Estudios de la microbiología

QUIMIOTERÁPICOS DE SÍNTESIS Y ANTIBIÓTICOS

Los quimioterápicos son sustancias con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostática) con toxicidad suficientemente baja como para poder ser administrados a un organismo por la vía adecuada, hasta alcanzar y mantener concentraciones eficaces en los tejidos.

Aunque en el capítulo 1 ya hablamos del arranque y desarrollo de la Quimioterapia, recordemos aquí esta página notable de la historia de la Microbiología:

1900-15	Ehrlich concibe la idea de usar compuestos químicos de síntesis como "balas mágicas" selectivas hacia microorganismos, pero inofensivas para las personas o animales superiores. En 1909 descubre que el salvarsán es efectivo contra la sífilis. Acuña el término "quimioterapia".
1932-35	Domagk, siguiendo los pasos de Ehrlich, descubre la acción del rojo de prontosilo (la primera sulfamida) sobre el neumococo y otros estreptococos in vivo.
1940	Woods descubre el mecanismo de acción de las sulfamidas. Estamos en plena "Edad de oro de la Quimioterapia de síntesis".
1929	Fleming descubre la penicilina, el primer antibiótico natural, pero fracasa en su intento de purificarlo. La industria farmacéutica se muestra "indiferente".
1940	Chain y Florey purifican la penicilina.
1944	Waksman, un microbiólogo de suelos, ha iniciado una búsqueda de microorganismos productores de antibióticos. Descubre la estreptomicina. Comienza la época dorada de los antibióticos (quimioterápicos naturales), y la búsqueda racional rinde decenas de nuevos antimicrobianos procedentes de Actinomicetos, otras bacterias y hongos.

2. QUIMIOTERÁPICOS DE SÍNTESIS
2.1 INHIBIDORES EN LA RUTA DE BIOSINTESIS DEL TETRAHIDROFOLATO (THF)

La ruta biosintética del ácido tetrahidrofólico está ilustrada en la Fig.1. El THF es lo que se denomina habitualmente "donador de unidades de 1 átomo de carbono", y los seres vivos lo requieren en ciertas rutas biosintéticas:

• biosíntesis de los aminoácidos Met, Gly. Además, las Eubacterias lo necesitan para el grupo formilo del fMet-ARNt (el ARN transferente que incorpora la formil-metionina al comienzo de la proteína).
• Biosíntesis de las purinas y pirimidinas, y sobre todo del dTMP.
• Biosíntesis del pantoténico.

Como veremos a continuación, sobre algunos pasos de esta ruta actúa una serie de agentes quiomioterápicos, muchos de ellos con gran importancia clínica.

2.1.1. SULFAMIDAS (=SULFONAMIDAS)

Como ya hemos comentado, su descubrimiento y la comprobación de su acción quimioterápica, marcaron el comienzo de la Quimioterapia con criterios racionales. Despertaron gran interés cuando se mostró que su mecanismo de acción depende del hecho de que funcionan como análogos de metabolitos, actuando como inhibidores competitivos respecto de cierta enzima.

Domagk (1935), siguiendo la estela de Ehrlich, descubre que el Rojo de Prontosilo confiere protección a ratones inoculados experimentalmente con estreptococos.

Sin embargo, se vio que este mismo compuesto no inhibía a los mismos estreptococos in vitro, es decir, en tubo de ensayo o en placas de Petri. ¿Cuál era la razón de este disimilar comportamiento de esta sustancia in vivo e in vitro? La explicación la encontró el matrimonio Tréfouël (que a la sazón trabajaba en el Instituto Pasteur): el metabolismo de los ratones rompe el Rojo de Prontosilo, que por sí mismo es inactivo contra las bacterias, generando el compuesto activo (con actividad antibacteriana): la sulfanilamida (=para-aminobencenosulfonamida).

A partir de la sulfanilamida se sintetizaron desde entonces gran número de derivados por sustitución de uno de los hidrógenos del grupo sulfonamida, formando estos derivados la llamada familia de lassulfamidas.

Ejemplos:

• sulfapiridina (por unión del grupo piridina)
• sulfatiazol (con el grupo tiazol)
• sulfadiazina (con el grupo pirimidina)
• sulfaguanidina.

Lo que tienen en común las sulfamidas con actividad antibacteriana es:

• tener libre el grupo amino en para (o, como le ocurre al rojo de Prontosilo, que quede libre en el organismo hospedador como consecuencia de algún procesamiento metabólico);
• grupo sulfona (-SO₂-) unido al anillo bencénico;

La sustitución del grupo amido unido a la sulfona, aunque no modifica sustancialmente la actividad antibacteriana, puede suponer una serie de ventajas de tipo farmacológico:

• disminuir la toxicidad hacia el organismo hospedador;
• aumentar su solubilidad en agua;
• mejorar la absorción del compuesto por el intestino (lo que permite administración vía oral);
• mayor persistencia de la sulfamida en el organismo (excreción más lenta), lo que permite dar menos dosis para lograr el mismo efecto.

La introducción de las sulfamidas en los años 40 supuso un gran éxito en el tratamiento de enfermedades provocadas por cocos Gram-positivos (infecciones estreptocócicas y neumonías por el neumococo). Aunque la "época dorada de las sulfamidas" ya ha pasado (debido sobre todo al ulterior descubrimiento de antibióticos naturales), hoy día siguen empleándose en el tratamiento de infecciones de las vías urinarias, algunas formas de meningitis, y en Veterinaria.

Mecanismo de acción de las sulfamidas (descubierto por Woods y cols. en 1940):

Las sulfamidas tienen un efecto bacteriostático. Su acción antibacteriana se debe al hecho de que funcionan como análogos estructurales del ácido para-aminobenzoico (PABA), inhibiendo competitivamente por el acceso a la enzima dihidropteroil-sintetasa

• Como se puede ver, la dihidropteroil-sintetasa cataliza la condensación del PABA con el 2-amino,4-hidroxi, 6-hidroximetil dihidropteroil-pirofosfato, que lleva a la síntesis de ácido dihidropteroico (una de las fases intermedias de la síntesis del tetrahidrofólico -THF). En la figura se puede apreciar que el PABA y las sulfamidas son muy parecidas. De hecho, la sulfamida es usada por la enzima como un sustrato alternativo al PABA. En este caso, la enzima cataliza una reacción que genera un producto que no puede actuar como intermediario en los siguientes pasos de la ruta de síntesis del THF.
• Los microorganismos son sensibles a las sulfamidas porque sus necesidades de THF las han de satisfacer sintetizándolo a partir de PABA usando la ruta de la que estamos hablando. Sin embargo, los animales son resistentes, debido a que carecen de esta ruta, y en cambio, se aprovisionan de fólico directamente en su dieta. Pero áun más: en teoría el ácido fólico de la dieta del organismo hospedador podría anular el efecto terapéutico si fuera captado por la bacteria, pero en la realidad esto no ocurre, porque el fólico no puede entra a la célula bacteriana.

El notable éxito terapéutico de las sulfamidas, junto con el desentrañamiento de su mecanismo de acción, condujo durante los años 40 y 50 a una gran línea de investigación consistente en sintetizar compuestos que fueran análogos de factores bacterianos de crecimiento, con la esperanza de "diseñar" racionalmente nuevos quimioterápicos. Sin embargo, el gran esfuerzo de búsqueda no rindió apenas frutos. Y la razón hay que buscarla de nuevo en la excepcional confluencia de hechos que acabamos de citar para las sulfamidas y que hacen que las sulfamidas funcionan tan bien: inhibición competitiva, presencia de la ruta en bacterias pero ausencia en animales, la no entrada del fólico en bacterias pero sí en las células animales. Esta "suerte" no ha acompañado cuando se ha investigado el posible potencial de análogos de otros metabolitos.

2.1.1. SULFONAS

Son derivados de la dapsona (=4,4'-diamino-difenilsulfona). Aunque no se usa contra infecciones normales, ha encontrado una importante aplicación en el tratamiento de la lepra (producida porMycobacterium leprae); de hecho es el quimioterápico de elección para esta enfermedad. Probablemente su mecanismo de acción esté basado en actuar como competidor del PABA.

2.1.3. PARA-AMINOSALICILICO (PAS)

Es uno de los agentes que se emplean para el tratamiento de la tuberculosis (provocada porMycobacterium tuberculosis). Alcanza el interior de los monocitos y macrófagos, que son las células donde penetra el bacilo tuberculoso (que es un parásito intracelular)

Al igual que el PAS, las sulfonas parecen actuar como competidores del PABA, pero se desconoce la razón por la que estos dos compuestos sean tan específicos de las especies patógenas deMycobacterium.

2.1.4. INHIBIDORES DE LA DIHIDROFOLATO-REDUCTASA (DHFR)

El último paso en la síntesis del THF es la reducción del dihidrofólico (DHF), catalizado por la dihidrofolato-reductasa (DHFR). Esta reacción es inhibida por dos quimioterápicos:

• el metotrexato, que al ser tóxico no encuentra aplicación clínica;
• el trimetoprím, que tiene un uso clínico, sobre todo en terapia sinérgica junto con el sulfometoxazol (una sulfamida). Este doble quimioterápcio se emplea contra infecciones urinarias recurrentes, bronquitis crónicas por neumococos, y algunas infecciones deSalmonella y Shigella.

Tienen efectos bactericidas, con alta afinidad hacia la enzima DHFR bacteriana, pero baja hacia la DHTR de animales. Esto deriva del hecho de que, aunque la mayor parte de los seres vivos tienen DHFR, la enzima bacteriana difiere en estructura respecto de la de mamíferos.

Existen inhibidores específicos de las versiones de la DHFR de ciertos protozoos parásitos: así por ejemplo, la pirimetamina y el proguanil se usan contra Plasmodium, el agente de la malaria. Incluso el metotrexato se puede emplear en el tratamiento de ciertos cánceres.

2.2.. ISONIAZIDA

Es la hidrazida del ácido isonicotínico (también conocida por sus iniciales inglesas, INH). Como se puede ver, es un análogo estructural de dos vitaminas: la nicotinamida y el piridoxal.

Tiene efecto bactericida incluso a bajas concentraciones (1m g/ml) e incluso intracelularmente, lo que permite su empleo contra las especies patógenas de Mycobacterium, y en general contra bacterias ácido-alcohol resistentes (Nocardia, Corynebacterium).

Mecanismo de acción: Ejerce varios efectos, probablemente debido a mecanismos pleiotrópicos (relacionados entre sí):

• interferencia -por mecanismo aún desconocido- con la biosíntesis de la pared celular de las bacterias AAR, que conduce a desorganizar los ácidos micólicos;
• actuación como antimetabolito de nicotinamida y piridoxal;
• activación de la NAD-asa, lo que conduce a reducir el "pool" de NAD.

2.3..QUINOLONAS

El ácido nalidíxico (=4-oxo, 8-azaquinolina) se sintetizó en 1962, y encontró su aplicación en el tratamiento de infecciones por Gram-negativas del tracto urinario, donde se concentra.

Recientemente se han sintetizado las llamadas fluoroquinolonas, como por ejemplo elciprofloxacín. Presentan 600 veces más actividad que el nalidíxico, y actualmente se recetan frecuentemente como quimioterápicos de amplio espectro.

Mecanismo de acción: Las quinolonas bloquean la ADN-girasa, uniéndose a la subunidad de tipo A. Recordemos que las bacterias poseen una clase especial de topoisomerasas de tipo II, llamadas girasas, que introducen superenrollamiento negativo en la doble hélice del ADN. La ADN-girasa está constituida por dos subunidades de tipo A y dos de tipo B (A₂B₂); las de tipo A producen los cortes y empalmes sucesivos en la doble cadena, mientras que las subunidades B son ATPasas que proporcionan la energía para la reacción.

El bloqueo de las quinolonas sobre la girasa supone que ésta queda "congelada" en la fase en que el ADN está unido al enzima. Ello provoca la acumulación de roturas de doble cadena, lo que conduce a la muerte de la bacteria.

En la sección 3.5 de este capítulo (sobre antibióticos que inhiben el metabolismo de los ácidos nucleicos) veremos algunos que actúan sobre las subunidades de tipo A.

2.4. NITROFURANOS

Los nitrofuranos, como por ejemplo la nitrofurantoína, tienen efecto contra Gram-positivas y Gram-negativas, sobre todo en la orina, siendo poco efectivos en otros fluidos corporales.

2.5. 5-FLUOROCITOSINA (=FLUCITOSINA, 5FC)

Es un análogo estructural de la citosina, interfiriendo con la síntesis de ADN y ARN. Su aplicación es como antifúngico, sobre todo contra infecciones por algunas levaduras.

 

3..ANTIBIÓTICOS

Los antibióticos son sustancias normalmente de bajo peso molecular producidas por seres vivos (antibióticos naturales) o modificadas artificialmente a partir de ellas (antibióticos semisintéticos), que a pequeñas concentraciones tienen efectos antimicrobianos (microbicidas o microbiostáticos), tras ser administrados por vía adecuada a un organismo receptor.

La mayor parte de los antibióticos proceden del metabolismo secundario de microorganismos procariotas (actinomicetos, Bacillus, etc) o eucariotas (hongos de los géneros Penicillium, Cephalosporium, etc).

Se conocen unos 5 000 antibóticos distintos, y cada año se descubre unos 300 nuevos. Su importancia económica se pone de manifiesto al pensar en las 100.000 Tm de antibióticos producidas al año, por un valor equivalente a 400.000 millones de pesetas.

La mayor parte de los antibióticos comerciales se emplean para tratar enfermedades de etiología bacteriana, aunque algunos se usan contra hongos y levaduras, y unos pocos presentan actividad antitumoral.

Desde el punto de vista químico, se clasifican en grandes familias:

• antibióticos que contienen carbohidratos;
• lactonas macrocíclicas;
• quinonas y compuestos relacionados;
• antibióticos peptídicos y con aminoácidos;
• heterociclos del N;
• heterociclos del O;
• aromáticos;
• alifáticos;
• etc.

La mayoría de los antibióticos son moléculas complejas, con regiones hidrofóbicas que facilitan el transporte al interior celular. Muchos poseen varios anillos, algunos de los cuales mejoran la interacción de la molécula con su diana macromolecular.

Para estudiarlos es más útil agrupar a los antibióticos no por clases según su naturaleza química, sino en función de las "dianas" sobre las que actúan y con las que interfieren:

A) antibióticos que interfieren con la biosíntesis de la pared celular
B) antibióticos que actúan sobre la membrana celular
C) antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas
D) antibióticos que actúan sobre la síntesis de ácidos nucleicos.

Los antibióticos más abundantes, y los mejor estudiados, son los que interfieren con enzimas de la biosíntesis del peptidoglucano de las eubacterias, y los que interfieren con la función del ribosoma.

3.1. INHIBIDORES DE LA BIOSINTESIS DE LA PARED CELULAR BACTERIANA

(Repasar el apartado 2 del capítulo 6, donde se mostraba la biosíntesis del peptidoglucano)

3.1.1. FOSFOMICINA (=FOSFONOMICINA)

Este antibiótico de estructura muy simple está producido por Streptomyces fradiae. Su acción inhibitoria es ejercida a nivel de la primera reacción de la síntesis del PG, a saber, impidiendo la condensación reductora del UDP-NAG con el PEP para dar UDP-NAM. Ello lo logra uniéndose con la enzima transferasa correspondiente, inactivándola.

Aunque tiene baja toxicidad para organismos superiores, apenas ha encontrado aplicación en la clínica (se empleó en España, pero no está admitido en los EE UU).

3.1.2. CICLOSERINA

Producido por Streptomyces orchidaceus, este antibiótico muestra cierto parecido estructural con la D-alanina, lo que explica el hecho de que actúa como inhibidor competitivo de las dos reacciones secuenciales de la síntesis del PG donde aparece la D-ala:

• inhibe la racemasa que cataliza la conversión de L-ala en D-ala;
• inhibe la D-alanil-D-alanina sintetasa (que condensa dos D-ala para dar el dipéptido D-ala-D-ala).

La cicloserina tiene mayor afinidad que el sustrato natural (D-ala) hacia las dos enzimas.

Es un antibiótico de amplio espectro, pero apenas se emplea clínicamente, debido a su neurotoxicidad. Se recurre a él sólo para tratar ciertos casos de tuberculosis, en combinación con otros antibióticos.

3.1.3. VANCOMICINA

Es un glucopéptido complejo producido por Streptomyces orientalis. Se une rápida e irreversiblemente con el extremo D-alanil-D-alanina del pentapéptido del precursor del PG que se halla unido al undecaprenil-P (a nivel de membrana citoplásmica), de modo que inhibe la reacción de transglucosidación.

Es un antibiótico de espectro estrecho, bactericida frente a muchas bacterias Gram-positivas. Recientemente se está usando frente a infecciones severas de Staphylococcus aureus y deStreptococcus pneumoniae que sean resistentes a otros antibióticos. Es la droga de elección ante colitis asociadas a antibióticos ocasionadas por Clostridium difficile.

3.1.4. RISTOCETINA

Es un antibiótico parecido al anterior, producido por Nocardia lurida, y que, al igual que la vancomicina inhibe la transglucosidación, siendo activo frente a Gram-positivas.

3.1.5...BACITRACINA-A

Producida por Bacillus subtilis variedad "tracy" (de ahí su nombre), es un antibiótico polipeptídico provisto de un anillo tiazol, bactericida frente a muchos Gram-positivos así como frente al Gram-negativo Neisseria. Es demasiado tóxico (sobre todo nefrotóxico) como para ser administrado sistémicamente, pero tiene uso tópico (p. ej., en cirugía del colon).

Su mecanismo de acción estriba en que se une al pirofosfato del undecaprenil-P-P, e impide su regeneración hasta undecaprenil-P por la fosfatasa específica; por lo tanto, evita la reentrada del undecaprenil-P en el ciclo biosintético del PG.

3.1.6. ANTIBIOTICOS ß-LACTAMICOS

Todos los antibióticos de este grupo contienen un anillo característico: el anillo ß-lactámico.

Todos los subgrupos de ß-lactámicos se pueden considerar derivados de un núcleo químico en el que, además del anillo lactámico puede existir un heterociclo conjugado:

Núcleo	ejemplos
Penám	penicilinas
Cefén	cefalosporinas
Carbapenem	tienamicina
Oxacefén	moxalactam
Clavám	clavulánico
Monobactam	aztreonám

PENICILINAS

Como ya sabemos, las penicilinas fueron los primeros antibióticos naturales en descubrirse, pero en general, todos los ß-lactámicos tienen el mismo mecanismo de acción. Nos concentraremos en estudiar las penicilinas.

El grupo común a todas las penicilinas es el ácido 6-aminopenicilánico (6-APA), que en realidad es un dipéptido ciclado por condensación de L-cys y D-val, que genera el anillo ß-lactámico (anillo A) y el anillo tiazolidínico (anillo B). Las penicilinas se pueden considerar derivadas del 6-APA, sustituyendo el hidroxilo (-OH) del grupo carboxilo por un radical acilo (R). Este radical acilo es variable de unas penicilinas a otras. La variación se puede lograr de dos maneras principales:

• modificando el medio de cultivo donde se hace crecer la cepa del hongo Penicillium.
• por transformciones químicas "in vitro", lo que genera las llamadas penicilinas semisintéticas.

La penicilina natural, purificada por primera vez en los años 40, es la penicilina-G (o benzil-penicilina), en la que el radical acilo es el grupo bencilo (=fenilacético). Esta penicilina presenta una serie de limitaciones e inconvenientes:

• tiene un espectro estrecho: actúa frente a estreptococos del grupo A y otros cocos Gram-positivos, pero no frente a la mayoría de bacterias Gram-negativas.
• Es sensible a ácidos, por lo que no puede ser administrada vía oral (se inactiva a su paso por el estómago).
• Es susceptible a enzimas inactivadoras (penicilinasas) producidas por muchas bacterias.
• Se elimina rápidamente por la orina (no permanece mucho tiempo en el organismo receptor).
• En algunos individuos puede provocar respuestas de hipersensibilidad (alergia a la penicilina).

Para solventar estos problemas se fueron "creando" variantes de esta penicilina que mejoraban algunas de sus cualidades. Por ejemplo, manipulando el medio de cultivo del hongo se pudo lograr la llamada penicilina-V (fenoximetil-penicilina), que es más resistente a bajos pH. Sin embargo, las más recientes generaciones de penicilinas son semisintéticas. Para obtenerlas se partir del núcleo del 6-APA.

El 6-APA se puede obtener de dos modos distintos:

• cultivando el hongo en medio carente de ácidos grasos (lo que evita la adición de radical acilo);
• o bien partiendo de penicilina G, y digiriéndola con amidasas específicas que producen el 6-APA.

Una vez obtenido el 6-APA, éste se hace reaccionar químicamente con un compuesto carboxílico. Dependiendo del compuesto en cuestión, se obtiene una amplia variedad de penicilinas semisintéticas, con propiedades mejoradas:

• con más amplio espectro de acción;
• con más tiempo de permanencia en suero y fluidos corporales;
• con resistencia a penicilinasas y en general ß-lactamasas;
• resistentes pH ácido, y por lo tanto susceptibles de ser administradas via oral.

Estas penicilinas semisintéticas se pueden englobar en tres grupos principales:

1) resistentes a penicilinasas.Se usan sobre todo frente a cocos Gram-positivos (Staphylococcus aureus, S. epidermidis).

2) De espectro ampliado. Permiten un uso efectivo frente a muchas bacterias Gram-negativas (Haemophilus influenzae, E. coli, Proteus, Salmonella, Shigella, etc).

Dentro de este grupo, destacamos las "aminopenicilinas", como la ampicilina, o laamoxicilina: el grupo -NH₂ del radical acilo permite que estas penicilinas puedan atravesar la membrana externa de las bacterias Gram-negativas. Resisten los ácidos, pero desgraciadamente sólo tienen la mitad de actividad contra Gram-positivas, y algunas son inactivadas por ß-lactamasas.

3) Penicilinas anti-Pseudomonas. La carbenicilina y la piperacilina se usan frente a Pseudomonas, un patógeno oportunista muy peligroso cuando coloniza grandes quemaduras, heridas quirúrgicas, etc.

Mecanismo de acción de las penicilinas y otros antibióticos ß-lactámicos: Todas las penicilinas (incluidas las semisintéticas), son bactericidas sobre bacterias en crecimiento, y poseen el mismo mecanismo: Inhiben el sistema enzimático implicado en la reacción de transpeptidación del peptidoglucano naciente, o sea que impiden los entrecruzamientos entre cadenas de PG. Ello origina:

• acumulación de precursores del PG, sin ensamblar;
• activación de una serie de autolisinas (amidasas, glucosidasas), que hidrilozan el PG maduro de la bacteria; si la bacteria se encuentra en un medio hipotónico, termina lisándose.
• En Gram-positivas, además, se produce desorganización de los ácidos teicoicos y lipoteicoicos. (De hecho, parece que en este tipo de bacterias son estos ácidos los que regulan de algún modo a las autolisinas).

Por lo tanto, la acción bactericida y lítica de las penicilinas depende de que la bacteria se encuentre creciendo en un medio hipotónico. Cuando la bacteria no está creciendo, no está haciendo renovación ("turnover") de su pared celular, lo que implica que la penicilina no tiene "diana" sobre la que actuar; por lo tanto, en estascondiciones la bacteria puede sobrevivir.

Esta es la base de las "recaídas" de muchas infecciones, una vez que se ha dado por terminado el tratamiento de un paciente con un antibiótico ß-lactámico.

Una visión más en profundidad del mecanismo de acción:

Las penicilinas tienen como dianas a una serie de autolisinas llamadas proteínas de unión a la penicilina (PBPs). Como ya vimos en el apartado 5 del capítulo 6, las PBPs son proteínas implicadas en las últimas fases de la síntesis y maduración del PG. Veamos en la siguiente tabla las funciones de las PBPs de E. coli, y los efectos sobre cada una al añadir penicilina.

PBPs con actividad transglucosidasa y transpeptidasa:	función natural	acción penicilina
PBP 1a y PBP 1b	Elongación del cilindro celular	lisis rápida
PBP 2	Condiciona la forma de la célula	la célula se redondea y muere
PBP 3	Formación del septo transversal	Filamentación y muerte
PBPs con actividad D-D carboxipeptidasa (endopeptidasa)	Función natural	acción penicilina
PBP 4, PBP 5, PBP 6	Eliminan la D-ala terminal delpentapéptido (maduración PG)	no letal

Así pues, las PBPs 1 a 3 son esenciales para la bacteria, y son las dianas de las penicilinas que explican la actividad bactericida. Se ha propuesto que el grupo -CO-N- del anillo ß-lactámico funciona como un análogo estructural del sustrato de las transpeptidasas implicadas en la reacción de entrecruzamiento (transpeptidación) entre el péptido del PG naciente y el del PG aceptor. La penicilina se combina con el sitio activo de la transpeptidasa, dando un complejo enzima-penicilina (peniciloil-transpeptidasa) inactivo y bastante estable.

ß-LACTÁMICOS BASADOS EN EL NÚCLEO DEL ÁCIDO 7-AMINOCEFALOSPORÁNICO

El núcleo cefém es el ácido 7-aminocefalosporánico. Existen dos tipos de ß-lactámicos naturales (y sus derivados semisintéticos) basados en este núcleo:

• cefalosporinas, producidas por hongos del género Cephalosporium;
• cefamicinas, producidas por ciertas especies del actinomiceto Streptomyces.

Desde un punto de vista biosintético, derivan de los dos mismos aminoácidos que las penicilinas, pero aquí, uno de los metilos (-CH₃) de la valina se incorpora al anillo en vez de quedar fuera, haciendo que el anillo B sea el anillo dihidrotiazina.

La cefalosporina natural tiene poca actividad, pero sustituyendo artificialmente R₁ y R₂ se obtienen derivados semisintéticos muy activos. Como es habitual con muchos antibióticos de uso clínico, a lo largo de los años la industria farmacéutica ha ido "creando" sucesivas "generaciones" de estos compuestos, con aplicaciones y ventajas diferentes:

La cefalosporinas se introdujeron en principio para uso en pacientes alérgicos a las pencilinas. Algunas de ellas combinan la ventaja de tener un amplio espectro (incluyendo bacterias difíciles de tratar, como Haemophilus) y el de ser resistentes a las ß-lactamasas de muchas bacterias Gram-negativas.

MONOBACTÁMICOS

Tienen un núcleo monocíclico (sólo el anilo ß-lactámico). El derivado semisintético aztreonam se puede usar contra bacterias Gram-negativas aerobias (estrictas o facultativas) como Haemophilus, Neisseria, Pseudomonas y Enterobacterias.

Su espectro de acción estrecho es útil, ya que su administración via oral "respeta" mejor la flora intestinal autóctona del paciente.

CARBEPÉNICOS

Se basan en el núcleo del carbapeném. Ejemplos son las tienamicinas (como el imipeném). Poseen un espectro muy amplio, con actividad intensa contra casi todas las bacterias de interés médico, incluyendo resistentes a otros antibióticos ß-lactámicos: Staphylococcus aureus, Streptococcus, Pseudomonas, Bacteroides, Haemophilus, Neisseria, etc.

INHIBIDORES DE LA ß-LACTAMASA

Un ejemplo típico es el ácido clavulánico (una oxa-ß-lactama): tiene poca actividad como antibiótico, pero se une a las ß-lactamasas, inactivándolas irreversiblemente. Actualmente los médicos lo recetan con frecuencia en combinación con alguna ampicilina (una aminopenicilina, como vimos): la mezcla ampicilina + clavulánico tiene efectos sinérgicos (se potencian el uno al otro). El clavulánico pasa fácilmente a través de porinas al espacio periplásmico de muchas bacterias Gram-negativas, donde se acumula, y allí inactiva a las ß-lactamasas; mientras tanto, la ampicilina, "salvada" de la inactivación de las lactamasas, puede ejercer su efecto bactericida (por bloqueo de la transpeptidación del PG).

3.2. ANTIBIOTICOS QUE ACTUAN SOBRE LA MEMBRANA CELULAR

A diferencia de los antibióticos que actúan a nivel de pared, los que interfieren con la membrana celular ejercen sus efectos independientemente de que el microorganismo esté o no creciendo. Suelen carecer de especificidad (afectan a membranas de procariotas y de organismos superiores), por lo que resultan más o menos tóxicos para los mamíferos y, en general, han encontrado escasa aplicación clínica.

3.2.1.. ANTIBIOTICOS POLIPEPTIDICOS

Son antibióticos producidos por especies de Bacillus durante las primeras fases de la esporulación(consúltese el capítulo 12). Se trata de moléculas con aminoácidos en configuaraciones L y D, y con presencia de ciertos aminoácidos "raros" (no proteinogenéticos). Algunos de estos antibióticos son polipéptidos cíclicos. Su síntesis no se realiza en los ribosomas, sino que se produce por una secuencia de reacciones enzimáticas que nada tienen que ver con el proceso de traducción de los mensajeros genéticos.

Suelen ser antibióticos de efecto bactericida. Su mecanismo consiste en que se unen a la cara externa de la membrana citoplásmica (y, además, a la membrana externa de las bacterias Gram-negativas), alterando su estructura y su permeabilidad osmótica; ello condiciona la inhibición de procesos básicos de la membrana, así como la salida de metabolitos del citoplasma.

POLIMIXINAS

Producidas por Bacillus polymyxa, son decapéptidos cíclicos con aminoácidos en L y D, y con abundancia del "raro" L-diaminobutírico (L-DAB), y que llevan unido una cadena alifática C₈ (el 6-metil-octanoico).

Su actividad está restringida a Gram-negativas: el anillo peptídico, que está cargado positivamente, se une electrostáticamente con los grupos negativos de la membrana externa, desplazando a los cationes Mg⁺⁺ y otros que estabilizan dicha membrana; al mismo tiempo, la "cola" hidrofóbica (la cadena alifática) del antibiótico se introduce entre las cadenas de ácidos grasos de la membrana. El efecto neto de todo ello es que se desorganiza la estructura y la función de la membrana externa.

Presentan toxicidad para organismos superiores (sobre todo nefrotoxicidad), por lo que su empleo parenteral se reserva para infecciones severas de Pseudomonas. Pero es apto para uso tópico.

TIROCIDINA-A Y GRAMICIDINA-S

Producidas por Bacillus brevis, son antibióticos plenamente cíclicos, con efectos similares a la polimixina.

3.2.2. IONOFOROS

Los antibióticos ionóforos actúan aumentando grandemente la permeabilidad de la membrana hacia iones inorgánicos específicos. Forman canales que atraviesan la membrana, dejando un hueco central que permite el paso de cationes concretos, lo que se traduce en una disipación de los gradientes electroquímicos a ambos lados de la membrana (destruyendo, por tanto, la capacidad de obtención de energía de las bacterias).

VALINOMICINA

Es un depsipéptido cíclico, formado por la ciclación de tres unidades del siguiente módulo:

D-hidroxibutírico-D-valina-Lactato-L-valina

Como se puede comprobar, se trata de una cadena de a -aminoácidos y a -hidroxiácidos alternantes, conectados por enlaces peptídicos y enlaces éster. Las cadenas alifáticas se disponen hacia afuera del anillo, mientras que los grupos carboxilo se colocan hacia adentro, dejando un canal hidrófilo que permite el libre paso de K⁺, lo que desacopla los mecanismos de obtención de energía a nivel de membrana.

GRAMICIDINA A

Es un antibiótico a base de aminoácidos alternantes en configuraciones D y L, que forma una estructura helicoidal. Disipa iones K⁺, así como Na⁺ e H⁺. La configuración permite al antibiótico formar una especie de cilindro donde la cadena sigue una hélice que está estabilizada por puentes de H casi paralelos al eje del cilindro, dejando un canal central de 0.4 nm de diámetro, y con las cadenas laterales de los aminoácidos dirigidas hacia auera, formando una especie de vaina hidrófoba. Esto permite que la molécula se inserte a través de la membrana, dejando un canal por el que pueden pasar iones, con la consiguiente destrucción del gradiente electroquímico.

3.2.3. ANTIBIOTICOS POLIÉNICOS

Son de tipo macrólido (o sea, un gran anillo provisto un enlace lactónico); este tipo de antibióticos se caracteriza por poseer una porción flexible hidroxilada y otra porción más rígida, a base de dobles enlaces conjugados.

La anfotericina B (producida por Streptomyces nodosus) y la nistatina (por S. nursei) contienen, además, el aminoazúcar llamado micosamina.

Inhiben selectivamente las membranas que contienen esteroles: por lo tanto, actúan sobre microorganismos eucarióticos (hongos, levaduras), pero no sobre los procarióticos, a excepción de los micoplasmas. Parece que son bastante específicos hacia el ergosterol (muy abundante en hongos), pero debido al parecido de éste con el colesterol, tienen cierta toxicidad hacia los animales superiores (su margen de seguridad terapéutica es muy estrecho).

Estos antibióticos tienen forma de bastón rígido (debido a la configuración todo-trans de los dobles enlaces conjugados). Una de las superficies de este cilindro es hidrófoba (la de los dobles enlaces), y la superficie opuesta es hidrófila (la que es rica en hidroxilos). En un extremo del bastón, la micosamina y el carboxilo forman una zona altamente polar. Los modelos fisicoquímicos revelan que 10 moléculas del antibiótico se agregan entre sí, con los ejes de sus respectivos bastones paralelos entre sí y perpendiculares a la membrana (atravesándola), de modo que dejan un canal central de uno 0,7 nm de diámetro, y con los grupos polares hacia afuera. Esta estructura permite el paso libre de iones, así como el que se escapen metabolitos (como la glucosa) desde la célula al exterior.

3.3..ANTIBIOTICOS QUE INTERFIEREN EN LA BIOSINTESIS DE PROTEINAS

Se recomienda al alumno repasar, siquiera sea en esquema, el proceso de síntesis de proteínas, con sus fases de iniciación, elongación y terminación)

Los antibióticos que interfieren en la síntesis de proteínas son muy variados y abundantes, y la mayoría de ellos funcionan interfiriendo con el ribosoma, sobre todo los que se unen a proteínas ribosómicas y/o a alguno de los ARN ribosómicos. Nosotros vamos a detenernos principalmente en aquellos antibióticos que afectan a la elongación de la cadena naciente del polipéptido. Obviamente, los más útiles son aquellos que tienen efectos selectivos frente a los ribosomas 70S procarióticos, pero no sobre los 80S eucarióticos. Dentro de ellos, y siguiendo el orden natural del funcionamiento de la elongación de la cadena polipeptídica, podemos agruparlos según la fase concreta de la elongación sobre la que actúan:

1. inhibición del reconocimiento de un aminoacil-ARNt (aa-ARNt) hacia el sitio A del ribosoma;
2. introducción de errores en la lectura de los ARNm;
3. inhibición de la reacción de formación del enlace peptídico;
4. inhibición de la traslocación del peptidil-ARNt (pp-ARNt) desde el sitio A al sitio P.
5. bloqueo de los factores de elongación.

3.3.1.. INHIBIDORES DE LA FASE INICIAL DE LA ELONGACION (O SEA, DEL RECONOCIMIENTO Y ENTRADA DEL aa-ARNt AL SITIO "A" DEL RIBOSOMA)
TETRACICLINAS

Son antibióticos de muy amplio espectro (frente a Gram-positivas, Gram-negativas, Rickettsias y Clamidias, e incluso Micoplasmas), producidos por distintas especies de Streptomyces. Actúan comobacteriostáticos, siempre y cuando las bacterias estén en crecimiento activo. Como se puede ver por su espectro, son útiles incluso contra bacterias que viven como parásitos intracelulares (como las Rickettsias), debido a que su carácter hidrofóbico facilita su difusión a través de membranas.

Mecanismo de acción: Provocan que la unión del aa-ARNt al sitio A del ribosoma sea inestable y esté distorsionada, con lo cual se evita la elongación de la cadena. In vitro actúan tanto frente a ribosomas 70S como frente a los 80S. Entonces, ¿por qué in vivo sólo inhiben a las bacterias? La explicación está en el hecho de que las bacterias transportan complejos tetraciclina-Mg de forma "suicida", cosa que no ocurre en eucariotas. Al llegar la tetraciclina a la subunidad 30S, se une a las proteínas S4 y S18 del ribosoma 70S intacto, ejerciendo el efecto que hemos descrito en el párrafo anterior.

Efectos secundarios:

• Las tetraciclinas naturales se absorben mal por el intestino, y pueden destruir la flora autóctona, favoreciendo infecciones secundarias. Las semisintéticas evitan este problema.
• Se depositan en tejidos calcificados, ocasionando daños a huesos y dientes, y tiñendo los dientes de amarillo en los niños.

3.3.2...INDUCTORES DE ERRORES EN LA LECTURA DEL ARNm
AMINOGLUCÓSIDOS

Es un grupo amplio y variado de antibióticos producidos por diversas especies de Streptomyces. Como se puede ver en las figuras, todos tienen en común varios rasgos químicos:

• son muy polares, policatiónicos;
• presentan un anillo de aminociclitol (un ciclohexitol o inositol con grupo amino);
• uno o más azúcares, incluyendo al menos un aminoazúcar (aparte del aminociclitol). Así, por ejemplo, la estreptomicina contiene como aminociclitol la llamada estreptidina, mientras que otros aminoglucósidos presentan la 2-desoxiestreptamina).

Ejemplos de aminoglucósidos de uso clínico	bacteria productora
Estreptomicina	Streptomyces griseus
Kanamicina	S. kanamyceticus
Amikacinas	(derivados semisintéticos de la kanamicina)
Neomicina	S. fradiae
Gentamicina	Micromonospora purpurea

Los aminoglucósidos son antibióticos bactericidas de amplio espectro. Sus propiedades farmacocinéticas se deben al carácter polar del policatión:

• mala absorción vía oral (hay que administrarlos vía parenteral);
• penetran poco en el fluido cerebroespinal;
• se excretan rápidamente por la orina.

Por otro lado, en algunos individuos pueden ocasionar reacciones adversas: parálisis neuromuscular, ototoxicidad (pueden llegar a provocar sorderas) y nefrotoxicidad. Su margen de dosis terapéutica es estrecho, por lo que su uso debe limitarse frente a infecciones ocasionadas por bacterias resistentes a otros antibióticos.

Mecanismo de acción: Como veremos enseguida, su mecanismo no se limita a lo que dice el presente epígrafe (inducir errores en la lectura del mensajero), sino que tienen efectos pleiotrópicos (múltiples), que se influyen entre sí. El mecanismo lo podemos desglosar en varias fases:

1. Unas pocas moléculas del antibiótico entran a la bacteria, probablemente aprovechando pequeñas imperfecciones de la membrana en crecimiento;
2. estas moléculas se unen a los polisomas, es decir, los polirribosomas que están traduciendo el ARNm (p. ej., la estreptomicina se une al ARNr 16S de la subunidad 30S). Allí provocan errores en la lectura del ARNm, al distorsionar la estructura del ribosoma. Concretamente, el efecto aquí es que los codones del ARNm se emparejan con ARNt cargados "erróneos", en los que sólo 2 de las 3 bases del anticodón corresponden correctamente con las del codón.
3. Por lo tanto, la bacteria comienza a sintetizar proteínas defectuosas; algunas de ellas son proteínas de membrana, que al incorporarse a la bicapa lipídica, introducen imperfecciones en su funcionamiento y estructura. Se van formando cada vez más "canales", correspondientes a defectos en esa membrana;
4. a través de los nuevos "canales" e imperfecciones de la membrana, entran cada vez más moléculas del antibiótico, con lo cual todo el proceso se acelera y retroalimenta positivamente, de modo autocatalítico.

El efecto final es bactericida:

• se detiene finalmente la síntesis de proteínas;
• se producen daños irreversibles a las membranas.

Cada aminoglucósido se une a una zona distinta de la subunidad 30S del ribosoma, por lo que no suelen darse reacciones cruzadas de resistencia entre distintos antibióticos de este grupo.

La mayoría de los aminoglucósidos se une a varios sitios a la vez, dentro de la subunidad 30S, por lo que la aparición espontánea de mutaciones de resistencia a ellos suele ser baja. Una excepción a esto es el caso de la estreptomicina.

Efectos de la estreptomicina:

Diana de la estreptomicina: La estreptomicina ejerce su efecto antibiótico uniéndose a una zona concreta del ARNr 16S del ribosoma eubacteriano.
Mutación de resistencia a la estreptomicina: Con relativa frecuencia (10^--9/célula y división) surge en la población bacteriana una mutación espontánea que convierte a la bacteria afectada en resistente a la estreptomicina (fenotipo Str^R); esta mutación afecta al gen strA, que codifica la proteína S12 de la subunidad pequeña del ribosoma. El efecto de la mutación es alterar la proteína S12 de modo que el ribosoma que contenga esa proteína mutante evita la unión de la estreptomicina con el ARNr 16S (de algún modo, la S12 mutante "tapa" la vía de acceso del antibiótico a su diana molecular).
Supresión fenotípica de mutaciones puntuales:Como veremos en la sección de Genética Bacteriana (cap.23), uno de los tipos de mutaciones se denomina puntual, porque transforma un par de bases en otro distinto; ello puede suponer alterar el sentido del codón afectado (el codón mutante puede codificar un aminoácido distinto al original, o incluso puede ser uno de los tres codones de parada de traducción), lo cual puede conducir a que la proteína mutante respectiva deje de ser funcional.

Pues bien, cuando una bacteria que posee una mutación puntual que inactiva una determinada proteína (fenotipo mutante) se pone en un medio con estreptomicina u otro antibiótico aminoglucósido, con cierta frecuencia la lectura errónea del ARNm del gen mutante ("erróneo") conduce a que la proteína sea funcional, generandose un fenotipo silvestre. A este fenómeno se le denomina supresión fenotípica (en este caso inducida por estos antibióticos), para distinguirlo de la supresión genotípica, que como veremos oportunamente, regenera el fenotipo pero por medio de cambios en el genomio.
Este efecto depende de la porción del anillo aminociclitol de la molécula del aminoglucósido, y su mecanismo es a nivel del sistema secundario de corrección de errores de lectura que tiene el ribosoma ("corrección de pruebas").
Mutantes dependendientes de la estreptomicina: Existe una mutación alélica de la Str^R(es decir, que afecta al mismo gen), pero que en vez de dar fenotipo de resistencia al antibiótico produce un fenotipo por el que la bacteria depende de la estreptomicina para poder crecer (!). Esta mutación (denotada Str^d) tiene unos efectos muy específicos de supresión fenotípica condicionada:

• la proteína ribosómica mutante S12, en ausencia de estreptomicina, hace que el ribosoma traduzca introduciendo frecuentes errores (hay ambigüedades en la lectura de los mensajeros); por lo tanto, en ausencia de este antibiótico, la bacteria no crece.
• Si a la bacteria se le suministra el antibiótico, éste compensa fenotípicamente el efecto de la mutación de la proteína S12, de modo que ahora los ribosomas pueden efectuar correctamente la traducción de los ARNm (se reactivan los ribosomas para su funcionalidad normal).

3.3.3. ANTIBIOTICOS INHIBIDORES DE LA FORMACION DEL ENLACE PEPTIDICO

Se trata de un grupo variado y heterogéneo de agentes antibacterianos que interfieren con el centro peptidil-transferasa de la subunidad grande del ribosoma.

Cloranfenicol (antes llamado cloromicetina)

Antiguamente la industria lo obtenía a partir de Streptomyces venezuelae, pero actualmente es más barato fabricarlo por síntesis química. Es un bacteriostático de amplio espectro. Se absorbe bien vía oral y penetra bien en todos los tejidos, incluyendo cerebro y líquido cerebroespinal, por lo que se puede usar frente a meningitis ocasionadas por Haemophilus influenzae, así como tratamiento de fiebres tifoideas y anaerobios Gram-negativos.

Sin embargo, hay que controlar bien las dosis, ya que puede provocar supresión de médula ósea (aplasia medular); de hecho, casi no se emplea en países de Occidente, aunque se receta demasiado en el Tercer Mundo.

Mecanismo de acción: Se une a varios lugares de la subunidad 50S, entre los cuales el más importante es la proteína L16, que forma parte del centro peptidil-transferasa, cerca del sitio del ribosoma donde encaja el extremo aminoacil del ARNt, en el sitio A.

El cloranfenicol ha sido muy útil en el estudio de los ribosomas, ya que estabiliza los polisomas rápidamente.

Lincomicina y clindamicina.

La lincomicina está producida por Streptomyces lincolniensis, y la clindamicina es un derivado clorado del anterior, mucho más eficaz y con mejor absorción intestinal. Son útiles para tratar infecciones donde no pueda aplicarse penicilina, y contra anaerobios como Bacteroides.

Mecanismo de acción:Se une a la subunidad 50S del ribosoma procariótico, bloqueando la formación del enlace peptídico. Parece que esto lo logra interfiriendo con la colocación adecuada del aa-ARNt en el sitio A, y del pp-ARNt en el sitio P. Hace que se desorganicen los polisomas, disociándose en sus subunidades 30S y 50S.

Algunos macrólidos como la carbomicina

La carbomicina (producida por Streptomyces halstedii) y otros macrólidos se unen a la proteína L4 de la subunidad 50S, inhibiendo la formación del enlace peptídico.

3.3.4. INHIBIDORES DE LA TRANSLOCACION

El representante más típico es otro macrólido, la eritromicina. (Actualmente se usan mucho en clínica dos derivados semisintéticos de ella: la roxitromicina y la claritromicina). Producida porStreptomyces erithraeus), es un agente bacteriostático que se administra en infecciones de vías respiratorias ocasionadas por Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila (legionelosis),Corynebacterium dyphteriae (difteria) y Bordetella pertussis (tosferina).

Mecanismo de acción: Se une a la proteína L15, que forma parte del centro peptidil-transferasa. Bloquea el paso de translocación interfiriendo específicamente con la liberación del ARNt desacilado, es decir, impide que el ARNt "descargado" (una vez que ha cumplido su misión al transferirse el péptido naciente al aa-ARNt del sitio A) salga del sitio P; por lo tanto, el pp-ARNt cargado y situado en el sitio A no puede translocarse al sitio P, y se produce la parada de la síntesis de proteinas.

3.3.5. INHIBIDORES DE LOS FACTORES DE ELONGACION 

Tiostreptón

Es un antibiótico policíclico muy grande, producido por ciertas especies de Streptomyces. Se une a la subunidad 50S, concretamente a la proteína L11 y a una zona concreta del ARNr 23S, impidiendo la unión de los factores de elongación EFTu y EFG.

Acido fusídico

Es un derivado esteroideo producido por hongos del género Fusarium, usado contra estafilococos resistentes a ß-lactámicos. Se une al factor de elongación EFG, inhibiendo la liberación del complejo EFG-GDP, por lo que el pp-ARNt queda fijado en el sitio P, lo cual impide que se pueda unir el complejo ternario EFTu-GTP-ARNt.

Kirromicina y pulvomicina

Se unen al factor EFTu. La kirromicina bloquea la liberación del complejo binario EFTu-GDP; la pulvomicina bloquea la adición de aa-ARNt al EFTu para formar el complejo ternario.

En resumen de este apartado, existen antibióticos que afectan prácticamente cualquier aspecto de la función del ribosoma. Muchos de ellos, aparte del interés clínico que puedan tener, han sido muy útiles para desentrañar diversos aspectos de la estructura y función del ribosoma.

3.4.. ANTIBIÓTICOS QUE INTERFIEREN EN LA SINTESIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS
3.4.1. INHIBIDORES DE LA FUNCION DEL ADN

Pocos de los antibióticos que interfieren con las funciones del ADN son útiles en clínica, ya que no pueden discriminar entre ADN de procariotas y eucariotas. Sin embargo, han sido muy valiosos para estudiar diversos aspectos de la biología molecular del ADN

Actinomicina-D (Dactinomicina)

Observar en la figura que su grupo cromóforo tiene tres anillos y es planar; de cada anillo de los extremos sale una lactona pentapeptídica. Esta estructura es importante para entender su mecanismo de acción:

El hecho de tener tres anillos conjugados en un plano le permite intercalarse entre pares de bases adyacentes de la doble hélice del ADN, mientras que las dos L-treoninas establecen puentes de H con guaninas del ADN adyacentes al sitio de intercalación del antibiótico. De esta forma inhibe la replicación del ADN y su transcripción a ARNm.

Mitomicina C

Al entrar a la célula es convertida a su forma hidroquinona, que es muy reactiva, funcionando como un agente alquilante bifuncional que origina entrecruzamientos entre las dos hebras del ADN. Las consecuencias de ello son:

• las dos hebras no pueden separarse durante el intento de replicación, por lo que ésta se detiene.
• A continuación el ADN entrecruzado es atacado y destruido por las nucleasas de la propia célula.

Novobiocina y coumermicina

Se unen a la subunidad B de las ADN girasas bacterianas, impidiendo el superenrollamiento negativo del ADN al competir por el sitio de unión de esta subunidad al ATP.

3.4.2. INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCION

Las ARN polimerasas de virus, de bacterias y de mamíferos difieren mucho entre sí, por lo que los tipo de antibióticos que las afecten suelen ser bastante selectivos. Recuérdese que las ARN polimerasas eubacterianas constan de un núcleo {a₂ßß'} y que requieren el factor s para la iniciación de la transcripción.

Rifamicinas

Son antibióticos producidos por Streptomyces mediterranei, con buena actividad contra bacterias Gram-positivas y contra Mycobacterium tuberculosis. Se han usado en clínica moléculas naturales (como la rifampicina) así como derivados semisintéticos (como la rifampina). Constan de un anillo cromóforo aromático atravesado por un largo puente de naturaleza alifática.

Su mecanismo de acción estriba en la inhibición del inicio de la transcripción, uniéndose de modo no covalente a la subunidad ß de la ARN polimerasa eubacteriana.

Estreptolidigina

Se une también a la subunidad ß de la ARN polimerasa, pero su efecto es inhibir la fase de elongación de la transcripción.

RESISTENCIA BACTERIANA A LOS ANTIBIOTICOS

INTRODUCCIONLa síntesis de quimioterápicos artificiales y el descubrimiento y mejora de los antibióticos han supuesto en este siglo una auténtica revolución médica en el tratamiento de enfermedades infecciosas. Sin embargo, la extrema versatilidad y adaptabilidad de los microorganismos ha impedido que la victoria humana sobre las bacterias patógenas haya sido total: muchas bacterias han ido desarrollando en los últimos decenios mecanismos que las protegen frente a muchos fármacos.
Ya el mismo Paul Ehrlich, al introducir por primera vez la quimioterapia en protozoos, se dio cuenta (1907) de que algunas cepas desarrollaban resistencia a la droga durante el curso del tratamiento.
Tras el optimismo inicial que acompañó a los éxitos de la introducción de las sulfamidas y penicilinas (años 40 y 50), se constató igualmente un fenómeno de surgimiento de resistencias bacterianas a estas drogas. Si bien la quimioterapia ha doblegado las grandes epidemias bacterianas del pasado, las enfermedades infecciosas siguen con nosotros, constituyendo un serio problema.
De hecho, desde la introducción de la antibioterapia en todo el mundo, estamos realizando un gigantesco "experimento" de intervención genética en los seres vivos más abundantes del planeta: las bacterias. Estamos "sufriendo" la verdad de la supervivencia darwiniana de los más aptos, ya que la presión selectiva que representa la aplicación a gran escala de los quimioterápicos ha permitido la diseminación de cepas microbianas con mecanismos de resistencia que, en muchas ocasiones dificultan el adecuado tratamiento clínico.

• Al cabo de 6 años de introducir la penicilina G, la frecuencia de cepas de Staphylococcus aureus resistentes en los hospitales ingleses pasó de menos del 10% a un 60%. Actualmente el valor ronda el 90%.
• Con los nuevos ß-lactámicos también han empezado a surgir cepas bacterianas resistentes, aunque aún con frecuencia relativamente baja.
• Actualmente existen problemas de tratamiento con las enterobacterias, e incluso con el gonococo y el meningococo, que tradicionalmente habían sido muy sensibles a las penicilinas.
• Recientemente se ha dado la voz de alarma por la diseminación de cepas de bacilo tuberculoso resistentes a los quimioterápicos de elección a los que eran sensibles. La capacidad de las bacterias de desarrollar resistencias constituye una seria amenaza al futuro uso de los antibióticos, y hace que se tengan que invertir grandes sumas de dinero y esfuerzos de investigación adicionales para intentar hacer frente al problema. Algunos autores han comparado este problema con el episodio de Alicia en el País de las Maravillas en el que la Reina Roja tenía que correr cada vez más deprisa para quedarse en el mismo sitio.

Sin embargo, algunos quimioterápicos de última generación han vuelto a levantar esperanzas: las fluoroquinolonas (véase epígrafe del cap. 20) están manteniendo e incluso incrementando su efectividad. Por otro lado, hay que pensar en un dato de tipo evolutivo: la mayor parte de las especies bacterianas han sido seleccionadas de modo natural con fenotipos sensibles a antibióticos; los cambios genéticos mutacionales que las convierten en resistentes puede que disminuyan su adaptación a otros factores ecológicos, de modo que probablemente la presión de los antibióticos en realidad conduzca en muchos casos a un equilibrio entre cepas sensibles y cepas resistentes. De hecho se ha comprobado un descenso en la frecuencia de cepas resistentes a los antibióticos que se introdujeron hace más tiempo, lo que quizá indique que para ellos se está alcanzando dicho equilibrio.
Aclaraciones de nomenclatura:

• llamamos cepa insensible a aquella cuyo fenotipo silvestre le permite "resistir" de modo natural a un determinado antibiótico. La base de esta insensibilidad suele ser alguna estructura de la bacteria que actúa como barrera (como por ejemplo, la membrana externa de Gram-negativas, que dificulta el paso de muchos agentes antibacterianos).
• Llamamos cepa resistente a una variante surgida por cambios genéticos a partir de un fenotipo silvestre originalmente sensible.

2. BASES GENÉTICAS DE LA RESISTENCIAUna de las aplicaciones prácticas más interesantes de los avances realizados en las últimas décadas en el campo de la Genética Bacteriana ha sido comprender los mecanismos genético-moleculares de la resistencia a antibióticos, lo que está permitiendo un "ataque" más racional a este problema clínico. Una cepa bacteriana puede volverse resistente a un antibiótico por dos tipos principales de mecanismos:

1. mutación en un gen cromosómico;
2. introducción de un plásmido R de resistencia. Este segundo mecanismo supone el problema más serio, ya que:
1. está muy extendido;
2. puede conferir resistencia a varios antibióticos a la vez;
3. a diferencia del mecanismo mutacional, no suele suponer una desventaja adaptativa (no disminuye la tasa de crecimiento de la bacteria ni le hace perder sus propiedades de virulencia).

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2.1. SELECCION DE MUTANTES RESISTENTESComo veremos en la sección de Genética (cap. 23), las mutaciones génicas se dice que son espontáneas cuando ocurren sin intervención de procedimientos mutagénicos experimentales. Las mutaciones bacterianas espontáneas son aleatorias, y afectan a un gen cualquiera con frecuencias dentro del rango de 10^--5 a 10^--10 por célula y división.
En los años 50 se observó el siguiente fenómeno: cuando un cultivo bacteriano de una cepa sensible a un antibiótico se pone en contacto con ese antibiótico, al cabo del tiempo se comprueba que todo el cultivo consta de bacterias resistentes. ¿Acaso las bacterias son organismos "lamarckianos" en los que el antibiótico provoca al cambio de carácter heredable? A través de experimentos que veremos oportunamente (cap. 23) quedó demostrado que lo único que hace el antibiótico es seleccionar los mutantes resistentes espontáneos que surgen en la población independientemente de la presencia del agente selectivo.
Esta es precisamente la base genética del surgimiento de ciertas cepas patógenas resistentes a antibióticos: el fármaco inhibe o mata las bacterias silvestres sensibles, pero no afecta a los pocos individuos que por mutación espontánea hayan adquirido un alelo resistente; estos individuos se multiplican, de modo que al final son los más prevalentes.
El conocimiento de la frecuencia de aparición de mutación a resistencia a un quimioterápico o antibiótico en una determinada especie bacteriana, así como el sitio de acción de dicho fármaco, son factores importantes para una aproximación racional a la quimioterapia.
Así por ejemplo, el bacilo tuberculoso produce frecuentemente lesiones en el pulmón, donde se concentran enormes cantidades de la bacteria. Aquí, la quimioterapia con un solo agente no da éxito, ya que aunque ese agente mate a casi todos los individuos de esta especie bacteriana, no afectará a la pequeña subpoblación que posea el alelo resistente; estos pocos individuos sobrevivirían a este tratamiento, y recolonizarían el resto del pulmón, por lo que la infección persistiría. Así pues, en este tipo de casos hay que tratar con varios quimioterápicos simultáneamente (la probabilidad de resistencias múltiples basadas en mutaciones espontáneas equivale al producto de las probabilidades individuales).
En la sección 3 de este capítulo veremos algunos ejemplos concretos de resistencia a antibióticos debida a mutaciones en genes cromosómicos.

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2.2..RESISTENCIA POR INTERCAMBIO GENÉTICOLa principal amenaza al éxito de la quimioterapia está representada por la transmisión genética deplásmidos de resistencia a antibióticos (plásmidos R).
Veamos un poco de historia: en los años 50, poco después de la introducción de los primeros antibióticos, se detectó en Japón un espectacular aumento de pacientes de disentería bacilar resistentes al tratamiento con varios de estos antibióticos. Las cepas de Shigella dysenteriae aisladas de estos pacientes poseían el fenotipo Su^R, Str^R, Cm^R, Tet^R. Se comprobó que los genes correspondientes a esas resistencias formaban parte de un gran plásmido. Los plásmidos de este tipo se denominan plásmidos R. Pero aún más: los mismos pacientes tenían en sus intestinos cepas deEscherichia coli (que como sabemos ya, es un simple comensal que forma parte de nuestra flora endógena) que eran igualmente resistentes a esos antibióticos. Ello sugería que este tipo de plásmidos se podía transferir de unas especies a otras. La explicación estribaba en un fenómeno de intercambio dependiente de contactos célula-célula, llamado conjugación (cap. 27).
En resumidas cuentas, se descubrió que existen plásmidos R capaces de diseminarse por conjugación no sólo entre células de la misma especie, sino entre especies distintas, incluyendo bacterias patógenas.
Al poco tiempo comenzaron a aparecer en Occidente cepas patógenas resistentes a uno o varios antibióticos. Actualmente las cepas con resistencias múltiples codificadas por plásmidos son muy abundantes en todo el mundo, lo que complica (y a veces desaconseja) la quimioterapia.
Existen plásmidos R de distintos grupos de incompatibilidad (repasar el epígrafe del capítulo 9). Son abundantes en Pseudomonas y en Enterobacterias, desde donde pueden ser transferidos a una amplia gama de bacterias Gram-negativas (plásmidos promiscuos). Daremos detalles de cómo están organizados y cómo se transmiten por conjugación los plásmidos R en el capítulo 27.
Aparte de los plásmidos R conjugativos existen otros no conjugativos, que sin embargo pueden ser transferidos entre distintas bacterias por otros medios:

• los plásmidos no conjugativos movilizables pueden ser transferidos por otro plásmido conjugativo compatible residente en la misma célula (repasar el epígrafe del capítulo 9)
• por transducción (mediante bacteriófagos: lo veremos en cap. 26);
• por transformación (ADN desnudo del plásmido puede ser captado por una bacteria sensible receptora; ver cap. 25).

Ventajas adaptativas de los plásmidos R (volveremos sobre esto al final del cap. 27):

1. Los plásmidos R han evolucionado en respuesta a presiones selectivas ambientales (antibióticos usados por los humanos o inhibidores presentes en los medios naturales de las bacterias).
2. Son capaces de conferir varias resistencias simultáneamente a las bacterias que los adquieran.
3. Tienen capacidad de diseminarse epidémicamente de modo "horizontal" (es decir, entre células distintas de la misma especie o -en el caso de los promiscuos- distintas especies).
4. Están constituidos por "módulos" móviles (transposones: ver epígrafe del cap. 9), de modo que tienen flexibilidad para aquirir nuevos módulos a partir de otras especies (lo veremos al final del cap. 27).
5. Economía: cuando no existe presión selectiva, pueden perderse de la mayor parte de las bacterias de una determinada población (curación espontánea), pero su modo de transmisión "epidémica" los capacita para diseminarse rápidamente a la mayoría de la población cuando la ocasión lo requiere (cuando vuelve la presión selectiva).
6. No tienen apenas efectos negativos sobre los demás caracteres de la bacteria (incluyendo, en las patógenas, su poder virulento).
7. Muchos de ellos responden a mayores concentraciones del antibiótico aumentando su número de copias (amplificación del número de copias en los plásmidos de control relajado: repasar(repasar el epígrafe del capítulo 9).

Otro ejemplo de esta facultad de diseminación y evolución lo tenemos en que desde que los hospitales hacen uso frecuente de detergentes catiónicos como desinfectantes , ha crecido la proporción de cepas de Staphylococcus resistentes a dichos agentes.
Como se puede comprender, el estudio epidemiológico de los plásmidos R reviste actualmente un gran interés de cara a la salud pública. Este tipo de estudios recurre principalmente a dos tipos de enfoques:

• por detección de grupos de incompatibilidad (algo complejo);
• or análisis de restricción y comparación de mapas físicos (más fácil y rápido).

3..MECANISMOS BIOQUIMICOS IMPLICADOS EN LA RESISTENCIA A ANTIBIOTICOSLos principales mecanismos se pueden agrupar de la siguiente manera:

1. Disminución de la permeabilidad hacia el antibiótico.
2. Inactivación enzimática del antibiótico
3. Modificación química de la diana sobre la que actúa el antibiótico
4. Síntesis de una enzima resistente.

3.1.. DISMINUCION DE LA PERMEABILIDAD CELULAR HACIA EL ANTIBIOTICOModificación de una barrera preexistenteComo ya sabemos, la membrana externa de Gram-negativas supone una barrera natural que hace que muchas bacterias de este grupo sean insensibles a varios antibióticos (p. ej., la vancomicina y la bacitracina no pueden atravesar las porinas).
No todas las bacterias Gram-negativas son igualmente impermeables a los mismos antibióticos:

• Entre las menos impermeables están Haemophilus y Neisseria, que dejan pasar a numerosos ß-lactámicos.
• Las Enterobacterias suelen ser intermedias.
• Las bacterias del gén. Pseudomonas son insensibles a la mayoría de antibióticos ß-lactámicos, porque no pueden pasar a través de la membrana externa. Se han aislado mutantes que se han vuelto resistentes a los ß-lactámicos de última generación: el cambio ha afectado a una determinada porina que ahora no deja pasar a estos nuevos antibióticos.

En otros casos, la resistencia se debe a alteraciones en la cápsula: algunos neumococos resistentes a estreptomicina y eritromicina dependen de este tipo de mecanismo.
Mecanismo de extrusión activa del antibióticoEl ejemplo más típico estriba en la resistencia a las tetraciclinas desarrollada por muchas bacterias. Como sabemos, el efecto inhibidor de las tetraciclinas depende de la acumulación activa de este tipo de antibióticos por parte de las bacterias. Pues bien, ciertos plásmidos R poseen transposones (como el Tn10 o el Tn1721) que codifican un sistema para "bombear" tetraciclina desde el interior bacteriano hacia el exterior, en contra del gradiente de concentración.
Igualmente se conocen resistencias a sulfamidas dependientes de un mecanismo específico de impermeabilidad.
Alteración del mecanismo de transporte del antibióticoCuando el antibiótico accede al interior bacteriano por algún mecanismo de transporte específico, una mutación que afecte a dicho sistema de transporte supondrá una mayor resistencia al antibiótico. Por ejemplo, en E. coli la cicloserina entra aprovechando el sistema de transporte de la valina o la glicocola. Determinados mutantes incapaces de transportar estos aminoácidos son resistentes a la cicloserina.

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3.2..INACTIVACION ENZIMATICA DEL ANTIBIOTICOEste tipo de mecanismo depende en muchos casos de plásmidos R. Los ejemplos típicos son las resistencias a ß-lactámicos, la resistencia al cloranfenicol y las resistencias a aminoglucósidos.
Resistencia a ß-lactámicos por acción de ß-lactamasasComo ya sabemos, ciertas bacterias producen penicilinasa (ß-lactamasa), capaz de abrir el anillo ß-lactámico de la penicilina para dar ácido peniciloico, que carece de actividad antibacteriana. Lo mismo ocurre con las cefalosporinas, donde la ß-lactamasa (cefalosporinasa) genera un producto inestable inactivo que se descompone rápidamente. Sin embargo, la naturaleza de la cadena lateral (grupo acilo, R) influye notablemente en la susceptibilidad de rotura del anillo ß-lactámico por las lactamasas.
ß-lactamasas codificadas por cromosoma y de bajo nivel (ß-lactamasas de tipo TEM).

Están muy distribuidas entre bacterias Gram-negativas, y confieren resistencia a cefalosporinas y penicilinas. La base de la resistencia en muchos casos es la siguiente: cuando se expone la bacteria al ß-lactámico durante mucho tiempo, pueden seleccionarse determinadas mutaciones en genes cromosómicos que codifican proteínas parecidas de tipo PBP, de modo que adquieren un fuerte promotor que permite su expresión a alto nivel. Este tipo de ß-lactamasa es excretada al medio, donde inactiva al antibiótico.

ß-lactamasas de origen plasmídico.

En la Gram-positiva Staphylococcus aureus existen cuatro variantes, responsables del espectacular aumento de cepas resistentes de esta especie surgidas en los años 50. Se trata de enzimas inducibles: el gen que codifica la ß-lactamasa se induce por pequeñas cantidades de penicilina o cefalosporina, y se producen enormes cantidades del antibiótico, que se excreta, de modo que inactiva al ß-lactámico en el entorno de la bacteria. El gen responsable es portado por plásmidos de tipo R (que llevan genes de resistencia para otros antibióticos).
En las Gram-negativas se han descubierto unos 20 tipos de ß-lactamasas de codificación plasmídica. Suelen ser enzimas de síntesis constitutiva que se expresan a bajos niveles, y cuya localización es periplásmica; esta localización permite que el antibiótico sea inactivado antes de que llegue a la membrana citoplásmica, donde se localizan las proteínas diana de los ß-lactámicos. Algunas de ellas vienen codificadas por genes plasmídicos que forman parte de transposones (p. ej., el Tn1 o el Tn4).

¿Cuál es el origen de las ß-lactamasas?

Aunque la prevalencia de cepas (sobre todo patógenas) resistentes a ß-lactámicos es un fenómeno que se "disparó" desde los años 50 con el uso masivo de estos antibióticos, está claro que la resistencia debía de existir previamente al uso humano de los antibióticos. La aplicación clínica a gran escala (incluyendo el abuso) de las penicilinas y cefalosporinas sólo ha permitido que veamos en acción un caso "acelarado" de evolución bacteriana, donde las cepas más aptas han sobrevivido y se han multiplicado, y en el que, merced a los procesos de intercambio genético y a la construcción "modular" (transposones) de muchos plásmidos R, las entidadess genéticas responsbles se han diseminado de unas especies bacterianas a otras. Se supone que en la Naturaleza (p. ej., en los suelos), ciertas cepas bacterianas, antes de la aparición de la Quimioterapia, poseían ya mecanismos para destruir los ß-lactámicos segregados por hongos con los que coexistían.
Profundizando más en el tema, parece que las propias ß-lactamasas proceden evolutivamente (por mutaciones sucesivas) de alguno de los genes que originalmente codificaban algunas de las "autolisinas" (PBPs) que intervienen en la maduración del peptidoglucano. Es decir, las ß-lactamasas serían formas modificadas de las mismas dianas (p. ej., las transpeptidasas) sobre las que actúan los ß-lactámicos.
Como sabemos, los ß-lactámicos forman complejos covalentes estables con algunas de las PBPs (peniciloil-PBPs), que hacen que estas autolisinas se inactiven. Pues bien, existen indicios de que las ß-lactamasas serían unas "autolisinas" evolucionadas que en vez de formar complejos estables con los ß-lactámicos, se habrían especializado en cortar el anillo lactámico (dando peniciloico) a expensas de su actividad transpeptidasa original.

Resistencia al cloranfenicolLa resistencia al cloranfenicol suele deberse a una enzima inactivante de dicho antibiótico, denominada cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT), que normalmente está codificada por genes plasmídicos. Uno de los genes de CAT de Gram-negativas más estudiados forma parte del transposón Tn9.
La CAT convierte el cloranfenicol en su derivado 3-acetoxi, usando el acetil-CoA; a continuación una reacción química (no catalizada por enzima) hace que el grupo acetoxi pase a la posición 1; finalmente ocurre una segunda acetilación catalizada enzimáticamente, que genera el producto final, 1,3-diacetoxi-cloranfenicol. Los derivados mono o diacetilados del cloranfenicol son inactivos como antibióticos.
Resistencia a ciertos aminoglucósidosComo ya vimos en el capítulo anterior, los aminoglucósidos son un grupo amplio y abundante de antibióticos, por lo que no es sorprendente que las bacterias hayan evolucionado distintos mecanismos para inactivarlos; se pueden agrupar en tres tipos:

• Fosforilación
• Adenilación
• Acetilación

Las fosforilaciones y adenilaciones se dan sobre grupos -OH susceptibles, mientras que las acetilaciones recaen sobre determinados grupos -NH₂.
La modificación enzimática de los aminoglucósidos ocurre en el espacio periplásmico o en la membrana citoplásmica, y produce un doble efecto:

• el antibiótico modificado covalentemente ya no puede usar el mecanismo de transporte facilitado a través de la membrana; por lo tanto, accede en menor cantidad al citoplasma;
• el compuesto modificado ya no puede afectar al ribosoma, por lo que no ejecuta acción inhibitoria sobre el crecimiento de la bacteria.

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3.3. MODIFICACION QUIMICA DE LA DIANA DEL ANTIBIOTICOResistencia a la estreptomicinaEste mecanismo ya fue comentado en el capítulo anterior: la mutación cromosómica strA produce una proteína ribosómica S12 alterada que impide la unión de la estreptomicina.
Resistencia a la eritromicinaCiertos plásmidos de cepas de Staphylococcus aureus y de Streptococcus codifican una metilasa de ARN inducida por la presencia de eritromicina: esta enzima modifica por metilación un determinado nucleótido del ARNr 23S de la subunidad grande del ribosoma. Concretamente introduce dos metilos en el N de una determinada adenina, usando S-adenosilmetionina (SAM) como donador. Esto produce un cambio conformacional en el ribosoma que disminuye su afinidad hacia la eritromicina y hacia la lincomicina (resistencia cruzada a los dos antibióticos).
El mecanismo genético subyacente al carácter inducible de la metilasa es muy interesante; en lugar de un mecanismo a nivel transcripcional, como es habitual en las bacterias (véase capítulo 22), se trata de un mecanismo de regulación traduccional: en las bacterias en ausencia de eritromicina el ARNm de la enzima posee una estructura secundaria que evita su traducción por los ribosomas, pero en presencia de eritromicina este ARNm cambia de conformación y puede ser leído, produciéndose la metilasa que inactivará la diana del antibiótico.
Resistencia a las rifamicinasComo ya sabemos por el cap. 20, las rifamicinas actúan uniéndose a la subunidad ß de la ARN polimerasa eubacteriana. La resistencia a estos antibióticos depende de una mutación cromosómica que altera dicha subunidad, haciéndola insensible a estos inhibidores.
Resistencia a las quinolonas, novobiocina y coumermicinaLas mutaciones cromosómicas que interesan a la subunidad A de la ADN-girasa bacteriana producen resistencia al ácido nalidíxico. Sin embargo, las quinolonas de última generación (fluoroquinolonas como el ciprofloxacino) no se ven afectadas, quizá debido a la enorme potencia de estos quimioterápicos.
Las mutaciones cromosómicas que afectan a la subunidad B de la girasa rinden resistencia a la novobiocina y a la coumermicina

3.4. SINTESIS DE UNA NUEVA ENZIMA RESISTENTEResistencia a sulfamidasDeterminados plásmidos R portan genes de resistencia a sulfamidas (Su^R), que codifican una dihidropteroico sintetasa muy resistente a la acción de estos quimioterápicos, debido a que tienen una afinidad 10 000 veces menor que la enzima normal codificada por el cromosoma.
Resistencia a trimetoprimMuchos plásmidos R llevan un gen que codifica una dihidrofolatorreductasa (DHFR) muy resistente al trimetoprim.
Resistencia a meticilinaEn muchos hospitales medran cepas muy peligrosas de Staphylococcus aureus resistentes al ß-lactámico meticilina. Estas cepas producen una forma especial de proteína PBP2 (la llamada PBP2a) que posee una baja afinidad por los ß-lactámicos, incluyendo la meticilina. Parece que el gen codificador correspondiente reside en un transposón.