REGULACIÓN GENÉTICA

INTRODUCCIÓNDesde el punto de vista de la expresión genética, los operones bacterianos se pueden dividir en dos grandes tipos:

operones de expresión constitutiva (es decir, aquellos que se transcriben permanentemente, independientemente de las condiciones ambientales). Por ejemplo, operones para las ADN- y ARN-polimerasas;operones para las proteínas de las c. t. e.; operones para las proteínas ribosómicas, etc.
operones cuya expresión está regulada en función de las condiciones ambientales. Dentro de esta categoría, se distinguen a su vez: operones de expresión inducible; operones de expresión reprimible

En principio, por su modo la regulación puede ser de dos tipos :

Inducción: síntesis de ciertos enzimas debida a la presencia en el medio de sustratos metabolizables adecuados, o en términos más generales, por la existencia de determinados estímulos ambientales (no necesariamente de tipo nutricional). Ejemplo típico: la producción de b -galactosidasa es inducible en determinadas bacterias cuando en el medio aparece un azúcar de tipo b -galactósido (como la lactosa)
Represión: desconexión rápida de la ruta biosintética de un determinado compuesto, cuando éste aparece aportado en el medio de la bacteria. Ejemplo típico: si E. coli crece en ausencia de triptófano (Trp), la ruta para su biosíntesis está funcionando hasta que ese aa. aparezca en el medio. La represión no siempre tiene que ver con estímulos nutricionales: se pueden desconectar genes para evitar que su expresión interfiera con otros procesos que ya están en curso en la célula.

En resumen, y en relación con el modo de expresión genética que subyace a sustancias relacionadas con el metabolismo, la norma general es que:

la inducción permite el ajuste rápido para el uso de sustratos metabolizables;
la represión permite el ajuste para la síntesis de una sustancia que interviene como intermediario metabólico.

TIPOS DE MECANISMOS DE REGULACIÓN GENÉTICACasi cada uno de los niveles de los que depende la expresión de información genética puede estar sometido en principio a algún tipo de regulación, aunque el más frecuente es sobre la transcripción.
1) Nivel transcripcional

A nivel del inicio de la transcripción

sustitución del factor s de la ARN-polimerasa
por interacción de proteínas regulatorias sobre secuencias de ADN cercanas al promotor:

Terminación prematura de la transcripción: fenómenos de atenuación de la transcripción

Procesamiento de ARN

2) Nivel traduccional. Ejemplos:

regulación de la síntesis de las proteínas ribosómicas

regulación por ARN antiparalelo, que interfiere con la traducción del ARNm

3) Nivel postraduccional. Aquí ya no estamos ante mecanismos puramente de regulación genética. Algunos ejemplos: degradación de proteínas y modificación covalente de proteínas (p. ej., fosforilación). Regulación alostérica por retroalimentación (feed-back) de la actividad de las proteínas enzimáticas.
4) Sistemas globales de regulación

Cuando varios operones están regulados coordinadamente por un mismo tipo de estímulos, constituyen una red de regulación que se suele denominar con el nombre de regulón (p. ej., el regulón de los operones spo de la esporulación en las especies del género Bacillus).
Casi todos los productos de genes bacterianos están regulados en al menos uno de estos niveles, y a menudo lo están en varios niveles al mismo tiempo.
Como veremos enseguida, muchos de estos mecanismos se disparan en el interior celular debido a pequeñas moléculas que informan a la bacteria de un determinado cambio ambiental.

2. REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN2.1. REGULACIÓN DEL INICIO DE LA TRANSCRIPCIÓN2.1.1. REGULACIÓN POR SUBUNIDADES s ALTERNATIVAS
Se trata de una estrategia muy directa y sencilla, en la que la subunidad s "stándard" de la célula vegetativa normal se ve desplazada y sustituida por otro(s) tipo(s) de s diferentes (codificadas por genes distintos). La holoenzima de la ARN polimerasa con la nueva s reconoce ahora e inicia la transcripción a partir de un tipo distinto de promotor. Esto hace que se transcriban operones que hasta entonces permanecían "silenciosos" (sin expresión).
Veamos algunos ejemplos:

Uno de los casos mejor estudiados se da en las especies del gén. Bacillus, durante el proceso de la esporulación: Durante el crecimiento vegetativo, B. subtilis posee una holoenzima típicaa _2b b'+ s ⁴³ (= s ^A), que reconoce los promotores del tipo que estudiamos en el capítulo anterior. Al iniciarse la esporulación, se sintetiza una nueva s que desplaza a la s ^A(vegetativa). Ahora, la holoenzima reconoce los promotores de algunos operones spo (que estaban inactivos durante el crecimiento vegetativo), que codifican funciones requeridas durante las primeras fases de la esporulación. Algunos de los genes que ahora se expresan corresponden a otras subunidades s distintas de las dos citadas. En una fase más avanzada de la esporulación, una nueva "generación" de s (entre ellas la s ²⁹) desplaza a la segunda. Ahora la holoenzima correspondiente reconoce nuevos grupos de operones que codifican proteínas requeridas en fases más tardías de la esporulación. Cada nueva holoenzima reconoce un tipo distinto y característico de promotor (con secuencias de nucleótidos peculiares), que no puede ser reconocido por las otras versiones de la ARN polimerasa dotadas de subunidades sdiferentes.
La respuesta al choque por calor ("heat-shock") en E. coli: Si E. coli se somete a una agresión de altas temperaturas, se produce la inducción de unos 17 genes (genes de la respuesta al calor), cuyos productos tienden a evitar ciertos daños ocasionados por este agente. Esta respuesta está mediada por una nueva subunidad s (llamada s ³²) que desplaza a la s ⁷⁰ de la célula normal. La nueva holoenzima reconoce a los genes de la respuesta al calor, todos los cuales poseen un promotor con una región -10 totalmente diferente a la que vimos en el capítulo anterior: C C C A T N T
Cuando las enterobacterias sufren hambre de N (por ejemplo, no existe NH₃), una nueva subunidad s (llamada s^N o s⁵⁴) desplaza a la s ⁷⁰, y entonces la holoenzima reconoce promotores distintos, correspondientes a operones cuyos productos permiten utilizar otras fuentes de N más raras.

2.1.2. REGULACIÓN DEL INICIO DE TRANSCRIPCIÓN POR PROTEÍNAS REGULADORASComo ya apuntamos, podemos encontrar dos tipos de fenómenos:

inducción: el desencadenante del ajuste se denomina inductor;
represión: el desencadenante del ajuste se denomina correpresor.

En general, los desencadenantes de la respuesta se llaman efectores, y suelen ser moléculas de pequeño tamaño. Si estamos tratando con respuestas adaptativas metabólicas, podemos hacer la siguiente generalización:

El inductor suele ser el sustrato de una ruta catabólica, o una molécula muy semejante al sustrato natural.
El correpresor suele ser el producto de una ruta biosintética, o una molécula parecida.

El funcionamiento de estas moléculas en su papel de efectores no depende de su interacción metabólica en la ruta correspondiente. Lo que hacen los efectores es interactuar con proteínas reguladoras específicas para cada sistema (de cada operón o de cada grupo de operones). Y, a su vez, las proteínas reguladoras interactúan con una zona del operón cercana al promotor Es frecuente que muchas proteínas reguladoras compartan un dominio tridimensional característico denominado hélice-giro-hélice, que las capacita para reconocer determinadas secuencias del ADN.
Tanto la inducción como la represión génicas de funciones pueden deberse a su vez a:

controles positivos;
controles negativos.

Así pues, en la regulación del sistema tenemos varios tipos de elementos:

efectores: pequeñas moléculas que informan del ambiente exterior;
un elemento regulatorio que actúa en trans (a distancia): un gen regulador que codifica una proteína cuya única función consiste en controlar la expresión (a nivel de inicio de transcripción) de un operón de genes estructurales.

genes estructurales (normalmente agrupados en operones, donde los genes se contranscriben en forma de ARNm policistrónico). Estos genes pueden codificar proteínas estructurales, o proteínas enzimáticas o simplemente transcribirse a ARNr o ARNt.

La función controladora de la proteína reguladora se ejerce por su interacción con secuencias específicas al comienzo del operón, cerca del promotor. Estas secuencias son, pues, elementos que actúan en cis dentro del circuito regulatorio: esto significa que su efecto depende de que estén ligadas genéticamente con los genes estructurales que van a ser sometidos a control genético. Son secuencias que no codifican productos difusibles que pudieran actuar a distancia.
¿Cómo se puede distinguir y discriminar entre las funciones de un regulador que actúa en trans (a distancia) de una secuencia en cis? Esto se puede lograr a partir de la observación de los efectos fenotípicos de sus respectivas mutaciones y de los tests de complementación (aunque las bacterias son haploides, se pueden realizar ensayos de complementación genética en diploides parciales por medio de algún sistema de transferencia genética, como por ejemplo el uso de conjugación con factores F-primas (F'): véase tema 27):

La mutación inactivante de un gen regulador tiene efectos recesivos en trans y pleiotrópicos, que varían según que el control sea de tipo positivo o negativo:

en el caso de control negativo, la mutación tiene efectos constitutivos;
en el caso de control positivo, la mutación tiene efectos ininducibles.

La mutación de un operador tiene efectos dominantes en cis.
Por otro lado, la inactivación mutacional de un gen estructural simplemente priva a la célula de la función correspondiente.

Comparemos ahora las regulaciones genéticas de tipo positivo y negativo:

Control negativo:el sistema se expresa a menos que sea desconectado por la acción de una proteína reguladora, a la que se denomina represor. Dentro de este control podemos distinguir, a su vez:

Control negativo con efectos inductores (ej: en el operón lac): el represor, per se es activo, pero se inactiva en presencia del inductor.

Control negativo con efectos represores (ej: en el operón trp):el represor, per se es inactivo (aporrepresor), pero en presencia del correpresor se activa (adquiere su capacidad funcional), y es entonces cuando reprime al operón estructural.

Control positivo: los genes estructurales no se transcriben (o en todo caso lo hacen a un nivel basal bajo) a no ser que exista una proteína reguladora activa llamada apoinductor o activador. También aquí puede haber dos categorías:

Control positivo por inducción: la proteína activadora, por sí misma es inactiva, pero queda activada cuando se le une el inductor.

Control positivo por represión: la proteína activadora, per se, es activa, pero se inactiva cuando se le une el correpresor.

Obsérvese, pues, que el estado activo del operón varía según que se trate de un sistema inducible o reprimible:

en los sistemas inducibles, el estado activo es el inducido;
en los sistemas reprimibles, el estado activo es el desreprimido.

2.1.2.1. EJEMPLO DE CONTROL NEGATIVO E INDUCIBLE: Regulación del operón lac deE. coli
Iniciamos ahora el estudio de los controles genéticos en un sistema paradigmático: el operón lac(metabolismo de la lactosa) del colibacilo (Escherichia coli), que históricamente fue el primero en investigarse (por Jacob y Monod, años 50, y que les hizo ganar el premio Nobel en 1965). En este epígrafe abordaremos el comportamiento de este operón bajo regulación negativa (incorporando detalles ulteriores al trabajo de Jacob y Monod). Más adelante (2.1.2.3), veremos que el operón lactambién posee un control positivo.
El operón lac, está constituido por:

tres genes estructurales:

Gen lacZ: codifica la ß-galactosidasa (tetrámero de un polipéptido de 116 kDa);
Gen lacY: determina la ß-galactósido permeasa (46 KdA); proteína de membrana que realiza el simporte de H⁺ y lactosa.
GenlacA: determina ß-galactósido acetilasa, prescindible y de papel desconocido.

cis

y está controlado por el producto de un gen situado cerca del operón (pero que no forma parte de él; este es el elemento regulatorio en trans): el gen lacI, que codifica un represor que por sí mismo es activo como tal. El polipéptido de 38 kDa producido por este gen se agrega espontáneamente formando tetrámeros, que son la forma funcional del represor.
Veamos el funcionamiento del sistema:

Mientras en el medio no exista lactosa, el tetrámero del represor presenta una alta afinidad de unión hacia las secuencias del operador, y así impide que la ARN polimerasa reconozca y se una al promotor; por lo tanto, no existe apenas transcripción del operón de la lactosa. La actividad de unión al operador reside en el extremo N-terminal, que presenta un diseño característica en hélice-bucle-hélice. El operador al que se une presenta una secuencia palindrómica imperfecta.
Si en el medio existe lactosa (u otro azúcar de tipo ß-galactósido) como única fuente de C, dicho azúcar actúa como inductor del operón: se une a una zona de las subunidades del tetrámero del represor (codificado por lacI), con lo que se produce un cambio conformacional alostérico del represor; con ello disminuye la afinidad del tetrámero hacia la secuencia del operador, por lo que ahora la ARN polimerasa puede iniciar la transcripción. El represor inactivo "emigra" a zonas inespecíficas y aleatorias del ADN, distintas del operador.

Algunas ideas adicionales

En realidad el inductor natural no es exactamente la lactosa, sino el isómero alolactosa, que se origina nada más entrar aquella a la célula.
En el laboratorio se suelen denominar los llamados inductores gratuitos: se trata de moléculas artificiales (aunque b -galactósidos) que si bien pueden interaccionar con el represor, no pueden ser metabolizadas (a diferencia de la lactosa). Un ejemplo es el llamado IPTG (isopropil-b -D-tiogalactósido).
Se ha visto que el operón lac tiene de hecho tres secuencias de tipo operador. La denominada O₁ es la "clásica", parcialmente superpuesta con el promotor, pero también hay que contar con la O₂, centrada hacia la coordenada +440 del ARNm, y la O₃, bastante aguas arriba respecto del promotor (centrada hacia -82). Se ha propuesto que los tetrámeros del represor reconocen simultáneamente dos de estas secuencias, obligando al ADN a curvarse de modo pronunciado, evitando así que pueda actuar la ARN-polimerasa.
En Ingeniería genética se suele usar a menudo componente del operón lac. Por ejemplo, se puede recurrir al promotor lac (bien sea en su versión silvestre o en algún mutante) para lograr la expresión de ciertos genes. Uno de los usos más extendidos es el del gen lacZ, determinante de la b -galactosidasa. Cuando las células de Escherichia coli silvestres respecto de lacZcrecen en presencia del X-gal (un galactósido artificial), las colonias tiene un aspecto azul, debido a que la b -galactosidasa transforma dicho X-gal en una sustancia de color azul. Pero si el gen lacZ está inactivado (p. ej., porque tenga una delección o una inserción), las colonias son de color blanco.

Este tipo de dispositivo regulador es propio de rutas catabólicas, donde el principio de economía debe garantizar que las enzimas de la ruta sólo se induzcan en presencia del sustrato adecuado.
Como ya apuntamos más arriba, varios operones distintos pueden estar sometidos al mismo tipo de regulación por un determinado estímulo ambiental, constituyendo una unidad de regulación denominada regulón. Por lo tanto un mismo tipo de proteínas represoras (y en general, un mismo tipo de proteínas reguladoras) pueden interactuar sobre operadores correspondientes a diferentes operones, situados en lugares muy distintos del cromosoma. Cada tipo de molécula reguladura (ya sea represor o -en el caso de la regulación positiva- ya sea activador) reconoce un tipo de secuencia característica en el ADN, situada por lo general cerca del promotor.
Los operadores pueden estar situados de forma distinta en relación con los correspondientes promotores sobre los que influyen:

en posición 3' respecto del promotor;
en posición 5' respecto del promotor;
superpuestos parcialmente con el promotor;
incluso algunos forman parte de la región inicial de ADN que se llega a transcribir.

Algunos operones, como el gal de Escherichia coli poseen dos promotores, dos operadores, y están sometidos a dos proteínas represoras diferentes

2.1.2.2. EJEMPLO DE CONTROL NEGATIVO Y REPRIMIBLE: el caso del operón trp de E. coli
La regulación negativa y reprimible es muy apropiada y económica para "desconectar" la transcripción de los genes de rutas biosintéticas de intermediarios metabólicos (como aminoácidos, bases nitrogenadas y vitaminas) cuando los productos finales de estas rutas están disponibles a la bacteria a partir del medio de crecimiento. En estos sistemas, a diferencia de la regulación de operones catabólicos, la proteína reguladora es inactiva en sí misma, por lo que recibe el nombre deaporrepresor. El efector que desencadena la represión se denomina correpresor, y suele ser la sustancia del medio equivalente al producto final de la ruta biosintética. La unión del correpresor con el aporrepresor genera un complejo denominado represor activo.
El operón trp ded Escherichia coli está compuesto por:

Cinco genes estructurales en la secuencia trpEDCBA. Codifican cinco polipéptidos que a su vez constituyen tres enzimas implicadas en el paso de corísmico a triptófano.
Promotor
Operador (superpuesto al promotor).

A la zona del operador se pueden unir dímeros del elemento regulatorio en trans: un represor codificado por el gen trpR (que está lejos del operón estructural).
Entre el promotor y el inicio del primer gen estructural existe una zona regulatoria compleja (líder más atenuador) que interviene en un tipo de regulación distinta que estudiaremos más adelante. Como ya dijimos, son muy frecuentes los sistemas genéticos sometidos a varios niveles de regulación. La biosíntesis del triptófano posee tres niveles distintos:

inhibición metabólica feed-back (alostérica) de los enzimas por parte del producto final de la ruta (el triptófano);
el triptófano procedente del medio actúa como correpresor que activa al apo-represor, originalmente inactivo, producido por el gen regulador (trpR);
atenuación (que veremos más adelante), consistente en la terminación prematura de la transcripción a nivel de la secuencia líder del ARNm.

Así pues, en esta apartado consideraremos sólo el funcionamiento del sistema trp en cuanto al mecanismo de represión-desrepresión:

En un medio pobre en aminoácido triptófano: el gen trpR se expresa: se sintetiza el aporrepresor inactivo, por lo que la ARN polimerasa puede transcribir el operón de genes estructurales (trpEDCBA). Hay síntesis de las enzimas del operón a sus niveles desreprimidos.
En un medio rico en triptófano: el gen trpR se expresa igualmente: se sintetiza aporrepresor inactivo, pero al unirse a dos moléculas de triptófano que la bacteria ha captado del medio se produce un cambio de conformación que genera el represor activo (aporrepresor + correpresor): ahora reconoce y se une a la secuencia del "operador" (que está solapado con el promotor). Así se impide la transcripción del operón, aunque no totalmente. Esto da lugar al nivel de expresión basal o reprimido (que en el caso de este operón representa 1/60 del nivel desreprimido).

Además, en medio rico en triptófano, el gen regulador trpR se ve reprimido por su propio producto (aporrepresor + triptófano). Estamos ante un ejemplo de regulación autógena: el nivel de represor está autocontrolado:

Si existe demasiado represor, se impide la síntesis de más represor;
Si existe poco represor se posibilita la transcripción del gen trpR.

2.1.2.3. CONTROLES POSITIVOSAlgunos operones bacterianos poseen promotores tales que no pueden ser usados eficientemente por la ARN polimerasa de forma directa para el inicio de la transcripción, sino que además, requieren proteínas auxiliares activadoras. Es decir, la transcripción de estos operones no ocurre (o en todo caso ocurre a un nivel basal bajo), a no ser que la proteína activadora se una a zonas del ADN cercanas al promotor (normalmente al lado 5' respecto del promotor). Este tipo de promotores carecen de las secuencias típicas -35 y -10 a las que ya hemos aludido anteriormente
Como ejemplo de regulación positiva del inicio de transcripción estudiaremos la que existe en el operón lac de E. coli:
Para comenzar, recordemos el comportamiento de una población de esta bacteria cuando en su medio de cultivo existen dos fuentes de carbono: glucosa y lactosa. Como ya sabemos, se da un crecimiento en dos fases llamado crecimiento diáuxico: durante una primera fase, las bacterias aprovechan solamente la fuente más rica de carbono (la glucosa), creciendo de modo exponencial durante unas cuantas generaciones, hasta que agotan esta glucosa. A continuación se entra en una corta fase de tipo estacionario, que conduce a una nueva fase de crecimiento exponencial (aunque con un coeficiente m menor que el de la fase exponencial anterior) debido a que en ésta las bacterias han pasado a metabolizar la lactosa.
Mientras exista glucosa en el medio de cultivo, no se degrada la lactosa, debido al fenómeno conocido como "represión catabólica": el catabolismo de la glucosa "impide" de alguna manera que se expresen los genes del operón de la lactosa. Pero una vez que la glucosa se agota, el operón lac se activa y se expresa: se sintetizan las enzimas que permiten metabolizar la lactosa. La fase estacionaria representa el tiempo que tardan las bacterias en "conectar" y expresar los genes del catabolismo de la lactosa.
El nombre de "represión catabólica" se puso en un momento en el que se desconocía la base molecular de su funcionamiento. A pesar de que sigamos usando este nombre por motivos históricos, hoy sabemos que este fenómeno es la manifestación de un proceso de regulación genética positiva. A continuación pasamos a describirlo a nivel molecular (consultar esquema):
En breves palabras, lo que ocurre es que en presencia de una fuente rica de carbono (como es la glucosa) el mecanismo de regulación positiva del operón lac se inactiva. Por contra, en ausencia de glucosa y en presencia de la lactosa, este mecanismo es funcional, lo que permite la estimulación del inicio de la transcripción del operón.
Elementos del circuito regulatorio:

gen crp: codifica la proteína regulatoria: sintetiza un polipéptido que forma espontáneamente dímeros, constituyendo la denominada proteína relacionada con la represión catabólica (CRP), también conocida como proteína que une AMPc (CAP). Tal como es sintetizada por el gen crp, la proteína CAP es inactiva (apoinductor inactivo). Pero cuando la bacteria posee niveles adecuados de AMPc (que actúa como inductor), éste se une a la CAP, lo que conduce a que el dímero cambie de conformación: en esta nueva configuración el complejo CAP-AMPc reconoce una secuencia palindrómica cercana al promotor del operón lac (hacia su lado 5'), y actúa como activador del inicio de transcripción de este operón.
gen cya: codifica la adenilato-ciclasa, enzima que convierte el ATP en AMPc.
operón lac: a la descripción que ya dimos, solamente añadir que a la izquierda (o sea, al lado 5'o "aguas arriba") del promotor existe una secuencia palindrómica característica, que como acabamos de ver es el lugar de reconocimiento del complejo activador CAP-AMPc.

Veamos, pues, el funcionamiento del circuito regulatorio:Ante todo, hay que tener presente que el nivel intracelular de AMPc está en relación inversa con la velocidad de crecimiento de la bacteria. A su vez, la velocidad de crecimiento está en relación directa con la "riqueza" de la fuente de C.

En presencia de glucosa (fuente rica de C): como se recordará, en Enterobacterias la glucosa es transportada por el sistema de fosfotransferasa (sistema PTS^GLC, un ejemplo típico de transporte activo acoplado a translocación de grupos). Como es sabido, en este sistema hay dos enzimas específicas del azúcar a nivel de membrana, que reciben secuencialmente el fosfato (P), que a su vez será transferido a la glucosa, que de esta forma entra al citoplasma. Mientras exista glucosa, el sistema PTS^GLC estará funcionando, de modo que apenas habrá nivel de E-IIA^GLC fosforilada, porque rápidamente el fosfato es transferido a la glucosa en su tránsito por la membrana (bajo E-II^GLC~P). Ello supone una señal que inhibe a la enzima adenilato-ciclasa. Esto supone que en presencia de glucosa, los niveles de AMPc son bajos. Por lo tanto, el apoinductor CAP, aunque se está sintetizando, permanece inactivo, ya que al no haber apenas AMPc no puede cambiar de conformación. Esta es la base molecular del fenómeno de "represión catabólica": obsérvese que en realidad no es una auténtica represión, sino que se trata de la no activación de la proteína activadora, debida en última instancia al catabolismo de la glucosa. Además, la presencia de E-IIA sin fosforilar inhibe directamente a la b-galactósido permeasa que pueda haber en la membrana, por lo que tampoco la lactosa externa puede entrar a la célula.
En ausencia de glucosa: el sistema PTS^GLC no está transportando glucosa, por lo que ahora sí hay altos niveles de E-IIA^GLC(y bajos de la versión fosforilada). El sistema ahora no envía la señal inhibidora de la actividad adenil-ciclasa : se sintetizan niveles elevados de AMPc. Ëste se une a los dímeros de CAP (=CRP); el concomitante cambio de conformación permite al complejo CAP-AMPc reconocer su secuencia-diana palindrómica cerca del promotor de lac. En esta interacción con su secuencia-diana, la CAP obliga al ADN a curvarse unos 90^o Ahora la CAP interacciona con las subunidades a de la ARN polimerasa, de modo que ahora sí puede efectuar el inicio de la transcripción con gran eficiencia.

Así pues, hemos completado el estudio de la regulación del operón lac. En resumidas cuentas, cabe resaltar que se trata de un operón sometido a dos tipos de controles del inicio de la transcripción:

regulación negativa, con inducción en presencia de lactosa
regulación positiva, por activación

Por lo tanto, el operón lac, para que pueda transcribirse a pleno rendimiento requiere que se cumplandos condiciones simultáneamente:

No debe haber en el medio una fuente más rica de azúcar, como la glucosa (que libera la "represión catabólica" por el mecanismo de regulación positiva a través de CAP)
Debe existir el inductor exógeno (la lactosa), que inactiva el mecanismo de regulación negativa.

En Enterobacterias, lo que acabamos de describir para el operón lac lo podemos hacer extensivo a otros operones correspondientes al catabolismo de otras fuentes de C más pobres que la glucosa. Es decir, mientras exista glucosa en el ambiente de la bacteria, ésta será usada en primer lugar, de modo que mientras se metaboliza está operando el fenómeno de "represión catabólica". Pero una vez agotada, y suponiendo que exista una fuente alternativa de C, ésta pasará a ser usada, merced a la activación genética mediada por el complejo CAP-AMPc.
Ejemplos de otros operones controlados positivamente por CAP-AMPc:

operón ara (del catabolismo de la arabinosa);
operón gal (del catabolismo de la galactosa);
operón mal (del catabolismos de la maltosa).

Este conjunto de operones diferentes que están regulados por la proteína CAP se denomina regulón CAP.
En otras bacterias el fenómeno de represión catabólica no depende de AMPc-CAP, sino que la regulación positiva de operones catabólicos de azúcares distintos de la glucosa está mediada por proteínas activadoras diferentes.

Concluiremos nuestro estudio de los controles genéticos del inicio de la transcripción aludiendo brevemente a algunas de las variantes que podemos encontrar en los modelos de operones bacterianos:

operones con más de un promotor o/y operador, cada uno de los cuales funciona en respuesta a un tipo de estímulo o situación ambiental diferente, mediatizado a su vez por distintos tipos de proteínas reguladoras.
operones con promotores internos, situados dentro de la porción transcribible, y que responden a una regulación diferente del promotor principal (colocado al inicio del operón).
operones con terminadores de transcripción en las regiones intercistrónicas. Permiten "dosificar" la proporción relativa de los productos codificados por cada gen del operón, cuando esta dosis no tiene por qué ser equimolecular.
pares de operones que se transcriben en sentidos opuestos entre sí, y que usan un mismo promotor divergente.
proteínas reguladoras que pueden actuar como activadoras o como represoras, dependiendo de las condiciones ambientales. Ejemplo: el regulón mal (del catabolismo de la maltosa) consta de cuatro operones que están controlados por el producto del gen malT. En ausencia de maltosa, el producto actúa como represor de los operones mal. En presencia de maltosa, la proteína MalT cambia de conformación y se convierte en activador de la transcripción de esos operones.

No podemos olvidar aquí un tipo de operones transcribibles por holoenzimas de la ARN-polimerasa con subunidades s alternativas a la "estándar" s⁷⁰ que requieren para su transcripción eficiente la colaboración de proteínas activadoras especiales que reconocen secuencias de ADN situadas a bastante distancia aguas arriba respecto del respectivo promotor. Por ejemplo, en muchas bacterias Gram-negativas hay operones con un tipo de promotor especial (cuyas secuencias conservadas, centradas em -24 y -12 son diferentes a las citadas hasta ahora) reconocido sólo por la versión de la ARN-polimerasa provista de la subunidad s⁵⁴. Pues bien, para la transcripción de este tipo de operones (llamados ntr) se requiere la concurrencia de la proteína reguladora NtrC fosforilada, que reconoce una secuencia palindrómica a unas 100 pb aguas arriba del promotor. Al parecer, la unión de oligómeros de NtrC~P a sus secuencias de reconociemiento hace que el ADN se curve, de modo que esas NtrC~P hacen contacto con la ARN-polimerasa, y tras gastar ATP ayudan en el inicio de la transcripción.

2.2. REGULACIÓN POR ATENUACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN.La atenuación es un mecanismo de control que se da en ciertos operones de rutas biosintéticas (sobre todo de aminoácidos), por el cual una onda de transcripción recién iniciada puede terminar prematuramente en una zona denominada atenuador, antes de alcanzar al primer gen estructural de ese operón.
A nivel de ADN, el atenuador está situado entre el promotor y el inicio del primer gen estructural, dentro de la porción que a nivel de ARN representa al "líder".
La atenuación se produce por un control ejercido por la traducción, que a su vez responde al nivel intracelular del ARNt cargado con el aminoácido de la ruta biosintética en cuestión:

si existe suficiente nivel de ese aa-ARNt, habrá atenuación de la transcripción;
si no existe suficiente de ese aa-ARNt, no habrá atenuación, y por lo tanto la transcripción continuará hasta el final.

La presencia o ausencia del aa-ARNt concreto determina si el ribosoma puede traducir, o no, una zona temprana del ARNm (dentro de la porción del líder): si el ribosoma puede traducir esa zona (porque existe nivel de ese aa-ARNt), el avance del ribosoma detrás de la ARN polimerasa impide ciertos emparejamientos intracatenarios dentro del ARNm naciente, pero permite otros emparejamientos alternativos de modo que se forma una estructura secundaria de tipo terminador simple (independiente de r ). Por lo tanto la ARN- polimerasa se atranca en esta horquilla y finalmente se separa, deteniéndose así la transcripción antes de que la onda de transcripción haya alcanzado al primer gen estructural.
Mecanismo molecular de la atenuación: lo estudiaremos con el caso del operón de la biosíntesis del triptófano (trp), el primero en investigarse (por Yanofsky).
Primeras evidencias sobre el mecanismo de la atenuación del operón trp:

Ya hemos visto que el operón trp está sometido a una regulación negativa por represión. Pero se comprobó que esta no debía ser la única manera de regulación, ya que las mutaciones inactivadoras del gen trpR (del represor) aún dejaban un cierto nivel de espresión del operón estructural en ausencia de triptófano).
Por otro lado se comprobó que las mutaciones en el gen del ARNt^Trp y en el de la Trp-ARNt-sintetasa, así como en los genes cuyos productos intervienen en la modificación del ARNt^Trpincrementan la expresión del operón trp. Se podía colegir que el operón trp tiene otra regulación dependiente de la detección de los niveles de Trp unido al correspondiente ARN^Trp.
Dicha nueva regulación no se ejerce sobre las clásicas zonas reguladoras del operón (promotor, operador), sino sobre una secuencia de ADN (a la que se llamó atenuador) situada entre el final del promotor y el inicio del primer gen estructural del operón trp. Ello se dedujo porque la delección de dicha zona suprimía en cis este nivel de regulación dependiente del ARNt^Trp.
Los dobles mutantes inactivados para el gen trpR y para el atenuador sí mostraban ya expresión constitutiva del operón trp en presencia de triptófano en el medio.

Descripción del operón trp (consultar figura):observar la zona del promotor-operador (sobre la que ya vimos en un apartado anterior que se ejerce un mecanismo de control negativo por represión); observar la secuencia líder, al comienzo del ARNm, antes de la porción codificadora del primer gen (trpE). Este líder consta de 162 bases, y en su interior alberga una corta región con capacidad potencial de ser traducida por ribosomas: nótese que el péptido que se sintetizaría a partir de esta porción es rico en trp, es decir, tiene una alta proporción del mismo aminoácido objeto de la síntesis dependiente del operón trp.
Como ya dijimos antes, la clave de la regulación estriba precisamente en el líder (incluyendo la porción del péptido rico en triptófano). La porción de ARNm correspondiente al péptido del lider forma parte de una zona que puede adoptar estructuras secundarias distintas y alternativas, debido a la posibilidad de establecer emparejamientos intracatenarios:

bien se emparejan la zona 1:2 y la 3:4;
o bien se empareja la 2:3, quedando la 1 y la 4 sin emparejar.

Pues bien, la estructura en horquilla formada por el emparejamiento de 3:4 constituye un típico terminador de la transcripción independiente de r .
Pasemos, pues, al funcionamiento del mecanismo de atenuación:

Si existe suficiente triptófano en el medio: la bacteria capta triptófano, y sintetiza el triptofanil-ARNt (ARNt^trp); habrá "pool" suficiente de este ARNt^trp como para poder ser usado normalmente en la síntesis de proteínas. La ARN polimerasa va transcribiendo el operón trp, y detrás de ella los ribosomas comienzan a cubrir la zona del péptido dentro de líder del ARNm. Tras traducir la porción 1 del líder, el ribosoma cubre enseguida y traduce la porción 2. Mientras tanto, la ARN-polimerasa acaba de transcribir las porciones 3 y 4. La porción 3 se empareja espontáneamente con la 4. (Obsérvese que a la porción 3 no le queda más remedio, ya que la porción 2, con la que teóricamente también puede emparejarse no está disponible, ya que está "oculta" -cubierta- por el ribosoma). Consecuencia: al formarse la horquilla 3:4, seguida por la ristra de uracilos (U), se constituye un típico terminador de transcripción independiente de r : se termina prematuramente la transcripción (antes de que la onda de transcripción haya alcanzado al primer gen estructural, trpE): este es precisamente el fenómeno de atenuación.

NOTA: recuérdese que, aparte de la atenuación, el operón trp está sometido a control por represión. Estas dos regulaciones pueden superponerse, y cada una supone una disminución del nivel basal de transcripción de ese operón en ausencia de control:

la atenuación hace bajar 10 veces el nivel basal;

la represión hace bajar 60 veces el nivel basal;

las dos juntas, obviamente, suponen una reducción de 600 veces sobre el nivel basal.

Si el triptófano es limitante en el medio: la bacteria dispondrá de pocos ARNt cargados on el aminoácido triptófano (o sea, el "pool" intracelular de ARNt^trp estará a bajos niveles). El ribosoma, al llegar a los codones de triptófano dentro de la porción codificadora del líder, se quedará "atrancado", debido a que no encuentra el ARNt^trp que introduzca el triptófano frente a dos codones seguidos para ese aminoácido. El ribosoma se queda, pues, detenido en la porción 1. Mientras tanto, la ARN polimerasa "le va sacando ventaja" al ribosoma, de modo que transcribe la porción 2, luego la porción 3... pero antes de terminar con la porción 4, la 2 y la 3 se emparejan entre sí (de modo que es ahora la 4 la que se queda sin emparejarse). Esto implica que ya no se puede formar la estructura secundaria 3:4 seguida de varios U: por lo tanto, no hay terminación de la transcripción, sino que ésta continúa y abarca a todo el operóntrp, y finalmente se sintetizan las enzimas biosintéticas que conducirán a la síntesis del aminoácido triptófano.

Otros casos de atenuación:La atenuación es un sistema de control genético de una amplia variedad de operones biosintéticos, especialmente de aminoácidos. Otros ejemplos descubiertos después del sistema trp:

operón his: síntesis de histidina;
operón phe: síntesis de fenilalanina;
operón leu: síntesis de leucina;
operón thr: síntesis de treonina;
operón ilv: síntesis de isoleucina y de valina.

Algunos de estos operones (como el his) sólo poseen atenuación como mecanismo de control, mientras que otros gozan, además de regulación por represión.
Los ARNm de cada uno de estos operones posee en su inicio una porción líder más o menos larga, pero con las características que ya hemos visto:

contiene un marco de lectura abierta (ORF=open reading frame) con capacidad potencial de codificar un péptido rico en el aminoácido que la ruta correspondiente debe sintetizar. Por ejemplo: La ORF del líder del operón his codifica un péptido de 17 aa., de los cuales 7 son histidina. La ORF del líder del operón leu codifica un péptido de 28 aa., de los cuales 4 son leucinas.
el líder del ARNm puede formar estructuras secundarias alternativas, incluyendo un atenuador (es decir, una estructura en horquilla seguida de ristra de uracilos, que actúa como un poderoso terminador prematuro de la transcripción).

En resumen: La atenuación es un mecanismo que permite detectar los bajos niveles intracelulares del aminoácido en cuestión (bajo la forma de aminoacil-ARNt), los cuales dependen a su vez de bajos niveles del aminoácido en el medio, de modo que la bacteria responde a las necesidades inmediatas de ese aminoácido (que se requiere para la síntesis proteica). El mecanismo estriba en la capacidad o incapacidad del ribosoma para atravesar la región líder, lo que a su vez determina la formación de estructuras secundarias alternativas en el líder. Como se puede constatar, la atenuación es un mecanismo que depende totalmente del estrecho acoplamiento que existe en bacterias entre transcripción y traducción.

2.3. PROCESAMIENTO DE ARN EN BACTERIASComo ya sabemos, en eubacterias, a diferencia de eucariotas, no existen mecanismos de regulación genética por procesamiento (maduración) de ARN primarios. La única excepción la constituye el hecho de que los ARN ribosómicos y ARN transferentes se sintetizan a partir de ARN precursores que son madurados de forma específica hasta dar las moléculas funcionales respectivas. Pero aquí no estamos propiamente ante un sistema de control genético para adaptación al medio, sino que se trata de un mecanismo constitutivo.

3. REGULACIÓN GENÉTICA A NIVEL DE TRADUCCIÓN

Un primer caso de regulación traduccional lo constituye el simple hecho de que distintos ARNm (correspondientes a operones diferentes) presentan diferentes eficiencias a la hora de su unión a los ribosomas. Ello condiciona que el conjunto de los mensajeros de una misma bacteria exhiba amplios rangos de tasas de traducción (con diferencias de hasta 3 órdenes de magnitud -unas miles de veces- entre unos y otros).
Pero aparte de ese mecanismo general e inespecífico, existen dos sistemas "refinados" para regular la expresión a nivel de la traducción:

por proteínas que "ocultan" el sitio de unión inicial del ARNm al ribosoma (o sea, enmascarando la región de inicio de la traducción, que incluye la secuencia de Shine-Dalgarno);
por un ARN regulador antiparalelo que forma un híbrido de ARN de cadena doble con la porción 5' del mensajero, con lo cual igualmente deja inservible la secuencia de Shine-Dalgarno.

Veamos un ejemplo de cada uno de estos mecanismos:

3.1. REGULACIÓN DE LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS RIBOSÓMICAS

Como vimos en el tema 10, los ribosomas bacterianos son estructuras supramoleculares complejas formadas por dos subunidades (30S y 50S), a base del ensamblaje de proteinas ribosómicas (proteínas S de la subunidad pequeña y proteínas L de la subunidad grande) y ARN ribosómicos. La cantidad de ribosomas de una célula depende de la tasa de crecimiento: en un medio pobre o con limitación de algún nutriente la cantidad es menor (p. ej., 20.000) que en un medio rico (p. ej., 70.000). Aunque las proteínas ribosómicas y los ARNr se sintetizan independientemente, la regulación de la síntesis de las proteínas ribosómicas está acoplada al nivel de ARNr libres, por un mecanismo en el que si el nivel de los ARNr libres es bajo (porque casi todos esos ARNr ya se han unido a las correspondientes proteínas ribosómicas) alguna de las proteínas ribosómicas "en exceso" se une a su propio ARNm, impidiendo la ulterior traducción de éste.
Los genes de:

las distintas proteínas ribosómicas (proteínas S y proteínas L);
los factores de elongación (EFTu, EFG);
las subunidades de la ARN polimerasa (ß, ß', etc)

se disponen formando varios operones (dispersos en distintos loci del cromosoma bacteriano). Todos estos operones de genes codificadores de productos implicadas en la biosíntesis de proteínas están sujetos a una regulación autogénica a nivel de traducción.
La base de esta regulación consiste en lo siguiente:

en cada uno de estos operones una de las proteínas codificadas (que es siempre una proteína ribosómica) actúa a su vez como inhibidora de la traducción de (al menos una parte) del ARNm del operón que la codifica (regulación autogénica).
En cada caso esta proteína, en su papel de proteína ribosómica, se une directamente, y con gran afinidad, a un ARNr específico, reconociendo una estructura secundaria concreta de éste. (Esto forma parte del proceso normal de ensamblaje de los ribosomas a partir de los distintos tipos de ARNr y de proteínas ribosómicas).
Ahora bien, si la bacteria se encuentra en una situación en la que ya no existe ARNr libre como tal, sino que todo el ARNr está ya participando de ribosomas ensamblados, la proteína ribosómica-reguladora se une ahora a una región del ARNm propio (que la codifica a ella y a otras proteínas ribosómicas). ¿Por qué se une y cuál es el efecto?

La proteína ribosómica-reguladora, al no encontrar la estructura secundaria del ARNr se une ahora a una estructura secundaria muy similar en el propio ARNm, ocultando la secuencia de Shine-Dalgarno. Por lo tanto, no hay traducción del propio tipo de mensajero: el efecto neto es que desciende el nivel de proteínas ribosómicas en respuesta a una escasez de ARNr. Significado biológico de esta regulación:

El uso de proteínas ribosómicas que se unen a ARNm como reguladores negativos autógenos de la traducción supone un mecanismo que garantiza la estrecha relación molar entre síntesis de proteínas ribosómicas y ARNr. Esto implica que no exista un exceso de proteínas ribosómicas en relación con el ARNr, o sea, se logra que se sinteticen la cantidad justa de proteínas ribosómicas que puedan ensamblarse con los respectivos ARNr.
De esta manera se consigue que el nivel de proteínas ribosómicas se corresponda armónicamente con la velocidad de crecimiento de la bacteria, la cual influye sobre el nivel del ARNr. (La influencia de la velocidad de crecimiento sobre la síntesis de ARNr y ARNt la veremos en el apartado 2.7.1).

3.2. REGULACIÓN DE LA TRADUCCIÓN POR MEDIO DE ARN ANTISENTIDO

Todos los sistemas de regulación que hemos estudiado hasta ahora se basan en la existencia de elementos reguladores en trans (o sea, difusibles y actuantes "a distancia") que son siempre proteínas. Fue una sorpresa el que a mediados de los años de 1980 se descubrieran sistemas de regulación dependientes no de proteínas, sino de ARN reguladores en trans.
La base es la siguiente: la transcripción del "gen regulador" genera un ARN no traducible a proteína, cuya secuencia es complementaria de la región 5' del ARNm del gen a regular: ambos forman un híbrido de ARN de cadena doble (c.d.) por el que queda enmascarada la secuencia de Shine-Dalgarno del ARNm: el ARNr 16S del ribosoma no puede reconocer al ARNm y no puede traducirse el mensajero.

4. REGULACIÓN POSTRADUCCIONAL

Todos los mecanismos que acabamos de describir están encaminados a alterar la concentración de un(os) determinado(s) producto(s) génico(s) ante un cambio ambiental. La combinación de dichos mecanismos permite que la síntesis de las macromoléculas resulte económica (evitándose su producción en circunstancias en las que no hace falta o es superflua). Sin embargo, estos mecanismos tienen limitaciones intrínsecas:

los mecanismos genéticos no pueden dar un ajuste fino a lo largo de una misma ruta metabólica.
las proteínas tienen una vida media relativamente larga. Ello implica que pueden seguir actuando aun cuando los genes respectivos que las sintetizaron estén "silenciosos". Es decir, teóricamente, las proteínas podrían seguir actuando incluso en situaciones en las que ya no hacen falta (o incluso podrían ser contraproducentes), hasta que estas proteínas se diluyeran debido al crecimiento (multiplicación celular).

Para encarar precisamente estos problemas, la evolución ha desarrollado mecanismos postraduccionales que permiten los necesarios ajustes finos. Los principales tipos son los siguientes:

Degradación de proteínas.
Modificación química de enzimas.
Regulación feed-back de la actividad enzimática (alosterismo).

El último tipo de regulación entra dentro de la categoría de procesos de tipo metabólico y enzimático que se estudian ampliamente en la asignatura de Bioquímica, por lo que aquí no insistiremos más en ellos.

4.1. REGULACIÓN POR DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS

La concentración de cada tipo de proteína depende esencialmente de:

la tasa de su síntesis por los ribosomas;
la tasa de su degradación.

Las bacterias, a diferencia de los organismos superiores, tienen una baja tasa de "turnover" (reemplazo) de proteínas. Es decir, las vidas medias de las proteínas bacterianas son relativamente largas.
Sin embargo, existen circunstancias especiales en las que es esencial "desembarazarse" de ciertas proteínas de forma rápida y efectiva, para adaptarse a un cambio ambiental. Para estos casos, las bacterias disponen de mecanismos de degradación rápida de proteínas:

Durante situaciones de hambre de aminoácidos se pone en marcha un mecanismo de regulación global llamado respuesta estricta en el que, entre otras cosas, se da una degradación de proteínas. (Lo estudiaremos más adelante).
Degradación de proteínas defectuosas (anormales y mutantes). Para ello existen unas proteasas especiales, de las cuales la más importante es la proteasa Lon, cuya actividad depende de la hidrólisis de ATP. Esta proteasa Lon reconoce proteínas defectuosas (con desnaturalización parcial), y las rompe en péptidos cortos, los cuales son luego digeridos por peptidasas, para dar aminoácidos.
Una situación especial la constituye la esporulación de Bacillus. Como se recordará, la esporulación requiere la síntesis de nuevas proteínas para la espora, y una serie de grandes cambios para la célula-madre. Para lograr esto, se inducen una serie de proteasas que degradan una buena parte de las proteínas de la célula-madre (vegetativa). Los aminoácidos derivados de esta degradación son reutilizados para la síntesis de nuevas enzimas necesarias para la producción de la endospora.

4.2. MODIFICACIÓN QUÍMICA DE ENZIMAS

En eucariotas es muy frecuente la estrategia de modificar la actividad de enzimas (y en general de proteínas) por unión covalente de un radical químico. Por ejemplo, muchos procesos están regulados por proteín-quinasas de distintos tipos, que fosforilan a otras proteínas, lo cual permite la modulación de su actividad biológica.
Hasta hace pocos años se creía que las bacterias no poseían este tipo de control, pero recientemente están surgiendo numerosos ejemplos de importantes sistemas de regulación con implicación de actividad proteín-quinasa. De hecho se ha descubierto que numerosas bacterias poseen juegos de parejas de proteínas, agrupables en dos tipos de "familias" (conservadas evolutivamente en distintos grupos bacterianos). Sin embargo, aquí estamos ante un sistema en el que una vez que las proteínas se fosforilan, se ponen en marcha mecanismos reguladores de otro tipo, por lo que vamos a estudiarlo a continuación en un epígrafe aparte.

5. SISTEMAS DE REGULACIÓN DE DOS COMPONENTES: SENSORES Y REGULADORES DE RESPUESTA

Recientemente se ha descubierto que muchas bacterias poseen un tipo de mecanismo para detectar las variaciones de su medio ambiente y regular concomitantemente la transcripción de ciertos operones. Esta clase de regulación se basa en pares de proteínas, en los que el primer miembro detecta el cambio ambiental (sensor), de modo que "transmite" esa información al segundo miembro, que es el responsable de la regulación dentro de la célula. Los distintos sensores, a pesar de que cada uno detecta un estímulo diferente, conservan entre sí al menos parte de su secuencia, y lo mismo ocurre con los reguladores de respuesta, por lo que se habla de dos familias de proteínas (cada una con un probable origen evolutivo común):

Familia de histidín-proteín-quinasas (HPK): Este tipo de proteínas son las sensoras de algún tipo de estímulo ambiental. Muchas de ellas son autofosforilables, pero su función esencial es la de fosforilar (usando el P en situación g del ATP) al correspondiente 2º miembro de la pareja. Los distintos sensores suelen tener en común su porción carboxiterminal, denominada dominio transmisor (que incluye la histidina fosforilable). Los sensores suelen ser proteínas integrales de membrana citoplásmica. Cada sensor tiene un dominio aminoterminal característico, inmerso en el espacio periplásmico, y de este modo "detectan" algún estímulo procedente del ambiente. Al hacerlo, parece que cambian de conformación, de modo que el dominio transmisor intracitoplásmico se autofosforila y luego fosforila al correspondiente regulador de respuesta.
Familia de reguladores de respuesta (RR): cada regulador de respuesta, tras ser fosforilado en cierto aspártico por su correspondiente HPK, ejerce algún efecto regulatorio. Normalmente, los RR fosforilados actúan como activadores de la transcripción de ciertos operones. Los distintos reguladores comparten un mismo tipo de dominio aminoterminal, denominado dominio receptor, que incluye el aspártico que recibe el fosfato del sensor correspondiente. Los reguladores que actúan como activadores de transcripción suelen incluir un dominio carboxiterminal a base del típico motivo hélice-giro-hélice, capaz de interactuar con ciertas secuencias de ADN.

6. MECANISMOS REGULATORIOS GLOBALES

Para finalizar este recorrido por los principales tipos de mecanismos de regulación de la expresión génica en bacterias, vamos a referirnos brevemente a algunos ejemplos de grandes sistemas de operones que se ven sometidos a una regulación coordinadada común, encaminada a la superviviencia de la bacteria en determinadas circunstancias ambientales extremas o a realizar grandes ajustes metabólicos para adaptarse a cambios bruscos en las condiciones nutricionales.

6.1. El regulón de operones SOS:

Como ya vimos en el capítulo de "Influencia de los agentes físicos sobre las bacterias", en determinados procariotas existe un sistema inducible de reparación a los daños severos al ADNocasionados por agentes como la luz UV o las sustancias alquilantes. Los genes SOS se desreprimen según el siguiente esquema:
Cuando el ADN de la bacteria está seriamente dañado, existen zonas de ADN de cadena sencilla sin reparar. Esto constituye una señal por la que la proteína RecA (que está en este momento a una concentración basal relativamente baja) se modifica y se convierte en una proteasa muy específica (RecA).
La RecA rompe a la proteína LexA, que estaba reprimiendo una serie de operones, incluyendo arecA, uvrABC, umuDC, etc. Por lo tanto, estos genes se expresan ahora a alto nivel:

la expresión de uvrABC induce mejora de reparación por escisión resíntesis;
la expresión de recA mejora reparación por recombinación;
la expresión de umuDC favorece una síntesis "de emergencia" de ADN, por la que se introducen frecuentes errores: hay aumento de la mutagénesis;
se altera la regulación del crecimiento y división celular: las células se hacen filamentosas, muy largas, con formas anómalas.

Todos estos cambios, a pesar de las alteraciones que provocan en las células, suponen la salvaguardia, en última instancia de su viabilidad. Cuando las circunstancias agresivas (UV) desaparezcan, el mismo circuito regulario se encarga de que las células vuelvan rápidamente a su metabolismo normal.

6.2. Respuesta al choque por calor ("heat-shock")

La llamada respuesta al choque por calor es un mecanismo adaptativo compartido por prácticamente todos los seres vivos, consistente en el aumento rápido de la síntesis de una serie de proteínas (denonimadas proteínas Hsp) ante la elevación brusca de la temperatura por encima de la óptima, con un ulterior descenso lento a sus niveles basales. A pesar de que esta respuesta se descubrió precisamente ante aumentos de temperatura, se sabe ahora que en realidad se induce ante otros tipos de agresiones o estrés ambientales (como por ejemplo, presencia de etanol u otros solventes orgánicos en el medio, o daño al ADN). Las proteínas Hsp protegen a las células del daño que les causaría una posterior elevación adicional de la temperatura. Obviamente, este sistema parece que constituye un mecanismo adaptativo de protección que, una vez que detecta incrementos anómalos de temperatura, prepara a la bacteria para soportar períodos relativamente largos a temperaturas por encima de la óptima de crecimiento.
En Escherichia coli la mayor parte de los 30 genes codificadores de proteínas Hsp forman un regulón, y los correspondientes operones son transcritos por la versión de la ARN-polimerasa provista de la subunidad s³².
La mayor parte de las proteínas Hsp se expresan a niveles basales durante el crecimiento normal, pero tras la agresión ambiental, aumentan abruptamente y luego vuelven lentamente al nivel normal (aun cuando p. ej., la temperatura siga alta). Algunas de las Hsp son proteínas celadoras ("chaperonas"; véase tema 10) que intervienen en el plegamiento adecuado de otras proteínas. Entre estas celadoras se encuentran GroE, DnaK, DnaJ y GrpE. Otras Hsp son proteasas (como la Lon) que degradan proteínas demasiado anómalas. Estos papeles de las proteínas Hsp explican por qué la respuesta al choque por calor es transitoria:

Inmediatamente después de la agresión ambiental, las proteínas, al no tener las concentraciones de sales y otros componentes adecuados a su estabilidad, tienden a desnaturalizarse. La respuesta adaptativa viene enseguida, aumentando los niveles de proteínas celadoras (que ayudan a replegarse a las proteínas defectuosas, parcialmente desnaturalizadas) y de proteasas (que eliminan proteínas inútiles desnaturalizadas).
Pero una vez que ha pasado un tiempo, el medio interno de la célula ya se ha adaptado a las nuevas condiciones, por lo que ya no hace falta un nivel tan alto de Hsp, por lo que la respuesta va remitiendo.

Los operones del regulón del choque por calor se transcriben a partir de promotores especiales (con su propia secuencia consenso) cuando son reconocidos por la holoenzima de la ARN-polimerasa con la subunidad s³². Durante el crecimiento en condiciones normales, hay muy pocas moléculas de s³²en la célula, pero cuando sube la temperatura de 30 a 42 ºC, los niveles suben 15 veces, de modo que aumenta la transcripción de los genes del choque térmico. Al parecer, esos niveles de s³² vienen regulados postraduccionalmente por alguna de las propias chaperonas.
El modelo actual dice lo siguiente:

en condiciones normales las proteínas celadoras (chaperonas) DnaK, DnaJ y GrpE se unen a polipéptidos nacientes ayudándoles a plegarse adecuadamente. Una de ellas (probablemente DnaK) se une también a la poca s³², de modo que ésta no sólo no puede ayudar al inicio de transcripción de los operones Hsp, sino que además queda inestabilizada y es más susceptible de ataque por proteasas.
Cuando hay un choque por calor, al cambiar bruscamente las condiciones del medio celular, las proteínas en general tienden a desnaturalizarse, por lo que en un primer momento las chaperonas se dedican a intentar replegar correctamente el mayor número de proteínas. Esto significa que ahora la DnaK tiende preferentemente a unirse a proteínas diferentes del factors³². Por lo tanto, la s³² intacta se va acumulando en la célula e incrementa su actividad, y se puede producir el aumento de expresión de los operones Hsp, incluyendo el mismo dnaK. Esto explica igualmente el fenómeno ya comentado de que la expresión de las Hsp va volviendo poco a poco a su nivel basal: cuando se ha acumulado una buena cantidad de DnaK suficiente para ayudar a replegarse a las proteínas celulares, y cuando ha dado tiempo a que las condiciones internas se ajusten a las condiciones del estrés ambiental, vuelve a haber DnaK "libre" como para volver a unirse a la s³², de modo que lentamente se vuelve al nivel normal de transcripción de los genes de las proteínas del choque térmico.

6.3. La regulación de la síntesis de ARNr y ARNt

6.3.1. Respuesta estricta

En la naturaleza, las bacterias pasan a menudo períodos de hambre, especialmente por carencia de aminoácidos, de modo que este suministro de aminoácidos sería insuficiente para mantener la síntesis proteica. La respuesta estricta es un mecanismo de adaptación rápida de las actividades celulares al pasar la bacteria bruscamente de un medio rico a otro pobre en aminoácidos, o cuando se agota la fuente de C. Consiste en un mecanismo de ahorro para aguantar y sobrevivir a "los malos tiempos": la bacteria ahorra sus recursos y se implica en el menor número de actividades, hasta que no mejoren las condiciones.
Como veremos, el ajuste se realiza por medio de una rápida respuesta al nivel general de aa-ARNt (ARN transferentes aminoacilados).
Descripción de la respuesta estricta desde un punto de vista fisiológico:En esta situación se puede observar una variedad de cambios metabólicos:

Reducción masiva en la síntesis de ARN estable (o sea, de ARNr y ARNt); esto hace que el nivel de ARN total baje a un 5-10% del normal.
Al bajar el nivel de ARNr, se produce un descenso en la traducción de los ARNm correspondientes a las proteínas ribosómicas (por el mecanismo estudiado en 3.1). Por lo tanto, baja la síntesis de proteínas ribosómicas, y disminuye la concentración de ribosomas.
Se produce un descenso de una 3 veces en la síntesis de ARNm total. Algunos mensajeros son muy "vulnerables" y prácticamente desaparecen.
Aumenta la tasa de degradación de proteínas, por protesas especiales.
Se dan grandes ajustes metabólicos: baja la síntesis de hidratos de C, de lípidos, de nucleótidos y el transporte de nutrientes, pero proporcionalmente aumenta la síntesis de aminoácidos.

Como resumen de todo lo anterior, se puede concluir que esta respuesta va encaminada a: impedir por un lado acumulación de la maquinaria de traducción (ribosomas, ARNt) que no sería útil en ausencia de un aporte exógeno de aminoácidos; aumentar la producción de aminoácidos, tanto por degradación de proteínas como por nueva síntesis.
Pero una vez que la célula produce los suficientes aminoácidos para las nuevas condiciones, finaliza la respuesta estricta y la célula vuelve a sus patrones habituales de expresión genética, aunque por supuesto adaptados al nuevo medio (aquí entrarían en operación algunos de los sistemas habituales de regulación de la transcripción ya estudiados).
Base molecular de la respuesta estricta:

Cuando la bacteria queda deprivada en su medio de algún aminoácido (supongamos ahora que se trata del triptófano) va a haber poco ARNt cargado con ese aminoácido (en el ejemplo, poco ARNt^Trp). Por lo tanto (y recordando algo del mecanismo de síntesis de proteínas), ese ARNt descargado no podrá unirse al factor de elongación EF-Tu, y no podrá entrar al sitio A del ribosoma.
Por consiguiente, cuando el ribosoma llegue a un codón para ese aminoácido (en nuestro ejemplo del triptófano podría ser el codón UUU), al no encontrar el ARNt cargado correspondiente, el ribosoma se detendrá.
Si la detención del ribosoma se prolonga, un ARNt descargado termina por acceder al sitio A, aun cuando lo haga en ausencia del factor EF-Tu.
Esta entrada "ilegítima" del ARNt descargado estimula la actuación de una proteína llamadaRelA que se asocia al ribosoma. La proteína Rel A cataliza la producción de un extraño nucleósido de guanosina provisto de 4 fosfatos, a partir del GDP:
(5') ppG + ATP --------------------> (5') ppGpp (3') + AMP
Por lo tanto, la célula va acumulando ppGpp, que es el que va a regular los operones de los ARNr y ARNt. El mecanismo exacto de la regulación aún no se conoce en detalle, pero parece que incluye la acción directa sobre los promotores de esos operones así como sobre la ARN-polimerasa, bloqueando el inicio de transcripción. Igualmente parece que inhibe la tasa de elongación de otros operones.

6.3.2. Regulación por la tasa del crecimiento

Como ya dijimos, una bacteria tiene más ribosomas (y ARNt) en un medio rico que en un medio pobre. No se conoce exactamente cómo se realiza este control de la tasa de crecimiento sobre la síntesis de ARN estables, pero al parecer, cuando la bacteria pasa a un medio pobre, algunos de los ribosomas "en paro" (es decir, que no están traduciendo ARNm) inhiben de algún modo la síntesis de ARNr y ARNt, y por lo tanto la célula tenderá a producir sólo la cantidad de ribosomas que necesita en esas condiciones nutricionales. Hay indicios de que este efecto se logra de nuevo a través del ppGpp, aunque en este caso su síntesis no depende del gen relA, sino de otro gen denominado spoT.

VARIACIONES HEREDITARIAS NO ASOCIADAS CON TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO. MUTACIÓN. SUPRESIÓN

VARIACIONES BACTERIANAS ASOCIADAS A CAMBIOS EN EL GENOTIPO

Los diversos cambios morfológicos, estructurales y funcionales ocurridos a lo largo de la evolución de los seres vivos tienen como base los cambios en los genotipos, que esencialmente pueden ser de dos tipos:

mutaciones. pesar de que el mecanismo de la herencia genética es fiel y tiende a la conservación, esta fidelidad no es absoluta e inflexible. Las mutaciones son cambios bruscos ocurridos en el genotipo, y que son transmitidos a las generaciones siguientes.
recombinaciones subsiguientes a intercambio genético.En la mayoría de los eucariotas, pueden ocurrir recombinaciones entre genotipos individuales de una misma población. En los fenómenos de sexualidad se origina una variedad casi infinita de nuevas ordenaciones o genotipos, sin necesidad del aporte de nuevas mutaciones. Ello suministra una materia prima sobre la que puede actuar la selección, de modo que las poblaciones pueden ir evolucionando con el paso del tiempo, en función de presiones ambientales.

¿Qué ocurre en bacterias?

Los procariotas son organismos con tiempos cortos de generación: se reproducen rápidamente y pueden dar origen en poco tiempo a grandes poblaciones. Por supuesto, experimentan fenómenos de mutación, por lo que las poblaciones pueden acumular gran número de mutaciones. Estudiaremos la mutación (y los modos posibles de su eliminación) en el presente capítulo.
Pero la mutación no es el único tipo de variación genotípica en bacterias. Aunque los procariotas carecen de fenómenos de sexualidad auténtica, existen variaciones genéticas asociadas a la adquisición por una bacteria de parte del material genético de otra bacteria o de un bacteriófago. Los posibles mecanismos de transferencia de información genética entre bacterias son:
transformación (que estudiaremos en el capítulo 25);
transducción (ver capítulo 26);
conjugación (ver capítulo 27).

Los fenómenos de recombinación genética asociados a la transferencia serán abordados en elcapítulo 24.

1. INTRODUCCIÓN A LAS VARIACIONES HEREDITARIAS NO ASOCIADAS A TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO

Definiciones iniciales:

Desde un mero punto de vista fenotípico, mutación es la aparición brusca y espontánea de una variación fenotípica de un individuo, la cual se transmite hereditariamente a la progenie.

Pero tras el descubrimiento del ADN como material de la herencia, podemos plasmar una definición más ajustada, desde el punto de vista genotípico:

Mutación es cualquier alteración de la secuencia de bases de un segmento de ADN correspondiente a un gen o a un locus (sea éste transcribible o no), aun cuando esta alteración no se refleje en forma de cambio fenotípico observable o detectable.

Alelo es cada una de las distintas versiones en que puede presentarse un gen.

alelo silvestre: "forma" (secuencia) de un gen en las bacterias aisladas de su hábitat natural (estirpes silvestres). En la naturaleza es muy frecuente la existencia depolimorfismo:existen diversos alelos silvestres diferentes para un mismo locus.

alelos mutantes: las distintas "formas" (secuencias) que resultan de mutaciones del alelo silvestre.

Mutaciones espontáneas: son resultado de la actividad normal de la célula, o de sus interacciones con su medio natural. La mayoría aparecen por errores en los procesos de replicación, reparación o recombinación del ADN. (O sea, para abreviar, serían aquellas mutaciones no provocadas de forma experimental).

Mutaciones inducidas: aquellas provocadas por previa alteración experimental del ADN, bien sea directamente, o indirectamente, por agentes físicos o químicos denominados mutágenos.

2. MU TACIONES ESPONTÁNEAS.

Los principales tipos son:

Mutaciones puntuales: sustituciones de pares de bases. Pueden ser:

transiciones: suponen cambio de una pareja Pu:Py à Pu:Py;

transversiones: cambio de una pareja Pu:Py à Py:Pu.

Mutaciones por desplazamiento de la pauta (=fase o marco) de lectura ["frameshift"]. Se deben a:

eliminación de uno o un corto número de nucleótidos;
incorporación de uno o un corto número de nucleótidos.

Grandes delecciones (o borraduras).

Inversiones

Traslocaciones.

Duplicaciones en tándem

Mutaciones insercionales ocasionadas por elementos genéticos transponibles.

Los estudiaremos a continuación, insistiendo sobre todo en su base molecular.

2.1 MU TACIONES PUNTUALES

A:T ß à G:C

A:T ß à T.A

G:C ß à C:G

2.1.1 BA SE MOLECULAR DE LAS MUTACIONES PUNTUALES

Base molecular de las transiciones

forma tautomérica	Se comporta como
A* (imino)	G
G* (enol)	A
C* (imino)	T
T* (enol)	C

Por lo tanto, los emparejamientos propiciados por las formas tautoméricas serían:

A* : C

C* : A

T* : G

G* : T

Base molecular de las transversiones

(Modelo de Topal & Fresco:observen en el gráfico los emparejamientos de las formas sin y anti)
El modelo predice que la frecuencia de mutaciones puntuales en un par de bases dependerá de:

constante de equilibrio (k) de tautomerización del par de bases (unos 10^-4 - 10^-5);
frecuencia de dNTPs en forma sin. (G_sin aparece con frec. de 10^-1, A , con 5·10^-2).

De este modo, teóricamente deberían darse las siguientes frecuencias de mutaciones puntuales:

frec. prevista de transiciones: 10^-4 - 10^-5
frec. prevista de transversiones: 10^-5 - 10^-6 (para la G) y 5·10^-6 - 5·10^-7 (para la A)

Sin embargo, en la realidad, las frecuencias observadas son mucho más bajas (del orden de 10^-10). Esto implica que debe de existir un sistema que corrija los emparejamientos erróneos: como ya sabemos, las ADN polimerasas poseen una capacidad correctora de pruebas ("editing"): cada paso de elongación es seguido inmediatamente por una comprobación del emparejamiento. Si este emparejamiento es erróneo, la polimerasa usa su actividad exonucleasa 3'à 5' para elimininar la base mal emparejada, y a continuación vuelve a polimerizar en el mismo lugar (por su actividad polimerasa 5'à 3').
Ejemplo: Durante la replicación puede ocurrir que la citosina pase a su forma imino, que se empareja con la adenina:

C à C_imino : A (la A es incorporada por la ADN polimerasa)
Ahora la C_imino vuelve rápidamente a su forma normal, con lo que queda…
C : A (este emparejamiento anómalo es detectado por la polimerasa)
La actividad exonucleasa 3'à 5' elimina la A recién incorporada
Vuelve a intervenir la actividad polimerasa 5'à 3', que incorpora G
El resultado final es el emparejamiento correcto C à G

De esta forma, la tasa real de transiciones a partir de una C es aproximadamente equivalente al cuadrado de la correspondiente cte. (k) de tautomerización.
Parece ser que en la naturaleza existe una selección natural que propicia una frecuencia baja, pero no nula, de errores durante la replicación. El significado biológico es que de esta forma se combina una alta tasa de fidelidad en la replicación, pero con suficiente flexibilidad (oportunidad de errores) como para generar innovaciones sobre las que pueda actuar la presión selectiva, lo cual permite evolución.
Puntos calientes de mutación ("hot-spots"): son puntos o zonas dentro del genomio donde se concentran mutaciones con una frecuencia mayor que la esperada si se distribuyeran al azar.

Ejemplo: véase el histograma de frecuencias que muestra el número de mutaciones puntuales en las distintas pares de bases del gen lacI. Observar que hay una zona especialmente "caliente" cerca de la coordenada 200, donde la probabilidad de encontrar mutaciones es muy superior a la del resto de la secuencia.

Explicación: algunas bases, dentro de un determinado contexto de secuencia, son modificadas químicamente por acción de alguna enzima (normalmente una metilasa), y ello provoca una mayor susceptibilidad a la aparición de mutaciones puntuales:

La citosina (C), dentro del contexto de secuencia siguiente:

C C A G G

G G T C C

es metilada por una metilasa específica (que reconoce precisamente a esas dos citosinas dentro de esa secuencia), para dar 5-metilcitosina. La 5-metil citosina experimenta espontáneamente una desaminación oxidativa, que la convierte en timina, de manera que se produce finalmente una transición:
C:G à 5-metil-C:G à T:G (emparejamiento anómalo)à T:A

2.1.2 CO NSECUENCIAS POSIBLES DE UNA MUTACIÓN PUNTUAL

Si la mutación afecta a una región en 5' que actúa en cis:

Determinadas mutaciones puntuales en el promotor impiden que la ARN polimerasa se una a esta secuencia; entonces el promotor queda inactivado y no se produce la expresión de los genes del operón.

En otros casos los efectos son diferentes. Por ejemplo: se recordará que el promotor del operón lac tiene una secuencia -10 atípica, que obliga a que la expresión a alto nivel requiera el concurso de la proteína CAP activa. Pues bien, por medio de mutaciones puntuales se puede lograr que esa secuencia atípica adquiera las características de las secuencias -10 típicas (a base de TATA, o similar). En este caso, el efecto de estas mutaciones es que el operón lac se vuelve independiente de la proteína CAP para su expresión eficiente: el operón se hará independiente de la represión catabólica.

En los operones sometidos a control negativo, determinadas mutaciones en el operador provocan una menor afinidad de la proteína reguladora (del represor). El efecto es el de crear una expresión constitutiva (es decir, el operón se expresa incluso en presencia del represor activo, debido a que éste no reconoce al operador mutante).

Si la mutación afecta a una zona codificadora: se produce la alteración de un codón. Las consecuencias de la alteración pueden ser muy variadas:

Si la nueva tripleta (codón) codifica el mismo aa. que la antigua (debido a la sinonimia o "degeneración" del código genético, que afecta sobre todo a la tercera base del codón) se origina una mutación neutra, que es "silenciosa" (no hay ningún cambio en el fenotipo).
Si la nueva tripleta codifica un aa. diferente del original, tenemos varias posibilidades:

mutaciones de sentido erróneo o alterado ("missense"):

si el nuevo aa. es de un tipo químico similar al antiguo, puede cumplir una función semejante en la proteína mutante, por lo que el fenotipo sería también unamutación silenciosa por sustitución de aa.
En otros casos el nuevo aa. provoca una inestabilidad estructural, que puede reflejarse en que la proteína sea termosensible o criosensible, o más susceptible a efectores alostéricos. La proteína termosensible es funcional a temperaturas moderadas, pero se inactiva a temperaturas relativamente altas, a las cuales la correspondiente proteína silvestre es activa.La proteína criosensible es funcional a temperaturas moderadas, pero se inactiva a temperaturas relativamente bajas, a las cuales la proteína silvestre es activa. La proteína más susceptibles a efectores alostéricos es aquella que se inhibe por efectores de forma más acusada. En esta categoría entran también las proteínas con actividad residual.
Por otro lado, podemos encontrar proteínas que pierden su actividad biológicadebido a que la sustitución del aa. provoca la alteración de la estructura secundaria y terciaria de la proteína: por ejemplo, la aparición por mutación de una prolina en mitad de una a -hélice destruye esta estructura, y puede originar inactivación de la función.

La alteración del centro activo suele provocar inactivación total o parcial. NOTA: Aquí se plantea la siguiente pregunta: si la mutación inactiva totalmente la capacidad funcional de la proteína, ¿cómo podemos reconocer que esa proteína alterada está presente en la célula? La proteína se puede identificar por medio de anticuerpos (Ac) obtenidos frente a la proteína silvestre. Si ponemos en contacto estos Ac con un extracto de las células mutantes, se producirá una reacción antígeno-anticuerpo. Las proteínas inactivas caracterizadas de esta manera se suelen denominar como "CRM" iniciales de "cross-reactive material" (material que da reacción cruzada respecto de la proteína silvestre).

mutaciones "sin sentido" ("nonsense"), o sea, aquellas que cambian un codón original a una de las tres tripletas que significan "señal de parada" de la traducción:U A G (codón "ámbar"), U A A (codón "ocre"), U G A (codón "ópalo"). Obviamente, el efecto de estas mutaciones sin sentido es producir la detención de la lectura del ARNm por parte de los ribosomas. Por lo tanto se produce una proteína truncada, que suele ser inactiva.

Como ya vimos en el capítulo anterior, si la mutación sin sentido se produce en un gen de un operón policistrónico, y si esa mutación cae cerca de una zona del ARNm capaz de formar estructuras secundarias en horquilla, aparte del efecto de mutación sobre el gen afectado, se detectará unfenómeno de polaridad, debido a que el acoplamiento transcripción-traducción provoca la no transcripción de la región situada más allá (en sentido 3') de la zona de la horquilla. O sea, no habrá transcripción de los genes distales del operón.

2.2 MU TACIONES DE DESPLAZAMIENTO DE LA FASE (=DEL MARCO O PAUTA) DE LECTURA ["FRAMESHIFTS"]
Se pueden originar por pérdida o ganancia de un pequeño nº de nucleótidos (que no sea 3 o múltiplo de 3)
Base molecular: Suelen ocurrir en zonas del ADN con secuencias repetitivas. En este tipo de secuencias, durante la replicación o la recombinación, se pueden producir malos alineamientos por desplazamiento de una o varias copias de la secuencia repetitiva.

Ejemplo:

G T C C G T C C G T C C G T C C

C A G G C A G G C A G G C A C C

Se produce un cambio total en el sentido del mensaje genético, a partir del sitio de la mutación se sintetiza una proteína inactiva, a menudo truncada (debido a que al cambiar la pauta de lectura, pueden aparecer tripletas sin sentido).

Si la pérdida es de 3 nucleótidos (o múltiplo de 3), y la pequeña delección no afecta a una zona importante de la proteína, se puede producir un producto que aún tenga actividad biológica.

2.3 GR ANDES DELECCIONES (O BORRADURAS):

Suponen la eliminación de cientos e incluso miles de nucleótidos.

Base molecular: Formación de grandes bucles intracatenarios, con posterior escisión de dichos bucles. Normalmente en los extremos del material que se va a delecionar existen secuencias de ADN que son repeticiones directas una de otra, lo que facilita algún fenómeno de recombinación que lleva a la eliminación del material (bucle) intercalado entre esas secuencias.

Consecuencias: Mutación irreversible e inactivadora total de uno o varios genes.

2.4 INV ERSIONES:

Cambio de orientación de un segmento de ADN. En muchos casos se deben a emparejamiento y ulterir recombinación entre secuencias inversamente repetidas en los extremos del material que sufre la inversión.

Consecuencias: En muchos casos no hay consecuencias fenotípicas, ya que simplemente se ha invertido el orden de los genes del segmento invertido en relación al resto del genoma. A diferencia de las deleciones, las inversiones suelen revertir, precisamente por un nuevo proceso de recombinación entre las secuencias inversamente repetidas.

2.5 TR ANSLOCACIONES:

Traslado de un segmento a otro lugar del genomio.

2.6 DU PLICACIONES EN TÁNDEM

Se trata de la aparición de una copia de una zona de ADN a continuación de la localización del original. Suelen deberse al emparejamiento y recombinación entre secuencias similares en dos moléculas de ADN (en realidad, en este evento, de las dos moléculas de ADN, una se queda con una duplicación mientras que la otra se queda con una delección).

Si el segmento duplicado es grande y lleva varios genes, no suele conducir a inactivación génica (ya que aunque en la juntura de la duplicación puede haber una mezcla de dos genes truncados, sigue habiendo copias silvestres de dichos genes en el mutante).

Una de las propiedades más características de las duplicaciones en tándem es su inestabilidad, ya que revierten con gran frecuencia por nueva recombinación dentro del segmento duplicado.

A pesar de esto, las duplicaciones parecen haber jugado un papel importante en la evolución. Tras una duplicación que se haya estabilizado, hay dos copias de uno o varios genes, de modo que una de las copias de cada pareja puede lentamente ir evolucionando e incluso adquirir una nueva función.

2.7 MU TACIONES ORIGINADAS POR ELEMENTOS GENÉTICOS TRANSPONIBLES

La inserción de una secuencia de inserción (IS) o de un transposón (Tn) en de un gen origina lainactivación insercional, debida a:

desplazamientos de la pauta de lectura, que como antes indicamos, generan frecuentes señales de fin de traducción;

terminación de transcripción dependiente de Rho, con efectos polares (debido a que las IS llevan frecuentes señales de terminación compleja de la transcripción, dependiente der ).

Una vez que ha ocurrido una inserción de una IS o de un Tn, pueden producirse ulteriores delecciones secundarias de todo o de parte del elemento transponible, y a veces también delecciones del material genético adyacente (fenómenos de escisión imprecisa del IS o Tn).

Por otro lado, dadas dos secuencias IS del mismo tipo, situadas a cierta distancia una de la otra, por fenómenos de recombinación propiciados por dichas IS se pueden producir:

inversiones del material intercalado entre ambias copias del IS;

translocaciones del material intercalado entre esas secuencias de inserción.

3. CA RACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES

Para caracterizar genéticamente una mutación (es decir, para conocer qué tipo de mutación es) se recurre normalmente a pruebas de reversión de cada mutante.

Las mutaciones puntuales pueden revertir o ser suprimidas por una 2ª mutación (ver más adelante, en este mismo capítulo).
Igual ocurre con algunas mutaciones de desfase de la pauta de lectura.
Las inserciones sólo pueden revertir por una delección exacta del material insertado.
Las delecciones no pueden revertir.
Por otro lado, las mutaciones generadas por elementos genéticos transponibles no aumentan su frecuencia por tratamiento con agentes mutagénicos, mientras que el resto sí lo hacen.

4. DE MOSTRACIÓN DE LA ESPONTANEIDAD DE LAS MUTACIONES BACTERIANAS

Uno de los rasgos característicos de las mutaciones es su espontaneidad: surgen al azar, independientemente de las condiciones ambientales. El efecto del medio ambiente es seleccionar o no las mutaciones (es decir, favorecer o no el crecimiento diferencial del fenotipo mutante). De todas formas, más adelante veremos que el medio ambiente puede alterar la tasa global de aparación de mutaciones.

Durante mucho tiempo se estuvo discutiendo la posibilidad de que las bacterias tuvieran algún tipo de herencia lamarckiana de caracteres adquiridos (de hecho, hasta mediados del siglo XX muchos científicos pensaban que las bacterias seguían un tipo de herencia distinta a la de los organismos superiores, en la que las adaptaciones a cambios del medio se podían transmitir a la descendencia, al modo lamarckiano). Esta visión "antropomórfica" de un proceso de evolución "guiada" llevó a proponer que, por ejemplo, al poner un antibiótico (Ab) en un medio de cultivo, era el antibiótico el que "inducía" la aparición de mutaciones. Aparentemente, la observación apoyaba esta postura: si se colocaba un cultivo bacteriano sensible al antibiótico en presencia de ese antibiótico, al cabo de cierto tiempo, todas las células del cultivo son resistentes al antibiótico.

Todos estaban de acuerdo en que la mayoría de la población bacteriana inicial moría al exponerse al agente selectivo (el antibiótico en este ejemplo, o un fago en otros experimentos), y que el cultivo resistente final procedía del crecimiento de una pequeña proporción de células resistentes al agente. La disputa estribaba precisamente en cómo interpretar estos datos de observación. Veamos las posturas contrapuestas:

Hipótesis lamarckiana: cada célula del cultivo inicial tiene una probabilidad pequeña, pero finita, de sobrevivir al agente selectivo. Una vez que algunas células logran sobrevivir transmiten este rasgo a su descendencia.
Hipótesis darwiniana (denominada "de las mutaciones preexistentes"): ciertas bacterias del cultivo inicial son ya resistentes al agente antes de ser expuestas a él. El agente sólo actúa seleccionando las células resistentes y eliminando a las demás (sensibles).

La polémica fue ganada por los darwinianos ((por supuesto!), debido a unos elegantísimos y sencillos diseños experimentales:

El primer "golpe de gracia" lo dio la prueba de las fluctuaciones de Salvador Luria y Max Delbrück (1943): Si las mutaciones a la resistencia surgieran espontáneamente antes de exponer las bacterias al agente, entonces diversos cultivos en paralelo en medio líquido deberían de tener su primera mutación a tiempos distintos. Cuando recogiéramos los cultivos al final del tiempo del experimento y contáramos las bacterias resistentes, cada cultivo en paralelo debería dar números variables de resistentes. Veamos el experimento:

cultivo inicial de una bacteria sensible a la estreptomicina (Str^S).
Inoculamos muchos tubos en paralelo, con el mismo n1 de bacterias en cada uno; los tubos se incuban hasta la fase estacionaria,y se estudian al mismo tiempo final.

de (n-1) tubos sembrar alícuotas de 10⁹bacterias en placas+estreptomicina	del tubo restante, sembrar muchas alícuotas de 10⁹bact. en placas+estreptomicina
Recuento de colonias Str^R	recuento de colonias Str^R
Resultado:	resultado:
Amplias fluctuaciones de colonias derivadas de los distintos tubos:	números similares de colonias en las placas derivadas del mismo tubo:
30, 10, 40, 45, 183, 12, 173, 23, 173, 23, 57, 63	46, 56, 52, 48, 65, 44, 49, 51, 56, 48
Media (x) = 62	media (x) = 51,4
Varianza (v) = 3498	varianza (v) = 6,33

Razonamiento y conclusiones del experimento:

en ningún momento los cultivos líquidos estuvieron expuestos al antibiótico;
todos los cultivos crecieron en idénticas condiciones (tiempo, temperatura, etc.);

conclusión: las oscilaciones (fluctuaciones) entre diversos tubos se explican porque en cada uno de ellos debieron surgir mutaciónes espontáneamente a tiempos distintos, de modo que los tubos en los que el primer mutante apareció tempranamente generaron mayor número de colonias resistentes (cada colonia se establece por una célula descendiente de algún mutante inicial).

Poco más tarde, esta conclusión se afianzó con otro experimento "clásico": Prueba de la réplica en placa (Lederberg, 1952).

Supongamos una cepa silvestre de E. coli, que es sensible a la estreptomicina (Str^S).Sembramos masivamente (p. ej. 10⁸ células) en una placa matriz de un medio sin estreptomicina. Se incuba la placa en estufa a la temperatura adecuada (37^oC). Obtendremos un crecimiento que origina un césped continuo de bacterias (por crecimiento confluyente).
Se hace una réplica con un tampón estéril de terciopelo desde la placa matriz a una placa de medio con estreptomicina. Incubamos en estufa. Se observa que en esta placa ha habido un crecimiento de una o unas pocas colonias Str^R (cada colonia procede de una célula individual).
Ahora volvemos a la placa matriz (sin Str) y delimitamos la zona aproximada "gemela" de aquella que en la placa con Str ha dado la colonia Str^R. Cortamos un cuadradito de agar que incluya esa zona, y recuperamos las células (resuspendiendo en solución salina estéril).
A partir de esa suspensión inoculamos 10⁴ células en una nueva placa matriz sin Str, y dejamos que crezcan. Veremos una multitud de pequeñas colonias casi confluyentes.
Repetimos la réplica desde esta 2ª placa matriz a una nueva placa con Str. Tras incubar veremos un número de colonias Str^R mayor que en la 1ª réplica.
Volvemos a la 2ª placa matriz y repetimos la operación: escogemos un cuadradito que corresponda a una de las colonias de la placa de réplica, lo cortamos, resuspendemos las células y sembramos una 3ª placa matriz (sin Str), pero ahora el nº de bacterias que inoculamos es de unas 100. Incubamos esta placa matriz, y observaremos unas 100 colonias perfectamente separadas unas de otras.
Realizamos una 3ª réplica con el tampón de terciopelo a una 3ª placa con Str. Tras incubar obtenemos un número de colonias más elevado que en la 2ª réplica, y además, este número se aproxima al de las colonias de la placa matriz correspondiente.
Reiterando este proceso se logra finalmente que todas las colonias de la placa matriz se correspondan con las colonias de la placa de réplica correspondiente: es decir, al final, todas las células son Str^R.

Conclusión: Observen que en el experimento hemos realizado una selección indirecta de las bacterias Str^R: siempre vamos tomando células de la placa matriz (que no tiene presión selectiva del antibiótico) y las pasamos a una placa selectiva, donde sólo crecen los Str^R. La conclusión es clara: las pocas colonias mutantes Str^R detectadas en la 1ª placa de réplica procedieron de un mismo n1 de células Str^R que ya estaban presentes en la 1ª placa matriz, antes del contacto con el antibiótico. La reiteración del proceso de selección indirecta va "estrechando el cerco" a las células resistentes, de manera que al final logramos una placa matriz donde todas las células son resistentes, descendientes de la primera colonia Str^R que detectamos en la primera fase de réplica.

Pero después de todo ¿existen mutaciones adaptativas en bacterias?

A finales de los años 80 ciertos experimentos sugirieron la existencia de ciertas mutaciones que parecían ser adaptativas, surgiendo "después" de ser sometidas a determinadas condiciones de cultivo. Para tratar este polémico asunto, véase el documento sobre mutaciones adaptativas, que incluye un modelo reciente.

5. TA SA DE MUTACIÓN

En una población bacteriana se define la tasa de mutación (T) para un determinado fenotipo como la probabilidad de que una célula mute a ese fenotipo en un determinado intervalo de tiempo. Luria y Delbrück (1943) escogieron como intervalo de tiempo unitario el correspondiente a un ciclo celular (o sea, a una generación), que es el tiempo necesario para completar una ronda de división celular. Por lo tanto:

T = m / d, donde m es el nº de mutaciones surgidas en un tiempo t, y d es el nº de divisiones ocurridas en ese tiempo t.

Si expresamos d en función del número de células: T= m / (N-N₀)

NOTA 1: La tasa T de mutación espontánea es constante para cada división celular a distintas tasas de crecimiento

En la expresión anterior hay que introducir un factor de corrección, ya que en el momento de determinar el número de células (N), las bacterias se encuentran en distintas etapas del siguiente ciclo celular, de modo que el promedio real de divisiones es mayor que N en un factor equivalente a 1/ln 2. Resulta, entonces:

T= m·ln2 /(N-N₀) = 0,69·m / (N-N₀)

A pesar de lo sencillo de esta fórmula, el cálculo en la práctica de la tasa de mutación no es tan fácil como ésta parece dar a entender. Ello se debe a que el parámetro m mide el número de eventos de mutación en un lapso de tiempo, que no equivale al número de bacterias mutantes medidas. Por lo tanto, y a pesar de lo fácil que suele ser cuantificar el número de mutantes, en el experimento, en ese cantidad medida se incluyen los descendientes de eventos más o menos antiguos de mutación a lo largo de ese experimento. Para calcular m hay que recurrir a ciertos métodos estadísticos.

Por ejemplo, se puede combinar un experimento de tipo de Luria y Delbrück con la distribución de Poisson. Imaginemos que sembramos 20 tubos independientes con la misma cantidad inicial de bacterias sensibles a la estreptomicina e incubamos el mismo tiempo en las mismas condiciones, de modo que la N-N₀ sea 5.6X10⁸; imaginemos que en esa prueba de las fluctuaciones en 11 de los 20 tubos no han surgido mutantes resistentes al antibiótico. De acuerdo con la aproximación de Poisson a la distribución normal, la probabilidad de tener cero (0) mutaciones en un cultivo sería:

P₀ = m⁰·e^-m/0!

Aplicando esto a nuestro ejemplo:

P₀ = 11/20 = 1·e^-m/1

Y por lo tanto, podemos despejar y resolver el valor de m = -ln11/20 = 0.59. Ahora podemos calcular la tasa de mutación:

T = 0.6·0.59/5.6X10⁸ = 7.3·10^-9

NOTA2: Obsérvese que hemos definido la tasa de mutación respecto de un fenotipo. Esto significa que aquellos fenotipos que dependan de varios genes tendrán tasas de mutación superiores a las de aquellos que dependan de un solo gen. Por ejemplo, la tasa de mutación hacia auxotrofía para la histidina o el triptófano (cuya biosíntesis depende de varios genes) está en torno a 10^-7, mientras que la tasa de mutación a resistencia a estreptomicina (que, como se recordará, depende de la alteración del gen de la proteína ribosómica S12) es de sólo 10¹⁰ o 10¹¹.

6. RE VERSIBILIDAD DE LAS MUTACIONES BACTERIANAS

Las variaciones fenotípicas producidas por las mutaciones no-silenciosas son transmisibles a la descendencia. Es decir, una vez producido el cambio, éste es permanente, pero no necesariamente irreversible (como ya dijimos, solamente las grandes delecciones son irreversibles).

La reversibilidad de las mutaciones suele deberse a una segunda mutación que restaura el fenotipo original. Esta 2ª mutación puede ser de dos tipos principales, y varios subtipos:

Reversión (en sentido estricto), que restaura el genotipo original. Esto equivale a unaretromutación ("back-mutation").
Supresión: la 2ª mutación suprime los efectos de la 1ª pero no restaura el genotipo original. Por lo tanto, tras la mutación supresora, la célula queda con dos mutaciones. La supresión se clasifica a su vez en:
1. Supresión indirecta: no se corrige el producto del primer gen, pero la 2ª mutación anula las consecuencias fenotípicas. Ejemplos:
2. Supresión directa: la 2ª mutación corrige el producto del primer gen mutado. Puede ser de dos tipos principales:

6.1 BAS ES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTRAGÉNICAS

Introducción de un desfase de signo opuesto al de la primera mutación à restauración de la pauta de lectura alterada por una previa mutación de desfase de lectura ("frameshift"). La única zona alterada tras la mutación supresora sería la que queda entre ella y la 10 mutación. Si esta zona es corta y no es esencial para la actividad biológica, se puede restablecer el fenotipo primitivo.
Supresiones en el mismo codón que quedó afectado por la 1ª mutación, de modo que se codifica un aminoácido distinto del silvestre y distinto del aa. del primer mutante, pero que restaura la funcionalidad de la proteína. A este tipo de supresión se la denomina tambiénpseudorreversión.
Mutación puntual compensatoria en un sitio distante respecto de la primera mutación: la 2ª mutación compensa a la 1ª, de modo que se restaura la estructura tridimensional y/o el centro activo de la proteína.

6.2 BAS ES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTERGÉNICAS

Por ARNt mutantes (= ARNt supresores)
1. supresores de mutaciones que introducen codones de parada de lectura (o sea, de codones "sin sentido, nonsense"): son ARNt mutados en el anticodón, de modo que este anticodón mutado puede emparejarse con alguno de los tres tipos de codones "sin sentido", insertando ahora los aa. correspondientes que transportan; por lo tanto, impiden la terminación prematura de la traducción. Ejemplos: El codón sin sentido UAG ("ámbar") puede ser suprimido por versiones mutantes (supresoras) de los siguientes ARNt:
2. El codón sin sentido U A A ("ocre") puede ser suprimido por una versión mutante de ARNt^GlyGAA
3. Existen supresores más raros que suprimen mutaciones de sentido erróneo ("missense"): Ejemplo: El ARNt^Gly cuyo anticodón es UCU, por mutación se convierte en un ARNt supresor cuyo anticodón es UCC, que entonces reconoce al codón AGA (de la Arg). Por lo tanto, este supresor inserta Gly frente a cada codón AGA.
4. supresores de desfases de lectura de +1 nucleótido: son ARNt mutantes que tienen un anticodón con 4 nucleótidos, en lugar de los 3 habituales.Ejemplo: Existe un ARNt^Pheque tiene un anticodón que reconoce la secuencia UUUC.
Por proteínas ribosómicas mutantes: Los ribosomas derivados de la alteración por mutación de determinadas proteínas adquieren zonas de conformación cambiada, de modo que reconocen tripletas de forma errónea. Al introducir aminoácidos cambiados en codones que a su vez proceden de mutaciones, pueden restaurar la funcionalidad de algunas proteínas mutantes.Ejemplos:
1. mutaciones ram, que afectan a las proteínas S4 y S5 de la subunidad 30S del ribosoma, de modo que éste puede suprimir una gran variedad de mutaciones sin sentido y por desfases. (El nombre de ram corresponde a las iniciales de ribosomas ambiguos).
2. Mutaciones Str^R: tienen afectada la proteína S12 del ribosoma. Hacen que las mutaciones sin sentido sean menos defectuosas ("leaky" = débiles).

6.3 EFI CACIA DE LAS MUTACIONES SUPRESORAS POR ARNt MUTANTES

Cada supresor tiene una eficacia característica de supresión, que se refleja en la proporción de cadenas polipeptídicas mutantes que son terminadas de forma normal (en lugar de quedarse truncadas). Esta eficacia depende, esencialmente de:

la concentración del ARNt supresor en la célula;

afinidad del ARNt supresor hacia la aminoacil-ARNt-sintetasa;

afinidad del aa-ARNt por el ribosoma, en competencia con los factores de terminación de traducción que reconocen el mismo codón "sin sentido" (de parada de lectura).

La mutación supresora, por sí misma disminuye la velocidad de crecimiento de la bacteria, debido a que, aparte de sucapacidad supresora, introduce errores de lectura en los ARNm normales.

Los supresores han de ser, por fuerza, poco eficientes, como para no hacer que la célula muera por introducción de demasiados errores en la lectura de los ARNm normales (es decir, la mayor parte de las veces, los supresores introducen el aminoácido correcto). Pero por otro lado, han de ser suficientemente eficicientes como para poder introducir aminoácidos en codones mutantes con la frecuencia adecuada para suprimir la mutación primaria. Normalmente, los supresores típicos suprimen 5-10% de las veces. Es decir, la mayoría de las veces se introduce el aa. correcto frente al codón correcto.

7. AG ENTES MUTAGÉNICOS E INDUCCIÓN DE MUTACIONES

Anteriormente comentamos que el medio ambiente no induce mutaciones concretas (p. ej., el antibiótico no provoca la aparición de los mutantes resistentes). Ahora bien, lo que sí pueden hacer determinadas condiciones ambientales es elevar la tasa global de aparición de mutaciones.

Determinados agentes ambientales físicos o químicos pueden dañar el ADN o interferir con la maquinaria replicativa, de modo que provocan una mayor frecuencia de aparición de mutaciones (y en este sentido hablamos de "mutaciones inducidas"). A dichos agentes se les llama mutágenos o agentes mutagénicos. Así pues, en última instancia, los mutágenos causan alguna alteración en el ADN que

bien no puede ser reparada convenientemente,
o bien es un daño tan extenso que sobrepasa la capacidad de los mecanismos celulares normales de reparación (consultar el tema de "Mecanismos de Reparación de los daños al ADN").

AG ENTES FÍSICOS

RADIACIÓN UV

Es el mutágeno físico más empleado en el laboratorio para obtener mutaciones en las bacterias. Como ya estudiamos en su momento, su efecto principal es originar dímeros de pirimidina intracatenarios (con creación de una anillo ciclobutano entre dos Py consecutivas). Las proporciones de lesiones son las siguientes:

50% T-T
40% T-C
10% C-C

Las mutaciones aparecen principalmente como consecuencia del mecanismo posreplicativo de reparación propenso a error (o sea, el sistema SOS). Con menor frecuencia la luz UV ocasiona hidratación de la C, lo que da origen a transiciones.

RAYOS X Y RADIACIONES IONIZANTES

Tienen mayor poder de penetración que los rayos UV, pero son de difícil manejo, por lo que se emplean poco en bacterias. Los rayos X ocasionan daños reparables por el sistema SOS.

Las radiaciones ionizantes (p. ej., rayos g ) provocan labilizaciones en el ADN, que terminan en roturas en las hebras del ADN (por ataque al enlace fosfodiéster), que finalmente pueden conducir a delecciones.

AG ENTES QUÍMICOS

Se pueden agrupar en varias categorías:

Análogos de bases, que se incorporan durante la replicación del ADN.
Agentes hidroxilantes o desaminantes de las bases nitrogenadas.
Agentes alquilantes.
Agentes intercalantes, que se introducen en la doble hélice del ADN, entre pares de bases consecutivas.
Bloqueadores del emparejamiento de las bases.

ANÁLOGOS DE BASES

Son sustancias con una estructura en anillo similar a las bases naturales de los ácidos nucleicos, pero con propiedades químicas diferentes. Como ejemplos tenemos:

5-bromouracilo (5-BrU)
2-aminopurina (2AP).

Estas moléculas entran a las células y son convertidas a los correspondientes "dNTP", de modo que su estructura les permite ser incorporados durante la replicación del ADN.

1) El 5-BrU es análogo de la T. Propicia transiciones T:A à G:C debido a que experimenta frecuentes cambios tautoméricos desde su forma ceto a su forma enol:

BU_ceto:Aà BU_enol:G

Si partimos de una pareja A=T y en la 1ª ronda de replicación la ADN-polimerasa introducen un BU_ceto frente a la adenina, los acontecimientos hasta llegar a la mutación se pueden resumir así:

A:T à (la primera replicación incorpora BU) à A:BU_ceto à (tautomerización y 2ª replicación) à G:BU_enol à (3ª replicación) à G:C

2) La 2-AP es un análogo de la A. Provoca transiciones A:Tà C:G debido a sus frecuentes tautomerizaciones (AP_amino à AP_imino). Veamos el proceso:

A:T à (primera replicación) à AP_amino:T à (tautemerización y 2ª replicación) à AP_imino:Cà (3ª replicación) à G:C

AGENTES DESAMINANTES O HIDROXILANTES

Alteran las Pu o las Py, de modo que:

causan errores en el emparejamiento, o bien
labilizan las bases, de modo que éstas espontáneamente se modifican químicamente con gran frecuencia.

1) Ácido nitroso: provoca una desaminación oxidativa de A y C, lo que origina transiciones

sobre C à dU, que se empareja con la A.

sobre A (6-aminopurina) à hipoxantina (HX) (6-oxopurina), que en su forma ceto se empareja con la citosina:

A:T à HX_ceto:C à G:C

El nitroso también desamina oxidativamente a la G, pero en este caso no hay mutación:

G à xantina, que al igual que la G, se empareja con la C.

2) Hidroxilamina (NH₂OH): actúa específicamente sobre la citosina, añadiéndole un hidroxilo a su grupo -NH₂:

AGENTES ALQUILANTES

Introducen radicales alquílicos en una cadena (los alquilantes monofuncionales) o en las dos cadenas (los bifuncionales) del ADN, produciendo efectos letales y mutagénicos.

Los efectos letales fueron estudiados en el capítulo 19 ("Acción de los agentes químicos").
Los efectos mutagénicos dependen sobre todo de la reacción con el O⁶ de la G.

Algunos agentes alquilantes empleados en laboratorio:

gas mostaza: mostazas nitrogenadas y sulfuradas, como por ejemplo:
Cl-CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂-Cl : di-(2-cloroetil)-sulfuro.
etil-etano-sulfonato (EES): CH₃-CH₂-SO₂-O-CH₂-CH₃
etil-metano-sulfonato (EMS): CH₃-SO₂-O-CH₂-CH₃
nitrosoguanidina (NTG), que es la N-metil, N'-nitro, N-nitrosoguanidina:

Todos estos agentes, excepto la NTG, actúan tanto in vivo como in vitro. La NTG sólo actúa in vivo, ya que su efecto lo ejerce sobre la horquilla de replicación del ADN. La NTG es uno de los mutágenos más potentes que se conocen, pero es un agente "sucio", en el sentido de que genera varias mutaciones en la misma célula. Induce reparación SOS propensa a error, dando origen a transiciones, transversiones y desfases del marco original del lectura.

Como hemos dicho, estos agentes originan un daño premutagénico principal consistente en alquilación del O⁶ de la G. Ello provoca una gran distorsión en la doble hélice, que posteriormente se plasma en transiciones del tipo G:C à A:T.

Sin embargo, muchas bacterias poseen un sistema específico para reparar las lesiones de la O⁶-alquil-guanina, que funciona de la siguiente manera:

La bacteria posee una O⁶-alquil-glucosilasa, que rompe el enlace N-glucosídico entre la O⁶-alquil-guanina y la desoxirribosa. Esto provoca la creación de un sitio apurínico(sitio AP).
El sitio AP es reconocido por una endonucleasa correctora (apurinasa), que rompe el enlace fosfodiéster del lado 5' del sitio apurínico.
Se produce una reparación por escisión-resíntesis de un pequeño n1 de nucleótidos, pero si el daño es muy grande se produce una situación SOS que tiende a ser reparada por el sistema propenso a error ya estudiado, lo que provoca introducción de errores, que conducen a transiciones y transversiones.

SUSTANCIAS INTERCALANTES

Se introducen entre los pares de bases del ADN, dando origen a pérdida o ganancia de nucleótidos (o sea, generan mutaciones de cambio de la pauta de lectura del mensaje genético).

Estas sustancias son moléculas planares con 3 o 4 anillos conjugados, que presentan un cierto parecido con los pares de bases del ADN, pero no se pueden incorporar covalentemente al esqueleto de éste, sino que se intercalan entre dos pares de bases consecutivas, con lo que provocan distorsiones de la doble hélice.

Algunos ejemplos:

derivados de la acridina, como el naranja de acridina
bromuro de etidio (ver nota)
derivados de la flavina (como la proflavina).

Estabilizan emparejamientos erróneos durante la replicación y la recombinación del ADN, dando origen a desplazamientos de la pauta de lectura.

Aplicaciones: Algunos se están ensayando en cuanto a su capacidad de inhibir tumores cancerígenos, o como antivirásicos, o contra el protozoo causante de la malaria.

AGENTES QUE BLOQUEAN TOTALMENTE EL EMPAREJAMIENTO DE BASES

Este grupo incluye potentes carcinógenos como:

benzo-a-pireno
aflatoxina-B₁.

Modifican purinas, provocando grandes lesiones en el ADN, que inducen el sistema SOS de reparación, lo que finalmente implica reparación propensa a error.

8. LAS BACTERIAS COMO INDICADORAS DE SUSTANCIAS MUTAGÉNICAS Y POTENCIALMENTE CARCINOGÉNICAS

Uno de los más claros indicios de que el cáncer surge a menudo como consecuencia de fenómenos mutagénicos es que la mayoría de los carcinógenos son también mutágenos.

Ames y sus colaboradores desarrollaron, a finales de los años 70, una prueba rápida, sencilla y económica por la que se pueden ensayar compuestos como posibles carcinógenos. Su base consiste precisamente en ver si son mutágenos frente a bacterias (es decir, se comprueba si tras el tratamiento de un cultivo bacteriano con la sustancia en cuestión, aumenta la tasa de aparición de mutantes.

TEST DE AMES:

Usa una serie de cepas his^- de Salmonella typhimurium, muy bien caracterizadas a nivel genético-molecular.

Una suspensión de la bacteria se siembra masivamente (unas 10⁸) en placas Petri que llevan un medio mímino (MM) -por lo tanto, sin aminoácidos- .
A continuación, en el centro de la placa se coloca un pequeño disco de papel de filtro impregnado con la sustancia que se desea ensayar. Acto seguido, las placas se incuban en estufa a la temperatura óptima de crecimiento de la bacteria (37^oC).
Las placas se sacan de la estufa (a las 24 h., por ejemplo) y se cuentan las colonias surgidas en cada placa, comparándolas con las colonias de una placa control que no llevaba la sustancia. Las colonias habrán surgido por el crecimiento de bacterias que hayan experimentado reversiones (=retromutaciones). Cada reversión en el alelo originalhis^-- restituye el fenotipo silvestre His⁺, y por lo tanto capacita a la bacteria a crecer y dividirse en el medio mínimo.

Si la prueba da resultado positivo (o sea, la sustancia induce altas tasas de mutación sobre la bacteria), es muy probable que el compuesto ensayado sea también carcinógeno, por lo que habrá que continuar estudiándolo a estos niveles. (El 90% de los compuestos que dan positivo en el Test de Ames se ha demostrado que son carcinógenos).

Ulteriores mejoras en el test de Ames:

En los últimos años esta prueba ha sido modificada para mejorarla o adaptarla a situaciones especiales. Veamos algunas de estas modificaciones:

uso de cepas de Salmonella defectivas en reparación (uvrA^--, uvrB^--, uvrC^--, etc). En estas cepas, cualquier daño al ADN no puede ser corregido con total eficiencia. Esto hace que estas cepas sean más sensibles frente a sustancias con menor potencial carcinogénico.
Muchos agentes son mutágenos en humanos sólo tras su "activación" metabólica por el hígado, pero son inactivas por sí mismas. Para detectar a estas sustancias, el test de Ames puede modificarse incorporando un extracto microsomal estéril (fracción libre de células de hígado animal o de cultivos de tejidos). El extracto microsomal posee oxigenasas que originan epóxidos a partir de la sustancia a ensayar, y a su vez son estos derivados de tipo epóxido los que verifican la acción mutagénica.
Algunas sustancias a ensayar no entran eficientemente a la bacteria debido al efecto de barrera de la membrana externa de la pared celular. Para solventar esto, se recurre a emplear mutantes LPS^-- de Salmonella (o sea, mutantes alterados en el lipopolisacárido, LPS), que facilitan la entrada de moléculas hidrofóbicas.

9. ALG UNOS MUTANTES BACTERIANOS EMPLEADOS EN LABORATORIO

9.1 ALG UNOS CONCEPTOS BASICOS

En este apartado pretendemos realizar una sencilla sinopsis de algunos tipos de mutaciones que se utilizan con frecuencia en los laboratorios de investigación. Previamente repasaremos algunos conceptos y términos que son igualmente de uso común en muchos estudios de genética:

Dependiendo de que la mutación genética se manifieste o no a nivel fenotípico, y según el grado de afectación fenotípica, podemos clasificar las mutaciones de la siguiente manera:

mutaciones silenciosas (o neutras), si no hay efecto fenotípico;
mutaciones que implican alteración del fenotipo silvestre:

letales: si ocasionan la muerte o pérdida de viabilidad del microorganismo;
condicionalmente letales: si bajo determinadas condiciones el mutante pierde la viabilidad, pero bajo otras la mantiene.
mutaciones de alteración fenotípica que suponen la pérdida o la merma de alguna función que no sea esencial para la viabilidad del organismo. Dentro de ellos están los mutantes condicionales (su fenotipo alterado se manifiesta en determinadas circunstancias).

Las mutaciones condicionales (incluidas las condicionalmente letales) son muy útiles para estudiar aquellos genes esenciales para la bacteria. En estos mutantes hay que distinguir dos tipos de condiciones:

condiciones restrictivas (también llamadas no-permisivas): son aquellas condiciones ambientales bajo las cuales el mutante pierde la viabilidad, o su fenotipo se ve alterado, debido a que el producto afectado por la mutación pierde su actividad biológica.
condiciones permisivas: son aquellas bajo las cuales el producto del gen mutado es aún funcional.

Algunos ejemplos de mutantes condicionales muy empleados en genética:

mutantes sensibles al calor (termosensibles). Se suelen denominar con las siglas ts. El producto del gen mutado es más sensible al calor que el producto silvestre
mutantes de biosíntesis sensible al calor;
mutantes sensibles al frío (criosensibles)
mutantes sensibles a efectores alostéricos
mutantes suprimibles por supresores extragénicos (por ejemplo, por ARNt supresores, mutantes);
mutantes dependientes de estreptomicina (consultar "antibióticos aminoglucósidos", del cap. 20);
mutantes estabilizados osmóticamente (sólo son estables en altas concentraciones de sales).

En principio, y "por definición", es imposible obtener mutantes letales estrictos de genes esenciales para la viabilidad de la bacteria (p. ej., en genes de la ADN-polimerasa, ARN-polimerasa, ADN-ligasa, etc.), pero sí es posible conseguir mutantes condicionalmente letales, especialmente los termosensibles. Por ejemplo, si tras un tratamiento mutagénico sembramos células de Escherichia coli en placas y las cultivamos a 30ºC, y luego hacemos réplicas en placas que se incuban a 42ºC, las colonias "ausentes" en estas últimas nos señalan correspondientes colonias de la placa matriz candidatas a mutantes termosensibles.

Otro tipo de mutantes condicionales muy empleados en bacterias son aquellos con mutaciones sin sentido. Como se recordará, cuando el ribosoma llega al codón sin sentido, se detiene la traducción ulterior. Sin embargo, si esa bacteria tiene simultáneamente una segunda mutación de tipo supresor extragénico, a saber, un ARNt mutante adecuado, se puede restablecer el fenotipo silvestre (al menos parcialmente).

9.2 TIPO S Y EJEMPLOS DE MUTANTES EMPLEADOS EN LABORATORIO

MUTACIONES QUE AFECTAN A RASGOS MORFOLÓGICOS DE LAS COLONIAS:

Los rasgos culturales de las bacterias son muy fáciles de ver en los cultivos en placas de Petri, por lo que igualmente es fácil detectar cambios en los aspectos de las colonias que pudieran deberse a mutaciones. Antes de nada, vamos a describir brevemente tres tipos de colonias que pueden darse en una misma especie:

colonias S (lisas): son circulares, de borde liso o continuo; convexas obtusas (plano-convexas); superficie lisa y brillante; se dispersan fácilmente en agua, dando suspensiones homogéneas.
colonias M (mucosas): son parecidas a las S, pero son convexas más agudas; textura mucosa (al cogerlas con asa de siembra, se arrastra un "moco").
colonias R (rugosas): a menudo presentan un borde ondulado o festoneado; son planas; textura rugosa, y aspecto mate (no brillante); no se dispersan bien en agua, dando grumos más o menos gruesos.

Pues bien, en muchas especies bacterianas se pueden estudiar fenómenos de disociación de tipos de colonias en cultivos, debido a mutaciones que alteran moléculas de las envueltas (p. ej., de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas, de la cápsula, etc.). Veamos algunos ejemplos:

En algunas bacterias se puede observar una disociación M à S, que se suele deber a la pérdida de la capacidad de sintetizar cápsula.
En algunas bacterias Gram-positivas la disociación S à R se debe a pérdida de la cápsula.
En bacterias Gram-negativas, las disociación S à R se debe a menudo a la pérdida de la capacidad de sintetizar las cadenas laterales polisacarídicas del LPS (antígeno somático "O").

Muchas de estas disociaciones tienen bastante interés clínico, ya que en bacterias patógenas, el fenotipo mutado (sobre todo el rugoso) implica la pérdida de propiedades de virulencia y de especificidad antigénica.

MUTACIONES QUE AFECTAN A REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
En estudios de genética bacteriana (p. ej., a la hora de elaborar mapas genéticos), es muy habitual recurrir al empleo de mutantes auxotróficos (es decir, mutantes afectados en algún gen de alguna ruta biosintética -de aminoácidos, bases nitrogenadas, vitaminas-). Por supuesto, estos mutantes presentan interés por sí mismos, ya que su estudio permite "diseccionar" la base genética de las vías metabólicas.
Veamos a continuación un par de maneras de aislar y seleccionar mutantantes bacterianos auxotrofos:
1) Aislamiento de auxotrofos (sin enriquecimiento):cultivo original à tratar con mutágeno à lavarà siembra placas de medio mínimo (MM)+ suplementos nutricionales à réplica a MM
Se comparan las colonias de la placa-matriz (medio con suplementos nutricionales) con las colonias que hayan aparecido en la placa de réplica (carente de suplementos). La ausencia de colonia en la placa de réplica en una posición en la que existe colonia en la placa-matriz incica que la colonia de la placa matriz que no tiene "gemela" en la réplica es un mutante auxotrófico.
Una vez que sabemos que una colonia es un mutante auxotrófico, hay que determinar qué requerimiento nutricional le hace falta (es decir, qué compuesto o compuestos no puede sintetizar debido a la mutación). Para ello se realiza una sencilla prueba en placas de Petri, denominada auxonograma.
Sin embargo, aun cuando tratemos a un cultivo con un agente mutagénico, la frecuencia de aparición de un determinado fenotipo mutante es relativamente baja. Esto significa que en el experimento anterior, tendríamos que sembrar y replicar numerosas placas con grandes números de colonias, con objeto de alcanzar el umbral de probabilidad para detectar mutaciones auxotróficas. Para solventar este inconveniente, se suele recurrir a una modificación del método anterior basada en enriquecer en mutantes auxotrofos el cultivo tratado con el mutágeno:
2) Enriquecimiento por penicilina para el aislamiento de mutantes auxotróficos (resumen de un protocolo):
cultivo original (bacteria silvestre, prototrofa)
tratamiento con el mutágeno
mezcla de bacterias muertas (p. ej., el 90% del cultivo inicial) y
bacterias vivas, entre ellas unos pocos mutantes de diversos tipos
el cultivo se transfiere a un medio líquido rico,
para permitir la recuperación y la expresión fenotípica (lag fenotípico)
incubar unas cuantas horas
el cultivo se lava y se pasa a un medio líquido mínimo
añadir penicilina e incubar
la penicilina mata a los prototrofos, pero los auxotrofos no mueren, porque no crecen en MM (muerte selectiva de los parentales prototrofos)

plaquear en medio sólido rico
hacer réplica a medio sólido mímino
identificar los auxotrofos (no crecen en MM)
recuperar los auxotrofos de las placas de medio rico, y caracterizarlos (hacer auxonograma)

MUTANTES RESISTENTES A DROGAS Y A FAGOS

Los mutantes resistentes a antibióticos surgen por varios tipos de mecanismos, entre los que se encuentran:

alteración de algún gen que codifica una diana (sitio de unión) del antibiótico;
alteración de algún gen responsable de permeabilidad al antibiótico.

Los mutantes resistentes a fagos surgen esencialmente por alteración de receptores de la superficie celular, sobre los que se adsorben los fagos.

Ambos tipos de mutantes son de muy amplio uso para "marcar" cepas bacterianas en experimentos de genética (especialmente los que implican algún proceso de transferencia de material genético desde una estirpe donadora a otra receptora). Estos marcadores genéticos permiten seleccionar directamente la cepa que los porte añadiendo al medio de cultivo el correspondiente agente selectivo (antibiótico o fago), que obviamente mata o inhibe el crecimiento de las cepas sensibles.

MUTANTES AFECTADOS EN EL USO DE AZÚCARES U OTRAS FUENTES DE C Y ENERGÍA

Estos mutantes pierden la capacidad de metabolizar determinados sustratos, pero pueden recurrir a otros alternativos. Para aislar estos mutantes se puede recurrir en muchos casos al uso de medios diferenciales que incorporan indicadores de pH, que cambian de color en función del uso o no del sustrato en cuestión.

Por ejemplo: si quisiéramos aislar mutantes Lac^-- de E. coli, sembraríamos en Agar Mac Conckey. Los mutantes Lac^-- dan colonias transparentes, mientras que el fenotipo silvestre Lac⁺ da colonias rojas opacas con un precipitado alrededor de sales biliares (recordar el uso de este medio en las prácticas).

10. VAR IACIONES BACTERIANAS POR CURACIÓN DE PLÁSMIDOS

Como ya sabemos, los plásmidos son material genético extracromosómico que se replican independientemente del cromosoma (replicones autónomos), y que no son indispensables para la viabilidad de la bacteria que los posee. Hay plásmidos crípticos que no dan ningún fenotipo detectable (función desconocida), pero existen muchos plásmidos que codifican funciones como resistencia a antibióticos o a metales pesados, virulencia a plantas o animales, capacidad de fijar nitrógeno atmosférico, etc.

Como es lógico, el material genético plasmídico es susceptible de experimentar mutaciones. Pero la posesión de plásmidos por muchas bacterias puede condicionar otro tipo de variaciones genotípicas heredables: la curación, consistente en la pérdida del plásmido, lo que acarrea obviamente la pérdida concomitante de las funciones y fenotipos codificado por aquel, sin que se afecte la viabilidad de la bacteria.

Métodos de curación de plásmidos:

Sometimiento del cultivo bacteriano a altas temperaturas (cercanas a la temperatura máxima);
Tratamiento del cultivo con agentes químicos que se intercalan en el ADN, interfiriendo con la replicación, estabilidad o reparto del plásmido a las células hijas (bromuro de etido, naranja de acridina, etc.).

Tipo de ARNt supresor	Normalmente reconoce a
ARNt^Ser	UCG
ARNt^{G ln}	CAG
ARNt^Tyr	UC
ARNt^Lys	AAG

Páginas

sábado, 26 de marzo de 2016

Estudios de la microbiología

REGULACIÓN GENÉTICA

3. REGULACIÓN GENÉTICA A NIVEL DE TRADUCCIÓN

3.1. REGULACIÓN DE LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS RIBOSÓMICAS

3.2. REGULACIÓN DE LA TRADUCCIÓN POR MEDIO DE ARN ANTISENTIDO

4. REGULACIÓN POSTRADUCCIONAL

4.1. REGULACIÓN POR DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS

4.2. MODIFICACIÓN QUÍMICA DE ENZIMAS

5. SISTEMAS DE REGULACIÓN DE DOS COMPONENTES: SENSORES Y REGULADORES DE RESPUESTA

6. MECANISMOS REGULATORIOS GLOBALES

6.1. El regulón de operones SOS:

6.2. Respuesta al choque por calor ("heat-shock")

6.3. La regulación de la síntesis de ARNr y ARNt

6.3.1. Respuesta estricta

6.3.2. Regulación por la tasa del crecimiento

VARIACIONES HEREDITARIAS NO ASOCIADAS CON TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO. MUTACIÓN. SUPRESIÓN

VARIACIONES BACTERIANAS ASOCIADAS A CAMBIOS EN EL GENOTIPO

1. INTRODUCCIÓN A LAS VARIACIONES HEREDITARIAS NO ASOCIADAS A TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO

Definiciones iniciales:

2. MUTACIONES ESPONTÁNEAS.

2.1 MUTACIONES PUNTUALES

2.1.1 BASE MOLECULAR DE LAS MUTACIONES PUNTUALES

Base molecular de las transiciones

2.1.2 CONSECUENCIAS POSIBLES DE UNA MUTACIÓN PUNTUAL

2.2 MUTACIONES DE DESPLAZAMIENTO DE LA FASE (=DEL MARCO O PAUTA) DE LECTURA ["FRAMESHIFTS"]

2.3 GRANDES DELECCIONES (O BORRADURAS):

2.4 INVERSIONES:

2.5 TRANSLOCACIONES:

2.6 DUPLICACIONES EN TÁNDEM

2.7 MUTACIONES ORIGINADAS POR ELEMENTOS GENÉTICOS TRANSPONIBLES

3. CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES

4. DEMOSTRACIÓN DE LA ESPONTANEIDAD DE LAS MUTACIONES BACTERIANAS

Pero después de todo ¿existen mutaciones adaptativas en bacterias?

5. TASA DE MUTACIÓN

6. REVERSIBILIDAD DE LAS MUTACIONES BACTERIANAS

6.1 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTRAGÉNICAS

6.2 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTERGÉNICAS

6.3 EFICACIA DE LAS MUTACIONES SUPRESORAS POR ARNt MUTANTES

7. AGENTES MUTAGÉNICOS E INDUCCIÓN DE MUTACIONES

AGENTES FÍSICOS

RADIACIÓN UV

RAYOS X Y RADIACIONES IONIZANTES

AGENTES QUÍMICOS

ANÁLOGOS DE BASES

AGENTES DESAMINANTES O HIDROXILANTES

AGENTES ALQUILANTES

SUSTANCIAS INTERCALANTES

AGENTES QUE BLOQUEAN TOTALMENTE EL EMPAREJAMIENTO DE BASES

8. LAS BACTERIAS COMO INDICADORAS DE SUSTANCIAS MUTAGÉNICAS Y POTENCIALMENTE CARCINOGÉNICAS

9. ALGUNOS MUTANTES BACTERIANOS EMPLEADOS EN LABORATORIO

9.1 ALGUNOS CONCEPTOS BASICOS

9.2 TIPOS Y EJEMPLOS DE MUTANTES EMPLEADOS EN LABORATORIO

MUTACIONES QUE AFECTAN A RASGOS MORFOLÓGICOS DE LAS COLONIAS:

MUTACIONES QUE AFECTAN A REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

MUTANTES RESISTENTES A DROGAS Y A FAGOS

MUTANTES AFECTADOS EN EL USO DE AZÚCARES U OTRAS FUENTES DE C Y ENERGÍA

10. VARIACIONES BACTERIANAS POR CURACIÓN DE PLÁSMIDOS

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2. MU TACIONES ESPONTÁNEAS.

2.1 MU TACIONES PUNTUALES

2.1.1 BA SE MOLECULAR DE LAS MUTACIONES PUNTUALES

2.1.2 CO NSECUENCIAS POSIBLES DE UNA MUTACIÓN PUNTUAL

2.2 MU TACIONES DE DESPLAZAMIENTO DE LA FASE (=DEL MARCO O PAUTA) DE LECTURA ["FRAMESHIFTS"]

2.3 GR ANDES DELECCIONES (O BORRADURAS):

2.4 INV ERSIONES:

2.5 TR ANSLOCACIONES:

2.6 DU PLICACIONES EN TÁNDEM

2.7 MU TACIONES ORIGINADAS POR ELEMENTOS GENÉTICOS TRANSPONIBLES

3. CA RACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES

4. DE MOSTRACIÓN DE LA ESPONTANEIDAD DE LAS MUTACIONES BACTERIANAS

5. TA SA DE MUTACIÓN

6. RE VERSIBILIDAD DE LAS MUTACIONES BACTERIANAS

6.1 BAS ES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTRAGÉNICAS

6.2 BAS ES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTERGÉNICAS

6.3 EFI CACIA DE LAS MUTACIONES SUPRESORAS POR ARNt MUTANTES

7. AG ENTES MUTAGÉNICOS E INDUCCIÓN DE MUTACIONES

AG ENTES FÍSICOS

AG ENTES QUÍMICOS

9. ALG UNOS MUTANTES BACTERIANOS EMPLEADOS EN LABORATORIO

9.1 ALG UNOS CONCEPTOS BASICOS

9.2 TIPO S Y EJEMPLOS DE MUTANTES EMPLEADOS EN LABORATORIO

10. VAR IACIONES BACTERIANAS POR CURACIÓN DE PLÁSMIDOS