Estudios de la microbiología

historia de la microbiología

Microbiología: Es la biología de los microorganismos. Ciencia que estudia los microorganismos:
- Composición, estructura y función de microorganismos y sus componentes celulares: Morfología y Citología.
- Crecimiento, reproducción y actividades metabólicas: Fisiología y Bioquímica.
- Relaciones filogenéticas y taxonomía: Sistemática.
- Mecanismos genéticos: Genética.
- Distribución, cambios en el medio ambiente y relaciones con otros seres vivos: Ecología.
- También estudia: Patogeneidad e Inmunología (Quimioterapia, antibioterapia, Microbiología industrial y biotecnología).
Microorganismos: Aquellos seres vivos que por ser de pequeño tamaño, no pueden ser visualizados por el ojo humano, necesitando para ello el MICROSCOPIO. Las características de estos microorganismos son las siguientes:
- Tamaño: su escaso tamaño ha hecho que se descubrimiento fuera tardío, aunque no su utilización. Se descubrieron con la aparición de los microscopios (juego de lentes), por lo tanto, apareció una relación entre microorganismo y microscopio, y tenemos que a mejor instrumento, mayor conocimiento lograremos de ese microorganismo.
- Para el estudio de este tipo de seres vivos se necesitan unas técnicas únicas, las denominadas técnicas microbiológicas. Dichas técnicas se necesitan para el estudio de cultivos puros, en los cuales separamos diferentes microorganismos. Para ello, utilizamos placas petri, en cuyo interior ponemos un medio de cultivo (sustancia que necesita el microorganismo para desarrollarse). Surgirán numerosas colonias diferentes que provienen de una única célula, generadas por división binaria, y que ya podemos observar perfectamente. Esto es un cultivo puro, y ya podemos separarlo de los demás microorganismos.
- Pueden ser unicelulares o pluricelulares, pero en ninguno puede observarse la diferenciación de tejidos. En algunos hongos filamentosos podemos diferenciar las hifas, pero todas las células van a ser idénticas.
Así, podemos definir MICROORGANISMOS como: todos aquellos seres vivos unicelulares o pluricelulares, carentes de organización tisular, que por su pequeño tamaño escapan a la percepción del ojo humano y para cuyo estudio, se requiere la metodología del cultivo puro.

La microbiología es una ciencia muy nueva, aunque los organismos que estudia hayan sido los primeros en poblar la tierra. Hasta el siglo XVII no se empezó a suponer la existencia de microorganismos.
1676, Leeuwanhoeck. Comerciante holandés que se dedicó a pulir lentes y a observar todos los tejidos que iba construyendo. Estudió granos de polen, fluidos corporales, sarro de los dientes, y vio unas pequeñas estructuras que podían moverse y las llamó animáculos. La Royal Society entró en el asunto. Entonces surgió la pregunta siguiente, de donde provienen estos animáculos?
Por un lado están los partidarios partidarios de la generación espontanea, por otro lado están los partidarios de que parten de otros animáculos o de otro organismo diferente.
1688, Francisco Redi. Acaba con la idea de la generación espontánea (Experimento de Redi). Utiliza unos botes de cristal con trozos de carne, dichos botes los tapa con unas gasas que permiten el paso del aire pero de nada más, entonces no se generan "animáculos" en estos trozos de carne. La solución está en las larvas que son depositadas por moscas que se posaban en la carne, en los botes sin tapar, y hacían posible la aparición de esos "animáculos".
1765-1775 Spallauzani. El calentamiento puede evitar la aparición de los animáculos, pero cuando aparecían era por el aire que entraba, por lo que se dedujo que estaban en el aire.
A principios del siglo XIX aparece la industria conservera (Método de la apertización), que consiste en el sistema que tienen las latas de conservas que actualmente consumimos.
Al mismo tiempo Lavoisier estudia la química de los gases y hace un estudio en profundidad del oxígeno (vital para todo), trata de echar por tierra la teoría de Spallauzani, tanto Appert como Spallauzani dicen que el problema es que no hay oxígeno y por eso no se desarrollan los animáculos.
1861, Luis Pasteur. Demuestra que hay animáculos en el aire, pasando un tubo con aire y un algodón en el medio impregnado de eter. Lo miraba al microscopio y veía organismos, pero en cambio cuando lo hacía con aire caliente no veía absolutamente nada.

Tindal. Trabaja con una serie de infusiones de caldo caliente y veía que no se desarrollaban microorganismos. Con 5 o 10 minutos en las de carne tampoco se desarrollaban organismos. Luego probó con heno y si que aparecían microorganismos. Tindal pensó que debía haber microorganismos que formaran estructuras de resistencia. Tindalización: Método por el cual se realizan calentamientos cortos pero dejando un espacio largo de tiempo entre medias.
Cohen. Generación de estructuras de resistencia llamadas esporas (aguantaban los 100º de Tindal).
Lille. Utilizan los métodos de Pasteur para su fabricación de alcohol partiendo de remolacha.
Pasteur descubrió que había diferentes microorganismos cuando el proceso de la fabricación del alcohol salía bien y otros cuando salía mal. Pasteur se pasó mucho tiempo estudiando el fenómeno de las fermentaciones. Estudió la fermentación butírica, y se dio cuenta que en ausencia de oxígeno también podían aparecer microorganismos. Pasteur es el primero que introduce los términos de aerobio y anaerobio. (aerobio=los microorganismos aparecen con oxígeno, anaerobio=organismos que pueden aparecer sin oxígeno).
Pasteur llegó a la conclusión que estos microorganismos que veía y estudiaba, podían estar implicados en las "enfermedades" de las fermentaciones.
1850, Rayer. Observó que en la sangre de animales enfermos, había organismos que podían ser causantes de la enfermedad. Carbunco y Antrax son enfermedades con las que estudió Rayer.
Los organismos afectados tenían un determinado microorganismos en la sangre.
1876, Koch. Médico rural alemán que observó la presencia de microorganismos en la sangre de animales. Fue el primero que desarrolló o que aisló un microorganismo en cultivo puro. Postulados de Koch: Un microorganismo es el responsable de una enfermedad o de otro proceso cualquiera.
Postulado 1: El microorganismo debe estar presente en animales afectados y ausente en los sanos.
Postulado 2: El microorganismo debe ser aislado en un medio de cultivo puro.
Postulados 3 y 4: Este microorganismo que hemos obtenido, inoculado en un animal sano, nos proporciona otros microorganismos parecidos a los primeros obtenidos y el animal debe enfermar también. Koch realizó cultivos con patatas.
1883, Hesse. Utilizó agar-agar que es lo que se utiliza en la actualidad.
Petri. Inventor de la famosa placa Petri. Estos dos descubrimientos, el de Hesse y el de Petri, potenciaron la microbiología de una forma extraordinaria.
Por esta época se aíslan la mayoría de los responsables de las enfermedades contagiosas que estaban causando estragos en esos años, tales como la difteria, paludismo, cólera...
A finales del siglo XIX se conocían los causantes de la mayoría de las enfermedades infecciosas. Como ya se conocían, los estudios se centraron en el control de éstas y se empieza a hablar de asepsia, quimioterapia y antibioterapia.
Hacia el 1840 se comienza a usar la anestesia en intervenciones quirúrgicas, y con la introducción de estas se mejoran las técnicas quirúrgicas, pero aumentan las enfermedades y las muertes post-operatorias.
1847 Sommerfield. Médico austríaco que recomienda la limpieza de las manos con agua de cal, pero no tiene nada de éxito. (asepsia)
20 años después, en 1867 se recomienda la esterilización de materiales y la utilización de desinfectantes post-operatorios. (Lister)
También se comienzan a buscar sustancias letales para los microorganismos pero que no lo sean para el hombre. (quimioterapia).
Erlhichs. Utiliza un compuesto llamado Salvarsan (compuesto a base de sales arsenicales) para el tratamiento de la sífilis. Al mismo tiempo, Tindal y Pasteur llegan a una conclusión muy importante, piensan que el tratamiento de enfermedades se podía solucionar con bacterias.
FLEMING. Estaba aislando estafilococos, y se le contaminaron con un hongo, pero se dio cuenta que donde estaba ese hongo se inhibía el crecimiento de la bacteria, por lo tanto siguió estudiando este fenómeno.
Florey y Chang. Penicillium notatum Aíslan la penicilina. Fue el primer antibiótico que se desarrolló. La terramicina (1950) y la estreptomicina siguieron a la penicilina.

bacillus cereus

CARACTERISTICAS

• Son bacterias Gram positivas, familia bacillaceae
• Aerobio y anaerobio facultativo
• Esporulado: las esporas son centrales, forma elipsoide y al formarse en el interior de la célula dan lugar al hinchamiento de esta.
• Crecen entre los 10 - 48º, la temperatura óptima es entre 28 - 35º.
• Generalmente son móviles con flagelos perítricos.
• Poseen antígenos somáticos y flagelares y de esporas.
• Las reacciones serológicas no se usan en su identificación, ya que dan reacciones cruzadas con otros géneros.
• Los antígenos de las esporas son termoresistentes al igual que las propias esporas
• pH = 4,9 - 9,3; Aw = 0,93 - 0,95.
• Para la germinación en el momento que se agota el medio, al final de la fase exponencial ocurre la esporulación porque son menos exigentes. La germinación de las esporas es a 30º. Las esporas son moderadamente resistentes al calor. Resisten 100º durante 5-10 minutos.

ENZIMAS Y TOXINAS QUE PRODUCE B. CEREUS

Lecitinasa (fosfolipasa), se puede detectar porque estos microorganismos dan lugar a una reacción típica de precipitación cuando crecen en medios con yema de huevo. Es una sustancia que puede estar relacionada con efectos necróticos de células intestinales.

Hemolisina, produce la lisis de glóbulos rojos

Factor letal, produce la muerte de conejos cuando se inyectan por vía endovenosa

Factor de permeabilidad vascular, produce alteraciones en vasos sanguineos ya que altera su permeabilidad.

Toxina necrótica, relacionada con la lecitina y produce necrosis de las células del epitelio intestinal

Toxina emética, produce vomitos. Toxina estable a 126º durante 90 minutos. Estable a pH 2 y 11 durante 2 horas, puede sobrevivir en los alimentos.

Factor del asa ileal de conejo, origina diarrea y salida de líquido en experimentación.

Todas esta sustancias se producen a lo largo de la fase exponencial o al final de la misma por las células vegetativas

HABITAT Y EPIDEMIOLOGIA

• Es ubicuo
• Se puede aislar frecuentemente de alimentos naturales e industrializados
• Cuando se ingiere en cantidades pequeñas no produce clínica aparente
• Se empezo a asociar a alimentos en los años 50.
• En los casos de intoxicación los alimentos pueden haber sido tratados pero si se dejan enfriar a temperatura ambiente pueden germinar las esporas, conviene enfriar con rapidez y conservar a temperatura de refrigeración.
• En la leche es frecuente que lleguen a las ubres de las vacas y si estas no son esterilizadas antes del ordeño pueden pasar a la leche, se produce la posterior germinación de las esporas y alteran la leche lo cual puede ser detectado.
• Alimentos que pueden estar implicados: pasteles con crema, carnes y verduras, sopas, salsas, ensaladas, arroz hervido.

PODER PATOGENO

• Toxina hemética, enterotoxina, la parte activa es una sustancia de bajo peso molecular (10.000), es estable al calor (resiste 120º durante 1 hora)
• Factor del asa ileal de conejo, enterotoxina diarreica, proteina de peso molecular 38000-50000, se inactiva por calentamiento a 56º durante 5 minutos, es termolábil.

CUADRO CLINICO

Síndrome emético, nauseas y vomitos se producen al cabo de 1-5 horas, la diarrea no es tan frecuente.

Síndrome diarreico, período de incubación de 8 a 10 horas, dolor abdominal y diarrea, la clínica desaparece a las 12-24 horas.

INVESTIGACION EN ALIMENTOS

En un brote de intoxicación va a ser fácil identificarla, mientras que cuando se encuentra en número bajo es más complicado por acciones competitivas.

Aislamiento

Agar manitol

Las colonias aparecen rodeadas de un halo de precipitación blanco sobre fondo rosa-rojo-violeta, las que fermentan el manitol de color amarillo, a las 24 horas las colonias son circulares y lisas, a las 48 horas grandes y rugosas con estrías, nº de colonias x factor de dilución = nº U.F.C. / g.

Las colonias sospechosas se trnasfieren a un agar nutritivo y se incuba.

Sembramos en agar para anaerobios sin glucosa ni indicador, sembramos en picadura, se añade parafina, incubamos a 31º 24 hora, si hay crecimiento es Bacillus cereus.

Caldo glucosa sin fosfato, prueba de Voges Proskaguer (VP+), detectar acetil metil carbinol, añadir reactivos y añadir cristales de creatina para que la reacción sea más rápida.

Agar nutritivo glucosa, incubar a 31º 24-48 horas, se realiza la tinción con fuschina y el polihidroxibutirato (material de reserva) no se tiñe.

Caldo nitrato, la prueba es positiva si hay transformación del nitrato en nitrito.

Movilidad, se siembra en agar en un medio semisólido en picadura, si el microorganismo es movil crece por todo el medio.

Se puede calcular el NMP cuando se sospecha que el alimento tenga menos de 10 UFC/ml. A partir de diluciones decimáles se siembran en: caldo tripticasa a 31º durante 48 horas, de los tubos en crecimiento se siembran en Mossel y se confirma.

PREVENCION Y CONTROL

• Evitar que se multipliquen en los alimentos
• Cocinar los alimentos antes de servirlos
• Enfriarlos rapidamente y refrigerar
• Control en los platos preparados

Clostridium Botulinum

CARACTERISTICAS

• G (+), familia Bacillaceae, esporulados, anaerobios, sin cápsula.
• Bacilos rectos o ligeramente curvados de 2-10 x 0,5-2 micras.
• Esporas ovales, subterminales y deformán la célula cuando se producen.
• El comportamiento metabólico no es uniforme referentes a la proteolisis y a la producción de exotoxinas.
• Producen 7 toxinas serolicamente diferentes y aunque con acción farmacologica igual se les designa con letras de la A a la G y las cepas productoras también llevan la misma nomenclatura.
• Moviles mediante flagelos perítricos y con 4 antígenos distintos: somático, flagelar, esporas. endotoxinas.
• Es el productor del Botulismo
• Es una toxiinfección alimentaria producida por ingerir alimentos con la toxina.
• La forma vegetativa es sensible, la cepa E se puede destruir a 45º, debido a que son psicótrofas.
• La mayor parte de cepas fermentan carbohidratos
• No reducen los nitritos a nitratos
• Producen sulfidrico y acetil metil carbinol (VP+).
• Las esporas son más resistentes al calor, resisten 105º durante 10 minutos, a excepción de las esporas de las cepas E que se inactivan a 80º durante 6-10 minutos.
• Las esporas en condiciones normales de sequedad en el ambiente viven años.
• pH óptimo de 4,6 - 8 para la célula vegetativa
• Temperatura óptima de 25-35º
• Sensible a las sal, necesitan una concentracion de sal inferior al 10% y Aw > 0,935 y condiciones de anaerobiosis.

HABITAT Y EPIDEMIOLOGIA

• El reservorio es el ire, tierra y polvo, también pueden estar en el agua; existe botulismo animal con clínica similar, la intoxicación con conservas caseras es más frecuente que con las conservas industriales.
• La incidencia está asociada a los distintos tipos de suelo: Cepa A, suelos neutros o alcalinos; Cepa B, suelos ricos en materia orgánica; Cepa C,D suelos variados; Cepa E, suelos húmedos.
• La presencia de otras cepas competitivas junto al clostridium pueden influir en el crecimiento de este. De esta forma los lactobacilos y enterobacterias originan ácidos que impiden el crecimiento del Clostridium, otros microorganismos producen pH neutro o alcalino como muchas bacterias o mohos en las conservas de tomate y de esta forma favorecen al clostridium.
• Los alimentos que podrían estar implicados: las conservas (vegetal y animal) sobre todo las caseras ya que estas no suelen reunir las condiciones térmicas adecuadas y no se inactivan todas las esporas, tienen que darse condiciones de anaerobiosis, por regla general los alimentos ácidos y salados son inhibidores. La miel es peligrosa debido a un potencial uso en niños, puede aparecer el Botulismo infantil.

PATOGENIA

Es debida a la producción de toxinas que aparecen al crecer el microorganismo en los alimentos. Las toxinas son proteicas y termolábiles, se destruyen a 100º durante 5 minutos, a 80º durante 30 minutos o a 70º durante 60 minutos. Se producen como prototoxinas que necesitan ser activadas por enzimas proteoliticos que pueden ser de origen endogeno o exógeno. Las toxinas purificadas obtenidas en el laboratorio aparecen como complejos de toxinas y otras sustancias (hemaglutininas). Los diferentes tipos de toxinas se diferencian en el grado de polimerización, en la composición de aa y en el requerimiento de activación del enzima. Las toxinas botulínicas A son muy tóxicas (neurotóxicas), tienen gran afinidad por las células nerviosas.

MECANISMO DE ACCION

Son ingeridas con los alimentos, absorbiendose en el estómago o intestino delgado, tambien a través de heridas en condiciones de anaerobiosis; pasan a sangre y a la linfa donde son transportadas a los lugares de acción, llegan a las terminaciones nerviosas colinérgicas del S.N periférico, inhibiendo la liberación de acetil colina, de todas formas existe impulso nervioso y la sensibilidad de la célula no está alterada, no tienen actividad sobre el sistema nervioso central.

CLINICA

Incubación de 18-36 horas.

Síntomas: parálisis flácida, simétrica y descendente, en principio no cursa con fiebre aunque posteriores infecciones si pueden darla. El individuo se mantiene consciente, pulso normal, nauseas, vómitos, visión borrosa, dilatación del ojo, dificultad de deglución, las mucosas orales presentan aspecto seco, debilidad muscular, la muerte aparece por parada cardiorespiratoria al cabo de una semana. existen antitoxinas comerciales, si es tratado puede haber recuperación pero de larga convalecencia. El botulismo a aprtir de heridas presenta clinica similar, pero no existe cuadro gástrico. El botulismo infantil se caracteriza por: estreñimiento, al cabo de 1-30 días de la ingestión aparece dificultad en la succión, llanto, en los casos más graves muerte súbita (la miel juega un papel importante)

PREVENCION Y CONTROL

Someter a los alimentos conservados de acidez escasa a alta temperatura. Con los productos cárnicos curados se usan tratamientos térmicos no esterilizantes a 60º con nitritos como agente conservante y de baja Aw.

INVESTIGACION

Se trata de poner de manifiesto y detectar la toxina en el alimento, solo cuando se producen casos de botulismo es interesante buscar la espora y toxina en el alimento.. La toxina botulinica es muy tóxica por lo que su manipulación debe hacerse con cuidado, puede producirse la inmunización del personal así como disponer insitu de la antitoxina bajo control facultativo.

Preparación de la muestra

Se esteriliza la lata por donde se va abrir con alcohol y se flamea con cuidado porque las toxinas son sensibles al calor, se debe observar las caracteristicas del envase: si está hinchado, color,... Se mezclan a partes iguales muestra y tampón fosfato, homogeneizamos y se centrifuga a 3500 rpm durante 30 minutos a 4º, desde esta forma precipitan todos los sólidos y queda sobrenadante claro, en el sobrenadante se detecta la toxina y en el sedimento se detectan las cálulas o esporas.

Sedimento

Se alienta para eliminar la flora competitiva y formas vegetativas, se debe trabajar con muestras no calentadas para ver la presencia de toxina E, hacen falta 3 baterías de tubos con 15 ml de caldo de carne cocida, en tres tubos caliento a baño a 60º, otros 3 tubos caliento a 80º y otros tres tubos sin calentar. Siembro cada tubo con 1 ml. de muestra y luego se someten a la misma temperatura durante 30 minutos. En los tubos de 60º y 80º mueren las formas vegetativas y esporas del grupo E, en los tubos a temperatura ambiente no muere nada. Luego incubamos a 30º durante 5 días, si al cabo de 5 días no hay crecimiento se dejan otros 15 días por si tarda en germinar, se hace la tinción de Gram y ver si son positivos. El cultivo se centrifuga refrigerado y obtengo un sobrenadante (b) y un sedimento. A partir del sedimento se siembra en agar yema de huevo para anaerobios y se incuba a 30º durante 72 horas. Las colonias de clostridium son con borde regular rodeadas de precipitado amarillento debido a la actividad lipolítica que da lugar a ácidos grasos que precipitan son de aspecto nacarado. Se seleccionan las colonias típicas y se vuelven a sembrar en caldo de carne cocida o en caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levadura con tripsina. Si se sospecha de esporas E, para activarla incubamos a 25-26º.

Sobrenadante

Tengo dos: el de la suspensión fosfato y el del cultivo.

Se divide en tres alicuotas: una se calienta a 100º durante 5 minutos; otra sin calentar se diluye 1:5 y a la otra se añade tripsina 1 % tampón fosfato. Con esto se inoculan 2 ratones blancos de un peso de 18-20º y se añade 0,5 ml vía intraperotoneal. Se observan los síntomas durante 72 horas. Normalmente a las 24 horas el pelo aparece erizado, la respiración dificil, contracción abdominal, debilidad en las extremidades, paralisis progresiva, disnea y muerte. ( existen sueros comerciales antitóxicos)

Para tipificar la toxina:

1.- Se diluye 1:5 la antitoxina polivalente en solución fisiológica esteril 0,85 % y se mezclan, 0,5 ml. de muestra y 0,5 ml. de antitoxina se mezcla bien y reposo 1 hora. Inoculo a dos ratones con 0,5 ml vía intraperitoneal y veo la clínica.

2.- Inocular vía intraperitoneal los ratones con 0,5 ml de las antitoxinas, dejamos 1 hora y posteriormente se inocula la muestra ( 0,5 ml. diluida 1:5 ), se deja 72 horas y se ven los resultados.

 Clostridium Botulinum

CARACTERISTICAS

• Son bacilos G(+), rectos de 4-8 x 0,5-1,5 micras, familia Bacillaceae.
• Esporulan en medios definidos, esporas ovaladas subterminales y no abomban la célula, inmoviles y anaerobios estrictos.
• Producen sulfidrico, lecitinasa, reducen los nitritos, fermentan azucares
• Producen 4 toxinas y se clasifican en A, B, C, D, E. En el hombre interesa la A que es la que produce la gangrena gaseosa y las toxiinfecciones alimentarias, las cepas A producen la toxina alfa, las del tipo C son las responsables de la enteritis necrosante.
• Son microorganismos con necesidades complejas en su cultivo necesitan aminoacidos y factores de crecimiento. La temperatura óptima de las toxinas es 43-47º, la máxima 50º, aunque la temperatura depende de la cepa. Las toxinas necesitan un pH próximo a 7,5 y las especies vegetativas son muy sensibles al oxígeno.
• Existe antagonismo entre el clostridium y algunas especies de streptococcus y lactobacillus, estas últimas al crecer dan pH ácidos e inhiben al clostridium, las formas vegetativas son sensibles a la refrigeración y congelación. Las esporas son bastante resistentes al calor, resisten 100º 1 hora, la germinación se produce a 70-80º.

HABITAT Y EPIDEMIOLOGIA

Es uno de los más distribuidos, el reservorio es el suelo, polvo, tubo digestivo, piel, las moscas contribuyen al transporte de las esporas.

En frío cualquier alimento puede vehiculizarlo, los brotes principales han sido en alimentos cárnicos, en comidas preparadas en grandes cantidades o en salsas, incluso contaminación in situ por manipuladores, el tipo C fue el responsable en Alemania después de la 2ª Guerra Mundial de necrosis entéricas por ingestión de conservas de carne.

PATOLOGIA

Se debe a la producción de toxinas, muchas de ellas histotóxicas, producen una enterotoxina presente en los tipos A, C, D. La toxina alfa (fosfolipasa) es letal, provoca aumento de la permeabilidad de las membranas celulares. La toxina responsable de la toxiinfección alimentaria parece ser que es una enterotoxina de las esporas porque solo parece producirse cuando el microorganismo esporula en el intestino, en general no está presente antes de la ingestión. Esta enterotoxina es una proteína termolábil, aumenta la permeabilidad de las células intestinales y produce un aumento de la motilidad, produce perdida masiva de agua, cloro y sodio e inhibe que se absorba la glucosa, la acción la ejerce en el ileon.

La toxina beta, toxina letal para los animales de experimentación, en ocasiones también en humanos, es necrótica y aumenta la permeabilidad vascular. Es una toxina sensible a la tripsina, se inactivaría en el estómago y por este motivo una baja ingesta proteica que disminuye la secreción de tripsina favorecería la acció de ella.

En el caso de la del tipo A la enfermedad aparece al cabo de 8-24 horas tras la ingesta del alimento.

CLINICA

Dolor abdominal, diarrea acuosa ( no hay sangre ni moco ), nauseas, cuadro benigno que desaparece a las 12-18 horas.

La enteritis necrotizante, producida por cepas tipo C, presenta una incubación de 24 horas, dolor abdominal, diarrea con sangre, vómitos, necrosis intestinal.

INVESTIGACION

Se añaden a los medios ciertos antibioticos para inhibier a las anaerobios facultativos (neomicina, polimixina), el enriquecimiento se basa en esto inhibir a unos para favorecer a otros, para el aislamiento se emplean medios con yema de huevo o emplear sulfitos más hierro.

1.- Tecnica en tubos.

Suspensión madre 1:10 en solución Ringer con cisteina y se realizan diluciones seriadas. Se siembra 1 ml de cada dilución en tubos estériles con tapón de rosca (150x20). Se añaden 15 ml. de agar TSN atemperado a 47º, se solidifica y se cubre con 3 ml de parafina estéril, incubamos a 46º durante 24-48 horas y se produce sulfuro de hierro de color negro, las colonias se veran negras a lo largo del tubo y se cuentan, de esta forma el número de colonias por el factor de dilución nos indicará el número de microorganismos por gramo de alimento.

2.- Método del NMP

Se siembran series de 5 tubos con RCM medio para clostridium con neomicina y se incuban a 46º durante 48 horas. De cada tubo se siembran 0,1 ml en agar TSCY (agar triptosa sulfito cicloserina), podemos ver la reacción de la lecitinasa, por tener el medio sulfito se produce sulfídrico que con el hierro produce sulfuro de hierro, aparece un halo blanco alrededor de las colonias por precipitación de ácidos grasos. Una vez sembradas y secas se cubre con una capa de 10 ml de TSC estéril y se coloca en anaerobiosis. De esta forma se calcula el NMP.

Prueba de Willis, es una placa de LYL (agar lactosa leche yema de huevo). En mitad de la placa se deposita antitoxina alfa y luego se siembra ese medio en forma rombo

PREVENCION Y CONTROL

Evitar cocinar los alimentos en grandes cantidades, higiene adecuada en la manipulación, enfriamiento y refrigeración adecuadas, evitar cocinar con mucha antelación.