para aprender sobre los medios de cultivo, su fundamento y sus variedades).

            El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el laboratorio. Como acabamos de ver, en general, todos los microorganismos tienen parecidos requerimientos de macro- y micronutrientes, aunque ha quedado claro que la forma en que cada nutriente es captado puede variar mucho entre unas bacterias y otras, así como la cantidad relativa de cada nutriente. Los microbiólogos, en su trabajo cotidiano, están acostumbrados a manejar multitud de “recetas” o fórmulas correspondientes a muchos tipos de medios de cultivo.

            Un medio de cultivo es una solución acuosa (bien como tal, o bien incorporada a un coloide en estado de gel) en la que están presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de un(os) determinado(s) microorganismo(s). Los medios de cultivo se pueden clasificar, en primera instancia, en tres grandes tipos:

1) Medios complejos o indefinidos: su composición química exacta se desconoce, ya que son el producto de realizar infusiones y extractos de materiales naturales complejos:

 Ejemplos:

	Digeridos crudos de extracto de carne
	Digeridos de extracto de levadura
	Digeridos de peptona de carne o de soja
	Digeridos de caseína (de la leche).

            Con ellos se logra un tipo de medio rico nutricionalmente, aunque indefinido químicamente. Si lo que pretendemos simplemente es obtener un buen crecimiento bacteriano, este tipo de medios es ideal, ya que su confección es fácil y rápida (basta pesar una cierta cantidad del extracto desecado, suministrado por casas comerciales, disolverlo en agua y esterilizar en autoclave, antes de inocular e incubar la bacteria con la que queramos trabajar). Estos medios contienen fuentes variadas de C y N orgánicos, sales minerales y micronutrientes. Sin embargo, con ellos no podemos tener un control nutricional preciso, ya que desconocemos la composición química y proporción exacta de los distintos nutrientes.

2) Medios sintéticos o definidos: se obtienen disolviendo en agua destilada cantidades concretas de distintas sustancias químicas puras, orgánicas y/o inorgánicas. La composición concreta de un medio sintético dependerá de la bacteria que queramos cultivar: lógicamente, un medio definido para una bacteria con grandes capacidades biosintéticas será más sencillo que el medio definido de otra bacteria con menores posibilidades biosintéticas. En la tabla siguiente se dan las composiciones de sendos medios sintéticos para dos bacterias diferentes.

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 Medio sintético para Escherichia coli                                              Medio sintético para Leuconostoc mesenteroides

              K₂HPO₄                                 7.0 g                                               K₂HPO₄                                 0.6 g

              KH₂PO₄                                 2.0 g                                               KH₂PO₄                                 0.6 g

              (NH₄)₂SO₄                             1.0 g                                              NH₄Cl                                    3.0 g

              MgSO₄                                   0.1 g                                              MgSO₄                                   0.1 g

              CaCl₂                                     0.02 g                                           Glucosa                                  25  g

              Glucosa                                  10  g                                            acetato sódico                        20  g

              microelementos:

             (Fe, Co, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo) 2-10 mg cada uno

              agua destilada                         1000 ml                                  aminoácidos (los 20)              100-200 mg cada uno

                                                                                                                    purinas (adenina, guanina)     10 mg cada una

                                                                                                                    pirimidinas (uracilo, xantina), 10 mg cada una

                                                                                                                    vitaminas: biotina, fólico,                                                                                                                     nicotínico, piridoxal, piridoxamina,                                                                                                                        piridoxina, riboflavina, tiamina,                                                                                                                     pantoténico, PABA)......        0.01-1 mg cada una

                                                                                                                    elementos traza                      2-10 mg cada uno

                                                                                                                    agua destilada                         1000 ml

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Como se puede deducir de la tabla anterior, Escherichia coli posee muchísimas capacidades biosintéticas, ya que puede crecer en un medio confeccionado exclusivamente a base de glucosa y sales minerales. (Aún más impresionantes son las bacterias autotrofas, que ni siquiera requieren fuente orgánica de carbono, y se “apañan” con medios a base de sales solamente).

En cambio, Leuconostoc, a más de fuente orgánica de C y sales similares a las necesitadas por E. coli, precisa una enorme diversidad de sustancias adicionales, incluyendo todos los aminoácidos proteinogenéticos, las bases nitrogenadas y un buen muestrario de vitaminas.

3) En tercer lugar, podemos fabricar un tipo de medio “mezcla” de los anteriores, denominado medio semisintético: llevan algunas sustancias químicas cuya naturaleza y cantidad conocemos, junto con sustancias de naturaleza y composición indefinidas.

Cualquiera que sea el tipo de medio, de los tres que acabamos de citar, podemos elaborar dos tipos de “versiones”, según su estado aparente:

	medios líquidos (por ejemplo, los dos de la tabla)
	medios sólidos: derivan de los líquidos simplemente añadiendo a la solución nutritiva un coloide en estado de gel, que solidifica (da consistencia) a esta solución.

En los primeros tiempos de la Bacteriología sólo se conocía como sustancia gelificante incorporable a los medios la gelatina. Sin embargo, presenta muchos inconvenientes, ya que funde a 25^oC (por encima de esta temperatura el medio se licúa), y además, muchas bacterias presentan gelatinasas que hidrolizan la gelatina.

El gelificante más usado es el agar-agar, extraído de algas rojas (p. ej. Gelidium), del cual existen versiones más o menos purificadas (las más puras están más enriquecidas en el polisacárido agarosa; son las que se emplean para los medios definidos, con objeto de evitar la introducción de sustancias "contaminantes" inadvertidas que falseen las interpretaciones sobre el comportamiento nutricional de la bacteria). El agar presenta la gran ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta cerca de los 100^oC, lo que permite su uso para la inmensa mayoría de bacterias, que son mesófilas. Un comportamiento notable del agar es que una vez fundido (a 100ºC), no gelifica (solidifica) hasta los 45ºC. En este margen de temperatura hasta el límite de solidificación de 45ºC se dice que el agar está en sobrefusión.

Para cultivar ciertas bacterias (sobre todo los quimioautotrofos) se suele recurrir a un gelificante inorgánico, el silicagel o gel de sílice.

Finalmente, introduciremos otra serie de conceptos relativos a medios de cultivo, que al igual que los anteriores, serán tratados con la suficiente amplitud en las sesiones de clases prácticas:

Medios selectivos son aquellos que permiten seleccionar un tipo (o unos pocos tipos) de microorganismos. En el laboratorio se emplean mucho medios selectivos sólidos que incorporan ciertas sustancias que inhiben el crecimiento de ciertas bacterias, pero permiten el crecimiento de otras. (P. ej. medios que llevan violeta cristal inhiben el crecimiento de bacterias Gram-positivas.

Medios diferenciales son aquellos que permiten distinguir a simple vista dos o más tipos de bacterias en función de su distinto comportamiento respecto de algún nutriente del medio. Ese comportamiento diferencial se traduce normalmente en un viraje de color de una sustancia indicadora presente en el medio.

Ejemplos:

	en el medio EMB (eosina-azul de metileno) ciertos tipos metabólicos de bacterias producen cambios de color y precipitación de sales cuando producen ácidos por fermentación de ciertas fuentes de carbono.
	El medio llamado agar-sangre lleva un 5% de sangre de caballo o carnero, lo cual revela la capacidad (y el tipo) de hemolisis de ciertas bacterias.

Algunos medios son simultáneamente selectivos y diferenciales.

P. ej., el agar de MacConkey, que el alumno manejará en la segunda tanda de prácticas. Se trata de un medio de color rosado y transparente, que posee, entre otras sustancias, lactosa, peptonas, el colorante vital rojo neutro, sales biliares y violeta cristal.

Este medio es selectivo contra muchas bacterias Gram-positivas debido al violeta cristal, y también contraselecciona muchas Gram-negativas debido a las sales biliares (que son agentes tensioactivos que desorganizan muchas membranas externas). En cambio, las Enterobacterias están evolutivamente adaptadas a soportar sales biliares en su hábitat natural (el intestino de vertebrados superiores), y pueden crecer en este medio.

En su faceta de medio diferencial, el agar MacConkey permite visualizar dos tipos de Enterobacterias según que puedan o no fermentar la lactosa, con producción de ácidos. Las bacterias fermentadoras de lactosa (Lac⁺), excretan al medio gran cantidad de ácidos orgánicos, lo que provoca que sus colonias, y sus alrededores aparezcan de color rojo intenso, debido al viraje del rojo neutro; además, se forma un halo turbio a cierta distancia de estas colonias, fenómeno ocasionado por la precipitación de las sales biliares inducida por la acidez. En cambio, las bacterias Lac^-, al no poder usar la lactosa, recurren como fuente de C a las peptonas, a las que desaminan: incorporan el esqueleto carbonado, excretando iones NH₄⁺, que alcalinizan el medio de cultivo, lo cual se traduce en que el indicador rojo neutro vira a amarillo.