Estudios de la microbiología

 INTRODUCCIÓN AL CONCEPTO Y CONTENIDO DE LA MICROBIOLOGÍA

La Microbiología se puede definir, sobre la base de su etimología, como la ciencia que trata de los seres vivos muy pequeños, concretamente de aquellos cuyo tamaño se encuentra por debajo del poder resolutivo del ojo humano. Esto hace que el objeto de esta disciplina venga determinado por la metodología apropiada para poner en evidencia, y poder estudiar, a los microorganismos. Precisamente, el origen tardío de la Microbiología con relación a otras ciencias biológicas, y el reconocimiento de las múltiples actividades desplegadas por los microorganismos, hay que atribuirlos a la carencia, durante mucho tiempo, de los instrumentos y técnicas pertinentes. Con la invención del microscopio en el siglo XVII comienza el lento despegue de una nueva rama del conocimiento, inexistente hasta entonces. Durante los siguientes 150 años su progreso se limitó casi a una mera descripción de tipos morfológicos microbianos, y a los primeros intentos taxonómicos, que buscaron su encuadramiento en el marco de los "sistemas naturales" de los Reinos Animal y Vegetal.

El asentamiento de la Microbiología como ciencia está estrechamente ligado a una serie de controversias seculares (con sus numerosas filtraciones de la filosofía e incluso de la religión de la época), que se prolongaron hasta finales del siglo XIX. La resolución de estas polémicas dependió del desarrollo de una serie de estrategias experimentales fiables (esterilización, cultivos puros, perfeccionamiento de las técnicas microscópicas, etc.), que a su vez dieron nacimiento a un cuerpo coherente de conocimientos que constitituyó el núcleo aglutinador de la ciencia microbiológica. El reconocimiento del origen microbiano de las fermentaciones, el definitivo abandono de la idea de la generación espontánea, y el triunfo de la teoría germinal de la enfermedad, representan las conquistas definitivas que dan carta de naturaleza a la joven Microbiología en el cambio de siglo.

Tras la Edad de Oro de la Bacteriología, inaugurada por las grandes figuras de Pasteur y Koch, la Microbiología quedó durante cierto tiempo como una disciplina descriptiva y aplicada, estrechamente imbricada con la Medicina, y con un desarrollo paralelo al de la Química, que le aportaría varios avances metodológicos fundamentales. Sin embargo, una corriente, en principio minoritaria, dedicada a los estudios básicos centrados con ciertas bacterias del suelo poseedoras de capacidades metabólicas especiales, incluyendo el descubrimiento de las que afectan a la nutrición de las plantas, logró hacer ver la ubicuidad ecológica y la extrema diversidad fisiológica de los microorganismos. De esta forma, se establecía una cabeza de puente entre la Microbiología y otras ciencias biológicas, que llegó a su momento decisivo cuando se comprobó la unidad química de todo el mundo vivo, y se demostró, con material y técnicas microbiológicas que la molécula de la herencia era el ADN. Con ello se asiste a un íntimo y fértil intercambio entre la Microbiología, la Genética y la Bioquímica, que se plasma en el nacimiento de la Biología Molecular, base del espectacular auge de la Biología desde mediados de este siglo.

Por otro lado, el "programa" inicial de la Microbiología (búsqueda de agentes infectivos, desentrañamiento y aprovechamiento de los mecanismos de defensa del hospedador) condujeron a la creación de ciencias subsidiarias (Virología, Inmunología) que finalmente adquirieron su mayoría de edad y una acentuada autonomía.

Por último, la vertiente aplicada que estuvo en la base de la creación de la Microbiología, mantuvo su vigencia, enriquecida por continuos aportes de la investigación básica, y hoy muestra una impresionante "hoja de servicios" y una no menos prometedora perspectiva de expansión a múltiples campos de la actividad humana, desde el control de enfermedades infecciosas (higiene, vacunación, quimioterapia, antibioterapia) hasta el aprovechamiento económico racional de los múltiples procesos en los que se hallan implicados los microorganismos (biotecnologías).

Así pues, la sencilla definición con la que se abrió este apartado, escondía todo un cúmulo de contenidos y objetos de indagación, todos emanados de una peculiar manera de aproximarse a la porción de realidad que la Microbiología tiene encomendada. En las próximas páginas ampliaremos y concretaremos el concepto al que hemos hecho rápida referencia. Realizaremos un recorrido por su el desarrollo de la Microbiología a lo largo de su historia, que nos permitirá una visión concreta de algunos de sus característicos modos de abordar su objeto de estudio; finalmente, estaremos en disposición de definir este último, desglosado como objeto material y formal.

2    DESARROLLO HISTÓRICO DE LA MICROBIOLOGÍA.

La Microbiología, considerada como una ciencia especializada, no aparece hasta finales del siglo XIX, como consecuencia de la confluencia de una serie de progresos metodológicos que se habían empezado a incubar lentamente en los siglos anteriores, y que obligaron a una revisión de ideas y prejuicios seculares sobre la dinámica del mundo vivo.

Siguiendo el ya clásico esquema de Collard (l976), podemos distinguir cuatro etapas o periodos en el desarrollo de la Microbiología:

1. Primer periodo, eminentemente especulativo, que se extiende desde la antigüedad hasta llegar a los primeros microscopistas.
2. Segundo periodo, de lenta acumulación de observaciones (desde l675 aproximadamente hasta la mitad del siglo XIX), que arranca con el descubrimiento de los microorganismos por Leeuwenhoek (l675).
3. Tercer periodo, de cultivo de microorganismos, que llega hasta finales del siglo XIX, donde las figuras de Pasteur y Koch encabezan el logro de cristalizar a la Microbiología como ciencia experimental bien asentada.
4. Cuarto periodo (desde principios del siglo XX hasta nuestros días), en el que los microorganismos se estudian en toda su complejidad fisiológica, bioquímica, genética, ecológica, etc., y que supone un extraordinario crecimiento de la Microbiología, el surgimiento de disciplinas microbiológicas especializadas (Virología, Inmunología, etc), y la estrecha imbricación de las ciencias microbiológicas en el marco general de las Ciencias Biológicas. A continuación se realiza un breve recorrido histórico de la disciplina microbiológica, desglosando los períodos 3º y 4º en varios apartados temáticos.

2.1 PERIODO PREVIO AL DESCUBRIMIENTO DEL MICROSCOPIO

Si bien el descubrimiento efectivo de seres vivos no visibles a simple vista debió aguardar hasta el último tercio del siglo XVII, sus actividades son conocidas por la humanidad desde muy antiguo, tanto las beneficiosas, representadas por las fermentaciones implicadas en la producción de bebidas alcohólicas, pan y productos lácteos, como las perjudiciales, en forma de enfermedades infecciosas.

Diversas fuentes escritas de la antigüedad griega y romana hablan de gérmenes invisibles que transmiten enfermedades contagiosas. Lucrecio (96-55 a.C.), en su "De rerum natura" hace varias alusiones a "semillas de enfermedad". En el Renacimiento europeo, Girolamo Frascatorius, en su libro "De contagione et contagionis" (1546) dice que las enfermedades contagiosas se deben a "gérmenes vivos" que pasan de diversas maneras de un individuo a otro. Estos inicios de explicación que renunciaban a invocar causas sobrenaturales fueron probablemente catalizados por la introducción en Europa de la sífilis, una enfermedad en la que estaba clara la necesidad de contacto para su contagio. Pero la "cosa" que se transmite en la enfermedad siguió siendo objeto de conjeturas durante mucho tiempo.

2.2 EL PERIODO DE LOS PRIMEROS MICROSCOPISTAS.

Ya en el siglo XIV, con la invención de las primeras lentes para corregir la visión, surgió una cierta curiosidad sobre su capacidad de aumentar el tamaño aparente de los objetos. En el siglo XVI surgieron algunas ideas sobre aspectos de la física óptica de las lentes de aumento, pero no encontraron una aplicación inmediata. Se dice que Galileo hizo algunas observaciones "microscópicas" invirtiendo su telescopio a partir de lentes montadas en un tubo, pero en cualquier caso está claro que no tuvieron ninguna repercusión.

La primera referencia segura sobre el microscopio (1621) se debe a Constantijn Huygens, quien relata que el inglés Cornelis Drebbel tenía en su taller un instrumento magnificador, que recibió el nombre de microscopium en l625, en la Accademia dei Lincei, de Roma.

El descubrimiento de los microorganismos fue obra de un comerciante holandés de tejidos, Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723), quien en su pasión por pulir y montar lentes casi esféricas sobre placas de oro, plata o cobre, casi llegó a descuidar sus negocios. Fabricó unos cuatrocientos microscopios simples, con los que llegó a obtener aumentos de casi 300 diámetros. En 1675 descubrió que en una gota de agua de estanque pululaba una asombrosa variedad de pequeñas criaturas a las que denominó "animálculos". En 1683 descubre las bacterias, por lo que se considera el "padre de la Microbiología". Durante varias décadas Leeuwenhoek fue comunicando sus descubrimientos a la Royal Society de Londres a través de una serie de cartas que se difundieron, en traducción inglesa, en las "Philosophical Transactions". Sus magníficas dotes de observador le llevaron asimismo a describir protozoos (como Giardia, que encontró en sus propias heces), la estructura estriada del músculo, la circulación capilar, a descubrir los espermatozoides y los glóbulos rojos (por lo que también se le considera el fundador de la Histología animal), así como a detallar diversos aspectos estructurales de las semillas y embriones de plantas. Leeuwenhoek se percató de la abundancia y ubicuidad de sus animálculos, observándolos en vinagre, placa dental, etc.

Aunque los descubrimientos de Leeuwenhoek despertaron interés al ser comunicados, pocos intentaron o pudieron reproducirlos seriamente. Además, la fabricación de lentes sencillas de gran aumento era difícil y el manejo de los microscopios simples, bastante engorroso.

Simultáneamente el inglés Robert Hooke (1635-1703) usando microscopios compuestos, describió los hongos filamentosos (1667), y descubrió la estructura celular de las plantas (Micrographia, 1665), acuñando el término célula. Pero el trabajo con microscopios compuestos aplicados al estudio de los "animálculos" languideció durante casi 200 años, debido a sus imperfecciones ópticas, hasta que hacia 1830 se desarrollaron las lentes acromáticas.

2.3 EL DEBATE SOBRE LA GENERACIÓN ESPONTÁNEA.

La autoridad intelectual de Aristóteles por un lado, y la autoridad moral representada por la Biblia, por otro, junto con las opiniones de escritores clásicos como Galeno, Plinio y Lucrecio, a los que se citaba como referencias incontrovertibles en la literatura médica en la Edad Media y Renacimiento, dieron carta de naturaleza a la idea de que algunos seres vivos podían originarse a partir de materia inanimada, o bien a partir del aire o de materiales en putrefacción. Esta doctrina de la "generatio spontanea" o abiogénesis, fue puesta en entredicho por los experimentos de Francesco Redi (1621-1697), quien había acuñado la expresión "Omne vivum ex ovo" (1668), tras comprobar que los insectos y nematodos procedían de huevos puestos por animales adultos de su misma especie. Demostró que si un trozo de carne era cubierto con gasa de forma que las moscas no podían depositar allí sus huevos, no aparecían "gusanos", que él correctamente identificó como fases larvarias del insecto. Los descubrimientos de Redi tuvieron el efecto de desacreditar la teoría de la generación espontánea para los animales y plantas, pero la reavivaron respecto de los recién descubiertos "animálculos", de modo que aunque se aceptó la continuidad de la vida en cuanto a sus formas superiores, no todos estaban dispuestos a admitir el más amplio "Omne vivum ex vivo" aplicado a los microorganismos.

Hubo que esperar un siglo más hasta que una serie de naturalistas recomenzaran el ataque a la teoría preformacionista. Lazzaro Spallanzani (1729-1799) sostuvo una disputa con J.T. Needham (1713-1781) en la que el primero demostró que los "infusorios" no aparecían en muestras de maceraciones animales o vegetales sometidas durante tiempo suficiente a ebullición en frascos herméticamente cerrados, pero volvían a aparecer si se practicaban agujeros en el recipiente. Sin embargo los preformacionistas no se daban por vencidos; el mismo Needham, recogiendo una idea ya expresada por Huygens, amigo de Leeuwenhoek, replicó -con argumentos vitalistas muy propios de la época- que el calor había destruido la "fuerza vegetativa" de las infusiones y había cambiado la "cualidad" del aire dentro de los frascos.

Durante el primer tercio del siglo XIX la doctrina de la arquegénesis o generación espontánea recibió un último refuerzo antes de morir, debido por un lado a razones extracientíficas (el auge del concepto de transmutación producido por la escuela de la filosofía de la naturaleza), y por otro al descubrimiento del oxígeno y de su importancia para la vida, de modo que los experimentos de Spallanzani se interpretaron como que al calentarse las infusiones, el oxígeno del aire se destruía, y por lo tanto desaparecía la "fuerza vegetativa" que originaba la aparición de microorganismos.

Theodor Schwann (1810-1882) presentó en 1836 un método seguro para refutar la teoría abiogénica: calentó maceraciones en frascos a los que se había eliminado previamente el aire, pero no continuó trabajando en esta línea.

Para complicar más las cosas, la publicación de "Sobre el origen de las especies" por Darwin en 1859, fue utilizada por algunos preformacionistas para apoyar sus argumentos. El mismo Haeckel, en una fecha tan tardía como 1866, se mostraba escéptico ante las pruebas aportadas por Pasteur.

Fue, efectivamente Louis Pasteur (1822-1895) el que asestó el golpe definitivo y zanjó la cuestión a favor de la teoría biogénica. En un informe a la Académie des Sciences de París, en 1860 ("Expériences rélatives aux générations dites spontanées") y en escritos posteriores comunica sus sencillos y elegantes experimentos: calentó infusiones en matraces de vidrio a los que estiraba lateralmente el cuello, haciéndolo largo, estrecho y sinuoso, y dejándolo sin cerrar, de modo que el contenido estuviera en contacto con el aire; tras esta operación demostró que el líquido no desarrollaba microorganismos, con lo que eliminó la posibilidad de que un "aire alterado" fuera la causa de la no aparición de gérmenes. Antes bien, comprobó que los gérmenes del aire quedaban retenidos a su paso por el largo cuello sinuoso, en las paredes del tubo, y no alcanzaban el interior del recipiente donde se encontraba la infusión, quedando ésta estéril indefinidamente. Sólo si se rompía el cuello lateral o si se inclinaba el frasco de modo que pasara parte de líquido a la porción de cuello, los gérmenes podían contaminar la infusión y originar un rápido crecimiento.

En 1861 Pasteur publica otro informe en el que explica cómo se pueden capturar los "cuerpos organizados" del aire con ayuda de un tubo provisto de un tapón de algodón como filtro, y la manera de recuperarlos para su observación microscópica. De esta forma quedaba definitivamente aclarado el origen de los microorganismos, y se abría la Edad de Oro del estudio científico de las formas de vida no observables a simple vista.

Los últimos escépticos quedaron silenciados cuando en 1877 John Tyndall (1820-1893) aplicó su sistema de esterilización por calentamiento discontinuo (hoy conocida precisamente como tindalización), que evidenció la existencia de formas microbianas de reposo muy resistentes al calor, lo cual fue confirmado poco más tarde por Ferdinand Cohn al descubrir las esporas bacterianas.

2.4 EL DEBATE SOBRE LOS FERMENTOS

Un segundo factor contribuyente al nacimiento de la ciencia microbiológica fue el establecimiento de la relación que une ciertas transformaciones químicas que se dan en las infusiones con el crecimiento de los gérmenes en ellas existentes. Cagniard-Latour en 1836, y Schwann y Kützing en 1837 habían sugerido que las levaduras eran las causantes de la fermentación alcohólica por la que el azúcar pasa a alcohol etílico y dióxido de carbono, pero se encontraron con la crítica adversa de los grandes químicos de la época (Berzelius, Wohler y Liebig). Liebig, hacia 1840, había realizado importantes confirmaciones a la "teoría mineral" sobre la nutrición de las plantas, enfrentándose a la "teoría del humus" sostenida por Thaer, asestando un golpe a las ideas vitalistas heredadas de Leibniz. Puesto que se consideraba a las levaduras como plantas microscópicas, se suponía que los procesos de fermentación y putrefacción se debían a fenómenos químicos de descomposición y muerte encuadrables en el marco de la teoría mineral de la fisiología vegetal. Su convencimiento de que toda actividad vital se podía explicar en términos de química y física retrasó por algún tiempo la adscripción de estos fenómenos a células vivas.

Fue Pasteur (que, desde sus primeros estudios sobre las propiedades ópticas de los cristales de tartrato, venía suponiendo que estos compuestos tenían un orígen orgánico) quien de nuevo intervino en el debate de forma decisiva. En 1857 demostró que los agentes de la fermentación láctica eran microorganismos, trabajando sobre un problema que había surgido entre los destiladores de Lille cuando en sus cubas la fermentación alcohólica se vio sustituida por una indeseable fermentación láctica. Este fue el inicio de una larga serie de estudios que habría de durar hasta 1876, en los que Pasteur identificó distintos microorganismos responsables de diferentes clases de procesos fermentativos. Así, en 1860 adscribe inequívocamente la fermentación alcohólica a ciertos tipos de levaduras, y en 1866, en sus Études sur le vin resume sus hallazgos al respecto, inaugurando la Microbiología Aplicada, una de las primeras derivaciones prácticas no empíricas emanadas de la Biología. A finales del siglo XIX eminentes biólogos como Hansen, en Copenhague, y Beijerink, en Delft, desarrollaban su actividad en industrias y destilerías.

Trabajando sobre los agentes de la fermentación butírica, Pasteur descubrió la presencia demicroorganismos que se desarrollaban en ausencia de oxígeno, lo cual desmentía la creencia de que todas las formas de vida necesitan aire para crecer. Acuñó los términos aerobiosis y anaerobiosis para denominar, respectivamente, a la vida en presencia y en ausencia de oxígeno.

Tras el descubrimiento de la anaerobiosis, el mismo Pasteur comprendió las distintas implicaciones energéticas subyacentes a la utilización de sustratos orgánicos en presencia y en ausencia de oxígeno, demostrando que, en el segundo caso el rendimiento (medido como crecimiento microbiano) era siempre menor, al no poder realizarse la degradación total de las correspondientes sustancias.

Una profundización en los fenómenos de fermentación llegó cuando en 1897 Buchner obtuvo, a partir de levaduras, una preparación enzimática (zimasa) que era capaz de realizar la misma transformación de "fermentación" que las células vivas. Este descubrimiento, que evocaba las propuestas de Berzelius y Liebig, supuso en realidad la confluencia de los enfoques químico y biológico: las fermentaciones eran procesos químicos catalizados por enzimas presentes dentro de células vivas, que podían ser estudiados extracelularmente. De esta forma, la Bioquímica, nacida como una rama de la química fisiológica, que se venía especializando en la enzimología, encontró una alianza fructífera y duradera con la joven Microbiología.

2.5 LOS AVANCES TÉCNICOS

La doctrina del pleomorfismo, vigente durante buena parte del siglo XIX, mantenía que los microorganismos adoptaban formas y funciones cambiantes dependiendo de las condiciones ambientales. A estas ideas se oponían frontalmente investigadores como Koch, Pasteur y Cohn, que estaban convencidos de la especificidad y constancia morfológica y fisiológica de cada tipo de microorganismo (monomorfismo). El pleomorfismo había surgido como una explicación a la gran variedad de formas y actividades que aparecían en un simple frasco de infusión, pero ya Pasteur, en sus estudios sobre la fermentación, se había percatado de que los cultivos que aparecían podían considerarse como una sucesión de distintas poblaciones de microorganismos predominantes, que, a resultas de sus actividades, condicionaban la ulterior composición de la comunidad microbiana. La solución definitiva a esta cuestión dependía, de nuevo, de un desarrollo técnico, que a su vez iba a suministrar una de las herramientas características de la nueva ciencia: los métodos de cultivo puro.

Los primeros cultivos puros fueron obtenidos por el micólogo Brefeld, quien logró aislar esporas de hongos y cultivarlas sobre medios sólidos a base de gelatina. Por su menor tamaño, este método se hacía inviable para las bacterias, por lo que se recurrió a un método basado en diluciones: Lister, en 1878 realizó diluciones secuenciales de cultivos mixtos, hasta lograr muestras en las que existía una sola célula. Pero la técnica era larga y tediosa y, además, normalmente sólo se lograban aislar células del tipo bacteriano más abundante en el cultivo original; sin embargo, el experimento sirvió para confirmar la naturaleza "particulada" de los agentes de las fermentaciones.

Por aquella época Koch buscaba con ahínco métodos más sencillos de cultivo puro, indispensables para proseguir sus investigaciones sobre bacterias patógenas. Primero (y quizá de forma un tanto casual) empleó rodajas de patata como sustrato sólido nutritivo sobre el que se podían desarrollar colonias macroscópicas de bacterias que presentaban morfología característica, que Koch interpretó como resultantes del crecimiento a partir de células individuales. Pero enseguida recurrió a compactar el típico caldo de cultivo a partir de carne (diseñado por Loeffler) añadiéndole gelatina (1881). El medio sólido así logrado era transparente, lo que permitía visualizar fácilmente los rasgos coloniales, y contenía los nutrientes adecuados para el crecimiento de una amplia gama de bacterias. Éstas eran inoculadas en la superficie del medio con un hilo de platino pasado previamente por la llama, por la técnica de siembra en estría. Sin embargo, la gelatina presentaba los inconvenientes de ser atacada por determinados microorganismos, y de tener un bajo punto de fusión; ambos problemas se solventaron cuando en 1882 el médico alemán Walter Hesse, siguiendo una sugerencia de su mujer Fanny, introdujo el agar-agar (polisacárido extraído de algas rojas) como nuevo agente solidificante. El trabajo de Koch ya citado tuvo la trascendental consecuencia de derribar las ideas pleomorfistas, y supuso la primera propuesta del concepto de especie dentro del mundo bacteriano. En 1887 Petri, un ayudante de Koch, sustituyó las engorrosas bandejas de vidrio cubiertas con campanas, usadas hasta entonces para los cultivos sólidos, por un sistema manejable de placas de cristal planas, que se conoce como cajas de Petri.

El desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento fue una consecuencia de las investigaciones llevadas a cabo por Beijerinck y Winogradsky entre 1888 y los primeros años del siglo XX, sobre bacterias implicadas en procesos biogeoquímicos y poseedoras de características fisiológicas distintivas (quimioautótrofas, fijadoras de nitrógeno, etc.). Estos medios, donde se aplica a pequeña escala el principio de selección natural, se diseñan de forma que su composición química definida favorezca sólo el crecimiento de ciertos tipos fisiológicos de microorganismos, únicos capaces de usar ciertos nutrientes del medio.

Otra importante aportación a este "período de cultivo" dentro del desarrollo de la Microbiología surgió del uso de medios diferenciales, en los que se manifiesta algún rasgo bioquímico o metabólico, lo que contribuye a la identificación microbiana. Fue Würtz quien, en 1892, introdujo el uso de indicadores de pH, incorporados en los medios, lo cual permitía revelar la producción de acidificaciones por fermentación en ciertas bacterias.

Mientras tanto, en la ciudad de Jena se había creado una atmósfera de progreso donde confluían grandes naturalistas como Haeckel, Strassburger o Abbé interaccionando con una pujante editorial especializada en Biología y Medicina (Gustav Fischer) y con una poderosa industria óptica y química. Estas influencias recíprocas se plasmaron en numerosos proyectos que reflejaban la efervescencia de las ciencias naturales tras la estela de Darwin (cfr. Jahn et al., 1985). Concretamente, la industria óptica de Abbé y Zeiss, que se mantenía en conexión con la compañía vidriera Schott, pudo satisfacer la necesidad de Koch de perfeccionar el microscopio compuesto, introduciendo lentes acromáticas y una iluminación inferior provista de condensador. El mismoAbbé desarrolló en 1878 el objetivo de inmersión en aceite. Por otro lado, la industria química BASF, que por aquella época se encontraba en pleno auge de patentes de nuevos colorantes, sumistró al laboratorio de Koch una serie de derivados de anilina que teñían las bacterias permitiendo su fácil visualización al microscopio en frotis de tejidos infectados. En 1875 Carl Weigert tiñó bacterias con pirocarmín, un colorante que ya venía siendo usado desde hacía unos años en estudios zoológicos. En años sucesivos se fueron introduciendo el azul de metileno (Koch, 1877), la fuchsina, y el violeta cristal. En 1882-1883 Ziehl y Neelsen desarrollan su método de ácido-alcohol resistencia para teñirMycobacterium tuberculosis. En 1884 el patólogo danés Christian Gram establece una tinción de contraste que permite distinguir dos tipos bacterianos en función de sus reacción diferencial de tinción y que, como se vería mucho más tarde, reflejaba la existencia de dos grupos de bacterias con rasgos estructurales distintivos. En 1890 Loeffler logra visualizar flagelos bacterianos por medio de su técnica de impregnación argéntica. Como veremos más adelante, la misma industria de colorantes alemana previa a la primera guerra mundial fue decisiva también para los comienzos de la quimioterapia.

Estas innovaciones técnicas (métodos de cultivo, microscopía y tinciones) fueron fundamentales (junto con los sistemas de esterilización abordados en el anterior apartado) para la consolidación de la Microbiología como ciencia, permitiendo eliminar las grandes dosis de especulación que hasta entonces habían predominado.

2.6 EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN LAS ENFERMEDADES.

Durante el siglo XIX la atención de muchos naturalistas se había dirigido hacia las diversas formas de animales y plantas que vivían como parásitos de otros organismos. Este interés se redobló tras la publicación de los libros de Darwin, estudiándose las numerosas adaptaciones evolutivas que los distintos parásitos habían adquirido en su peculiar estilo de vida. Sin embargo, la adjudicación de propiedades de parásitos a los microorganismos vino del campo médico y veterinario, al revalorizarse las ideas sobre el origen germinal de las enfermedades infecciosas.

En 1835 Agostino Bassi (1773-1856) demostró que cierta enfermedad del gusano de seda (mal di segno), que había hecho su aparición en Lombardía, se debía a un hongo (Botrytis bassiana). Cuatro años más tarde J.L. Schönlein descubrió la asociación de un hongo con una enfermedad humana de la piel. En 1840 Henle, de la escuela fisiológica de Johannes Müller, planteó la teoría de que las enfermedades infecciosas están causadas por seres vivos invisibles, pero de nuevo la confirmación de estas ideas tuvo que esperar a que la intervención de Pasteur demostrara la existencia de microorganismos específicos responsables de enfermedades.

Hacia mediados del siglo XIX otra enfermedad infecciosa (pebrina) comenzó a diseminarse por los criaderos de gusano de seda de toda Europa, alcanzando finalmente a China y Japón. A instancias de su maestro Jean Baptiste Dumas, Pasteur aceptó el reto de viajar a la Provenza para investigar esta enfermedad que estaba dejando en la ruina a los industriales sederos, a pesar de que nunca hasta entonces se había enfrentado con un problema de patología. Es más que probable que Pasteur viera aquí la oportunidad de confirmar si sus estudios previos sobre las fermentaciones podían tener una extensión hacia los procesos fisiológicos del hombre y de los animales. Es sorprendente que, al principio no se mostrara dispuesto a aceptar la idea de que la pebrina fuera una enfermedad ocasionada por un agente extraño, creyendo durante los dos primeros años que se trataba de alteraciones meramente fisiológicas. Tras una serie de tanteos, y en medio de una intensa actividad intelectual que le obligaba a repasar continuamente los experimentos y las conclusiones extraídas, inmerso en el drama personal de la muerte de su padre y de dos de sus hijas en un corto lapso de tiempo, Pasteur llega finalmente, en 1869, a identificar al protozoo Nosema bombycis como el responsable de la epidemia, y por medio de una serie de medidas de control, ésta comienza a remitir de modo espectacular.

La intervención de bacterias como agentes específicos en la producción de enfermedades fue descubierta a raíz de una serie de investigaciones sobre el carbunco o ántrax, enfermedad que afecta a ganado y que puede transmitirse al hombre. C. Davaine, entre 1863 y 1868, encontró que en la sangre de vacas afectadas aparecían grandes cantidades de microorganismos a los que llamóbacteridios; además, logró inducir la enfermedad experimentalmente en vacas sanas, inoculándoles muestras de sangre infectada. En 1872 el médico alemán C.J. Eberth consiguió aislar los bacilos filtrando sangre de animales carbuncosos. Pero fue Robert Koch (1843-1910), que había sido alumno de Henle, quien con su reciente técnica de cultivo puro logró, en 1876, el primer aislamiento y propagación in vitro del bacilo del ántrax (Bacillus anthracis), consiguiendo las primeras microfotografías sobre preparaciones secas, fijadas y teñidas con azul de metileno. Más tarde (1881), Koch y sus colaboradores confirmaron que las esporas son formas diferenciadas a partir de los bacilos, y más resistentes que éstos a una variedad de agentes. Pero más fundamental fue su demostración de que la enfermedad se podía transmitir sucesivamente a ratones sanos inoculándoles bacilos en cultivo puro, obtenidos tras varias transferencias en medios líquidos.

Este tipo de estrategias para demostrar el origen bacteriano de una enfermedad fue llevado a una ulterior perfección en 1882, con la publicación de "Die Äthiologie der Tuberkulose", donde se comunica por primera vez la aplicación de los criterios que Henle había postulado en 1840. Estos criterios, que hoy van asociados al nombre de Koch, son los siguientes:

1. El microorganismo debe de estar presente en todos los individuos enfermos.
2. El microorganismo debe poder aislarse del hospedador y ser crecido en cultivo puro.
3. La inoculación del microorganismo crecido en cultivo puro a animales sanos debe provocar la aparición de síntomas específicos de la enfermedad en cuestión.
4. El microorganismo debe poder ser reaislado del hospedador infectado de forma experimental.

Fue asimismo Koch quien demostró el principio de especificidad biológica del agente infeccioso: cada enfermedad infecciosa específica está causada por un tipo de bacteria diferente. Estos trabajos de Koch abren definitivamente el campo de la Microbiología Médica sobre firmes bases científicas.

Durante las dos décadas siguientes la Microbiología experimentó una auténtica edad de oro, en la que se aislaron y caracterizaron muchas bacterias patógenas. La Alemania del Reich, que a la sazón se había convertido en una potencia política y militar, se decidió a apoyar la continuidad de los trabajos del equipo de Koch, dada su enorme importancia social y económica, creando un Instituto de investigación, siendo Koch su director en el Departamento de Salud. De esta forma, en la Escuela Alemana se aislaron los agentes productores del cólera asiático (Koch, 1883), de la difteria (Loeffler, 1884), del tétanos (Nicolaier, 1885 y Kitasato, 1889), de la neumonía (Fraenkel, 1886), de la meningitis (Weichselbaun, 1887), de la peste (Yersin, 1894), de la sífilis (Schaudinn y Hoffman, 1905), etc. Igualmente se pudieron desentrañar los ciclos infectivos de agentes de enfermedades tropicales no bacterianas que la potencia colonial se encontró en ultramar: malaria (Schaudinn, 1901-1903), enfermedad del sueño (Koch, 1906), peste vacuna africana (debida al inglés Bruce, 1895-1897), etc.

Por otro lado, la Escuela Francesa, nucleada en el Instituto Pasteur, se concentró en los estudios sobre los procesos infectivos, la inmunidad del hospedador, y la obtención de vacunas, sobre todo a raíz de la vacuna antirrábica ensayada por Pasteur (1885), contribuyendo al nacimiento de la Inmunología (ver apartado 2. 9).

2.7 DESARROLLO DE LA ASEPSIA, QUIMIOTERAPIA Y ANTIBIOTERAPIA

Los avances de las técnicas quirúrgicas hacia mediados del siglo XIX, impulsados por la introducción de la anestesia, trajeron consigo una gran incidencia de complicaciones post-operatorias derivadas de infecciones. Un joven médico británico, Joseph Lister (1827-1912), que había leído atentamente los trabajos de Pasteur, y que creía que estas infecciones se debían a gérmenes presentes en el aire, comprobó que la aplicación de compuestos como el fenol o el bicloruro de mercurio en el lavado del instrumental quirúrgico, de las manos y de las heridas, disminuía notablemente la frecuencia de infecciones post-quirúrgicas y puerperales.

Más tarde, Paul Ehrlich (1854-1919), que había venido empleando distintas sustancias para teñir células y microorganismos, y que conocía bien el efecto de tinción selectiva de bacterias por ciertos colorantes que dejaban, en cambio, incoloras a células animales, concibió la posibilidad de que algunos de los compuestos de síntesis que la industria química estaba produciendo pudieran actuar como "balas mágicas" que fueran tóxicas para las bacterias pero inocuas para el hospedador. Ehrlich concibió un programa racional de síntesis de sustancias nuevas seguido de ensayo de éstas en infecciones experimentales. Trabajando en el laboratorio de Koch, probó sistemáticamente derivados del atoxilo (un compuesto que ya Thompson, en 1905, había mostrado como eficaz contra la tripanosomiasis), y en 1909 informó de que el compuesto 606 (salvarsán) era efectivo contra la sífilis. Aunque el salvarsán presentaba algunos efectos colaterales, fue durante mucho tiempo el único agente disponible contra enfermedades producidas por espiroquetas, y sirvió para ilustrar brillantemente la validez del enfoque de la llamada quimioterapia (término acuñado por el mismo Ehrlich), de modo que encauzó toda la investigación posterior.

En 1927 Gerhard Domagk, en conexión con la poderosa compañía química I.G. Farbenindustrie, inició un ambicioso proyecto de búsqueda de nuevos agentes quimioterápicos, siguiendo el esquema de Ehrlich; en 1932-1935 descubre la acción del rojo de prontosilo frente a neumococos hemolíticos dentro del hospedador, pero señala que esta droga es inactiva sobre bacterias creciendo in vitro. La explicación la sumistra el matrimonio Tréfouël, del Instituto Pasteur, al descubrir que la actividad antibacteriana depende de la conversión por el hospedador en sulfanilamida. El mecanismo de acción de las sulfamidas (inhibición competitiva con el ácido para-aminobenzoico) fue dilucidado por el estadounidense Donald D. Woods. Las investigaciones de éste encaminaron a la industria farmacéutica hacia la síntesis de análogos de metabolitos esenciales, introduciendo un enfoque más racional frente a la época anterior, más empírica.

En 1874, el médico inglés W. Roberts había descrito las propiedades antibióticas de ciertos cultivos de hongos (Penicillium glaucum) contra las bacterias, e introdujo en Microbiología el concepto de antagonismo. Otros investigadores de finales del siglo XIX realizaron observaciones similares, pero fue Fleming quien, en 1929, logró expresar ideas claras sobre el tema, al atribuir a una sustancia química concreta (la penicilina) la acción inhibidora sobre bacterias producida por el hongoPenicillium notatum. Fleming desarrolló un ensayo crudo para determinar la potencia de la sustancia en sus filtrados, pudiendo seguir su producción a lo largo del tiempo de cultivo, y mostrando que no todas las especies bacterianas eran igualmente sensibles a la penicilina. Las dificultades técnicas para su extracción, junto al hecho de que el interés de la época aún estaba centrado sobre las sulfamidas, impidieron una pronta purificación de la penicilina, que no llegó hasta los trabajos de Chain y Florey (1940), comprobándose entonces su gran efectividad contra infecciones bacterianas, sobre todo de Gram-positivas, y la ausencia de efectos tóxicos para el hospedador.

Inmediatamente comenzó una búsqueda sistemática de microorganismos del suelo que mostraran actividades antibióticas. En 1944 A. Schatz y S. Waksman descubren la estreptomicina, producida por Streptomyces griseus, siendo el primer ejemplo de antibiótico de amplio espectro. Los diez años que siquieron al término de la segundad guerra mundial vieron la descripción de 96 antibióticos distintos producidos por 57 especies de microorganismos, principalmente Actinomicetos.

En la década de los 60 se abrió una nueva fase en la era de los antibióticos al obtenerse compuestos semisintéticos por modificación química de antibióticos naturales, paliándose los problemas de resistencia bacteriana a drogas que habían empezado a aparecer, disminuyéndose en muchos casos los efectos secundarios, y ampliándose el espectro de acción.

Aparte de la revolución que supusieron en el campo de la aplicación clínica, los antibióticos ha permitido notables avances en el desentrañamiento de determinados aspectos de arquitectura y función moleculares de las células susceptibles (paredes celulares microbianas, ribosomas, síntesis proteica, etc.).

2.8 AUGE DE LA MICROBIOLOGÍA GENERAL.

Gran parte de los avances en Microbiología descritos hasta ahora se debieron a la necesidad de resolver problemas prácticos. Pero hacia finales del siglo XIX una serie de investigadores -algunos de ellos procedentes de áreas más clásicas de la Historia Natural- desarrollaron importantes estudios básicos que fueron revelando una enorme variedad de microorganismos y sus actividades metabólicas, así como su papel crucial en ciclos biogeoquímicos, sus relaciones con procesos de nutrición vegetal, etc.

El descubrimiento de la quimioautotrofía, obra del gran microbiólogo ruso Sergei Winogradsky (1856-1953), obligó a revisar los conceptos previos, procedentes de la Fisiología Vegetal, de que el crecimiento autotrófico dependía de la presencia de clorofila. Winogradsky había comenzado investigando las bacterias del hierro descubiertas por Cohn en 1875, observando que podían crecer en medios minerales, por lo que supuso que obtenían su energía de la oxidación de sales ferrosas a férricas (1888). En 1889, combinando técnicas de observación secuencial de cultivos microscópicos con ensayos microquímicos sobre bacterias del azufre (Beggiatoa, Thiothrix), infirió que estos microorganismos oxidaban sulfuro de hidrógeno hasta azufre elemental (acumulando éste como gránulos), y luego hasta ácido sulfúrico, obteniendo de este modo su energía. Estas observaciones pueden haber sido el arranque del concepto de litotrofía. Pero el descubrimiento de la quimioautotrofía llegó cuando al año siguiente Winogradsky y Omeliansky pasaron a estudiar las bacterias nitrificantes, demostrando de manera clara que la energía obtenida de la oxidación del amonio o del nitrito era usada para fijar CO₂ (1889-1890). Más tarde el mismo Winogradsky extendió la demostración a cultivos puros en los que el agente solidificante de los medios era el gel de sílice. La explicación del proceso de oxidación de los compuestos de azufre no llegó hasta los estudios de Dangeard (1911) y Kiel (1912). Nuevas capacidades metabólicas fueron reveladas al estudiar los procesos respiratorios de las bacterias que oxidan hidrógeno o metano (Söhngen, 1906).

El químico Berthelot había señalado (1885) que los microorganismos del suelo podían incorporar nitrógeno molecular directamente del aire. Fue igualmente Winogradsky el primero en aislar una bacteria capaz de fijar nitrógeno atmosférico (Clostridium pasteurianum) y en explicar el ciclo del nitrógeno en la naturaleza (1890), siendo el holandés Martinus Beijerinck (1851-1931) el descubridor de Azotobacter como bacteria aerobia fijadora de vida libre (1901). Más tarde Beijerinck demostró por métodos químicos que, en efecto, Azotobacter incorpora nitrógeno de la atmósfera mientras crece (1908). La importancia de la fijación de nitrógeno para la nutrición vegetal llegó con los estudios sobre bacterias formadoras de nódulos en las raíces de las leguminosas. Ya los experimentos cuantitativos sobre plantas creciendo en recipientes, realizados por Boussingault a mediados del siglo XIX, habían indicado que las leguminosas asimilaban nitrógeno de la atmósfera. En 1866 Voronin descubrió las bacterias de los nódulos radicales de esta familia de plantas. Frank, en 1879, demostró que los nódulos parecían inducirse por las mismas bacterias albergadas en ellos, y Ward (1887) usó bacterias procedentes de nódulos machacados para inocular semillas, logrando la producción de nódulos en suelo estéril, y describiendo en un bello trabajo el proceso de infección, con su producción de "hifas" (cordón de infección). Tras la introducción del concepto de simbiosis por De Bary, en 1878, fue Schindler (1884) el primero en describir los nódulos radicales como resultado de una simbiosis entre planta y bacterias. Los trabajos de Hermann Hellriegel (1831-1895) y de su colaborador Hermann Willfahrt (1853-1904), que trabajaban en la Estación Experimental de Bernburg, comunicados en primer lugar en un cogreso en Berlín, en 1886, y publicados en un artículo ejemplar en 1888, asociaron la fertilidad nitrogenada natural de las leguminosas con la presencia de sus nódulos radicales, señalando que estos nódulos se inducían por microorganismos específicos; de este modo lograron una brillante síntesis de las observaciones microbiológicas y químicas. El mismo año de 1888 Beijerinck logró el cultivo puro in vitro de las bacterias nodulares (a las que bautizó como Bacillus radicicola), observando que no reducían nitrógeno en vida libre; más tarde (1890) aportó la prueba definitiva de que las bacterias aisladas eran capaces de nodular específicamente ciertas especies de leguminosas, adquiriéndose de esta forma la facultad de fijar nitrógeno en su asociación con la raíz de la planta. Irónicamente el nombre definitivo para las bacterias de los nódulos de leguminosas (Rhizobium) fue propuesto por Frank, quien durante mucho tiempo se había negado a reconocer los resultados de Hellriegel y Willfahrt, y que había oscilado en sus opiniones, desde suponer que la fijación de nitrógeno era un rasgo general de las plantas, hasta creer que las estructuras nodulares observadas a microcopio (bacteroides) eran gránulos de reserva (incluidas las que él mismo observó en plantas no leguminosas de los géneros Alnus y Eleagnus, originadas por una bacteria bautizada en su honor -Frankia); incluso cuando se convenció de que los simbiontes eran bacterias (y no hongos o mixomicetes), pensaba que éstas sólo estimulaban a que las plantas fijaran nitrógeno en sus hojas; su "conversión" (y aún así incompleta y con reticencias) no llegó hasta 1892. El aislamiento de los bacteroides intranodulares (Prazmowski, 1890), y la relación entre su formación y la fijación de nitrógeno (Nobbe y Hiltner, 1893) completó esta primera oleada de investigación sobre este tema que tanta trascendencia presentaba para la Agronomía. Estos estudios están en la base de todos los ulteriores trabajos de Microbiología Agrícola, de modo que esta especiliadad fue incorporada tempranamente a los laboratorios científicos y estaciones experimentales.

Las obras trascendentales de Winogradsky y Beijerinck abrieron un nuevo horizonte para el estudio de la diversidad microbiana. La escuela de Beijerinck, en la Universidad Técnica de Delft, fue continuada por por A.J. Kluyver y C.B. van Niel, siendo este último el "padre" de la escuela norteamericana desde su establecimiento en California, ya que formó a figuras tan importantes como R.Y. Stanier, R.E. Hungate o M. Doudoroff. La escuela holandesa fundada por Beijerinck tuvo asimismo otra fructífera "colonia" en la ciudad alemana de Konstanz, donde N. Pfennig continuó el trabajo emprendido junto a van Niel en Delft. Todos estos autores, y sus colaboradores, fueron realizando contribuciones esenciales sobre una amplia diversidad de bacterias, descubriendo la variedad de las bacterias fotosintéticas, los tipos de organismos litotróficos, y profundizando en multitud de aspectos estructurales y fisiológicos de las bacterias recién descubiertas. Como dice T.D. Brock en una recensión de Kluyver (1961) "los hombres de la escuela de Delft de Microbiología General fueron pioneros en una época en la que la mayoría de los investigadores estaban demasiado fascinados por problemas aplicados en medicina, agricultura o industria, como para preocuparse por microorganismos quimiosintéticos o fotosintéticos, o por aquellos que muestran fermentaciones inusuales...". Pero, como en tantas otras ocasiones, este enfoque de ciencia básica ha sido extraordinariamente fértil, y aparte de la profundización en la unidad y diversidad de la vida ha dado origen a penetrantes percepciones en multitud de problemas planteados, tarde o temprano, a las ciencias biológicas.

2.9 DESARROLLO DE LA INMUNOLOGÍA

La inmunología es, en la actualidad, una ciencia autónoma y madura, pero sus orígenes han estado estrechamente ligados a la Microbiología. Su objeto consiste en el estudio de las respuestas de defensa que han desarrollado los animales frente a la invasión por microorganismos o partículas extraños, aunque su interés se ha volcado especialmente sobre aquellos mecanismos altamente evolucionados e integrados, dotados de especificidad y de memoria, frente a agentes reconocidos por el cuerpo como no-propios, así como de su neutralización y degradación.

Como tantas otras ciencias, la Inmumología presenta un prolongado período pre-científico, de observaciones y aproximaciones meramente empíricas. La resistencia a ulteriores ataques de una enfermedad infecciosa fue ya recogida en escritos de la antigüedad; el historiador griego Tucídides (464-404 a.C.) narra que en una epidemia acaecida durante la guerra del Peloponeso, los enfermos eran atendidos solo por aquellos que habían sobrevivido previamente a la enfermedad, en la seguridad de que éstos no volverían a ser contagiados. Igualmente, en la antigua China se había observado que las personas que en su niñez habían padecido la viruela no la adquirían más adelante en su vida. Los mismos chinos, en el siglo XI a. C., fueron los primeros en intentar una aplicación de estas observaciones que indicaban la inducción de un estado protector por medio de una forma suave de la enfermedad: la inhalación de polvo de escaras de viruela provocaba un ataque suave que confería resistencia ante infecciones posteriores. Una modificación fue introducida en Occidente en el siglo XVIII por Pylarini y Timoni, y fue popularizada en Gran Bretaña por Lady Mary Wortley Montagu, esposa del embajador inglés en Constantinopla, tras una serie inicicial de pruebas sobre "voluntarios" (prisioneros). Sin embargo, este tipo de prácticas no llegaron a arraigar ampliamente, ya que no estaban exentas de riesgos, entre los cuales figuraba la posibilidad de transmisión de otras enfermedades.

El primer acercamiento a la inmunización con criterios racionales fue realizado por el médico inglésEdward Jenner (1749-1823), tras su constatación de que los vaqueros que habían adquirido la viruela vacunal (una forma benigna de enfermedad que sólo producía pústulas en las manos) no eran atacados por la grave y deformante viruela humana. En mayo de 1796 inoculó a un niño fluido procedente de las pústulas vacunales de Sarah Nelmes; semanas después el niño fue inyectado con pus de una pústula de un enfermo de viruela, comprobando que no quedaba afectado por la enfermedad. Jenner publicó sus resultados en 1798 ("An enquiry into the causes and effects of the variolae vaccinae..."), pronosticando que la aplicación de su método podría llegar a erradicar la viruela. Jenner fue el primero en recalcar la importancia de realizar estudios clínicos de seguimiento de los pacientes inmunizados, consciente de la necesidad de contar con controles fiables.

La falta de conocimiento, en aquella época, de las bases microbiológicas de las enfermedades infecciosas retrasó en casi un siglo la continuación de los estudios de Jenner, aunque ciertos autores, como Turenne, en su libro "La syphilization" (1878) lograron articular propuestas teóricas de cierto interés.

El primer abordaje plenamente científico de problemas inmunológicos se debió, de nuevo, a Pasteur. Estudiando la bacteria responsable del cólera aviar (más tarde conocida como Pasteurella aviseptica), observó (1880) que la inoculación en gallinas de cultivos viejos, poco virulentos, las protegía de contraer la enfermedad cuando posteriormente eran inyectadas con cultivos normales virulentos. De esta forma se obtuvo la primera vacuna a base de microorganismos atenuados. Fue precisamente Pasteur quien dio carta de naturaleza al término vacuna, en honor del trabajo pionero de Jenner. En los años siguientes Pasteur abordó la inmunización artificial para otras enfermedades; concretamente, estableció de forma clara que cultivos de Bacillus anthracis atenuados por incubación a 45?C conferían inmunidad a ovejas expuestas a contagio por carbunco. Una famosa demostración pública de la bondad del método de Pasteur tuvo lugar en Pouilly le Fort, el dos de junio de 1881, cuando ante un gentío expectante se pudo comprobar la muerte del grupo control de ovejas y vacas no inoculadas, frente a la supervivencia de los animales vacunados. Años después, abordaría la inmunización contra la rabia, enfermedad de la que se desconocía el agente causal. Pasteur observó que éste perdía virulencia cuando se mantenían al aire durante cierto tiempo extractos medulares de animales infectados, por lo que dichos extractos se podían emplear eficazmente como vacunas. Realizó la primera vacunación antirrábica en humanos el 6 de julio de 1885, sobre el niño Joseph Meister, que había sido mordido gravemente por un perro rabioso. A este caso siguieron otros muchos, lo que valió a Pasteur reconocimiento universal y supuso el apoyo definitivo a su método de inmunización, que abría perspectivas prometedoras de profilaxis ante muchas enfermedades. Estos logros determinaron, en buena medida, la creación del Instituto Pasteur, que muy pronto reunió a un selecto grupo de científicos, que enfocarían sus esfuerzos en diversos aspectos de las inmunizaciones y de sus bases biológicas. A su vez, los norteamericanos Salmon y Smith (1886) perfeccionaron los métodos serológicos de Pasteur, lo que les permitió producir y conservar más fácilmente sueros tipificados contra la peste porcina.

A finales del siglo XIX existían dos teorías opuestas sobre los fundamentos biológicos de las respuestas inmunes. Por un lado, el zoólogo ruso Ilya Ilich Mechnikov (1845-1916), que había realizado observaciones sobre la fagocitosis en estrellas de mar y pulgas de agua, estableció, a partir de 1883, su "Teoría de los fagocitos", tras estudiar fenómenos de englobamiento de partículas extrañas por los leucocitos de conejo y de humanos. Informó que existían fenómenos de eliminación de agentes patógenos por medio de "células devoradoras" (fagocitos) que actuaban en animales vacunados contra el carbunco, y explicó la inmunización como una "habituación" del hospedador a la fagocitosis. Más tarde, ya integrado en el Instituto Pasteur, propugnó la idea de que los fagocitos segregan enzimas específicos, análogos a los "fermentos" digestivos (1900). Esta teoría de los fagocitos constituyó el núcleo de la teoría de la inmunidad celular, de modo que la fagocitosis se consideraba como la base principal del sistema de defensa inmune del organismo.

Por otro lado, la escuela alemana de Koch hacía hincapié en la importancia de los mecanisnos humorales. Emil von Behring (1854-1917) y Shibasaburo Kitasato (1856-1931), a resultas de sus trabajos sobre las toxinas del tétanos y de la difteria, observaron que el cuerpo produce "antitoxinas" (más tarde conocidas como anticuerpos) que tendían a neutralizar las toxinas de forma específica, y evidenciaron que el suero que contiene antitoxinas es capaz de proteger a animales expuestos a una dosis letal de la toxina correspondiente (1890). La intervención de Ehrlich permitió obtener sueros de caballo con niveles de anticuerpos suficientemente altos como para conferir una protección eficaz, e igualmente se pudo disponer de un ensayo para cuantificar la "antitoxina" presente en suero. Ehrlich dirigió desde 1896 el Instituto Estatal para la Investigación y Comprobación de Sueros, en Steglitz, cerca de Berlín, y, a partir de 1899, estuvo al frente del mejor equipado Instituto de Terapia Experimental, en Frankfurt. Durante este último periodo de su vida, Ehrlich produce una impresionante obra científica, en la que va ahondando en la comprensión de la inmunidad humoral. En 1900 da a luz su "Teoría de las cadenas laterales", en la que formula una explicación de la formación y especificidad de los anticuerpos, estableciendo una base química para la interacción de éstos con los antígenos. Por su lado, R. Kraus visualiza por primera vez, en 1897, una reacción antígeno-anticuerpo, al observar el enturbiamento de un filtrado bacteriano al mezclarlo con un suero inmune específico (antisuero). En 1898 Jules Bordet (1870-1961) descubre otro componente sérico relacionado con la respuesta inmunitaria, al que bautiza como "alexina", caracterizado, frente al anticuerpo, por su termolabilidad e inespecificidad. (Más tarde se impondría el nombre de complemento, propuesto por Ehrlich). El mismo Bordet desarrolló, en 1901, el primer sistema diagnóstico para la detección de anticuerpos, basado en la fijación del complemento, y que inició una larga andadura, que llega a nuestros días.

La conciliación de las dos teorías se debió a Almorth Wrigth y Stewart R. Douglas, quienes en 1904 descubren las opsoninas, anticuerpos presentes en los sueros de animales inmunizados y que, tras unirse a la superficie bacteriana, incrementan la capacidad fagocítica de los leucocitos.

El área de la inmunopatología inicia su andadura con la descripción del fenómeno de anafilaxia producido por introducción en un animal de un suero de una especie distinta (Portier y Richet, 1902; Arthus, 1903), lo que a su vez abriría la posibilidad de métodos de serodiagnóstico, con aplicaciones múltiples en Medicina, Zoología, y otras ciencias biológicas. En 1905 Pirquet sugiere que la enfermedad del suero (un fenómemo de hipersensibilidad) tiene relación directa con la producción de anticuerpos contra el suero inyectado, introduciendo el término de alergia para referirse a la reactividad inmunológica alterada.

La inmunoquímica cobra un gran impulso en las primeras décadas del siglo XX con los trabajos de Karl Landsteiner (1868-1943). Su primera contribución de importancia había sido la descripción, mediante reacciones de aglutinación, del sistema de antígenos naturales (ABC0) de los eritrocitos humanos (1901-1902), completada (en colaboración con Von Dungern y Hirzfeld), con las subdivisiones del grupo A y el estudio de su transmsión hereditaria. Estos trabajos sirvieron de estímulo para avanzar en el desentrañamiento de la especificidad química de los antígenos que determinan la formación de anticuerpos. Landsteiner estudió sistemáticamente las características de inmunogenicidad y especificidad de reacción de antígenos con anticuerpos, valiéndose de la modificación química de antígenos, denominando haptenos a aquellos grupos químicos que por sí mismos no desencadenan formación de anticuerpos, pero sí lo hacen tras ser conjugados a proteínas portadoras.

La cuestión de las reacciones antígeno-anticuerpo se convirtió en otra polémica entre escuelas hasta finales de los años 20. Mientras Ehrlich y sus seguidores mantenían que estas reacciones tienen una base puramente química, Bordet y sus discípulos las explicaban como fenómenos físicos de reacciones entre coloides. La resolución del debate debió aguardar hasta finales de los años 30, al incorporarse avances técnicos como la electroforesis, la cromatografía en papel, la ultracentrifugación y el microscopio electrónico. Heidelberg y Kendall (1936) purificaron anticuerpos a partir de sueros por disociación de precipitados. Tiselius (1939) demostró que los anticuerpos constituyen la fracción gamma-globulínica del suero. Veinte años después R.R. Porter y G.M. Edelman establecen la estructura de las inmunoglobulinas. Durante este lapso de tiempo se descubre que la síntesis de anticuerpos ocurre en las células plasmáticas, aunque éstas no son puestas en relación aún con los linfocitos; durante muchos años se siguió creyendo que los linfocitos eran células pasivas, sin función inmune. Por aquella época se describe, también, la diversidad de inmunoglobulinas, llegándose al establecimiento de una nomenclatura. Enseguida comienza la era de los múltiples experimentos sobre timectomía en ratones neonatos y sobre bursectomía en aves, así como los de reconstitución de animales irradiados, con timocitos y células de la medula ósea, y que permiten afirmar el papel esencial de los linfocitos, encuadrarlos en tipos funcionales T y B, y relacionarlos con las respuestas inmunes celular y humoral, respectivamente.

Una importante faceta de la inmunología de la primera mitad del siglo XX fue la obtención de vacunas. Se lograron toxoides inmunogénicos a partir de toxinas bacterianas, en muchos casos por tratamiento con formol: toxoide tetánico (Eisler y Lowenstein, 1915) y toxoide diftérico (Glenny, 1921). En 1922 se desarrolla la vacuna BCG contra la tuberculosis, haciendo uso de una cepa atenuada de Mycobacterium tuberculosis, el bacilo de Calmette-Guérin. La utilización de coadyuvantes se inicia en 1916, por LeMoignic y Piroy.

La inmunogenética nace cuando Bernstein describe en 1921 el modelo de transmisión hereditaria de los cuatro grupos sanguíneos principales, basándose en el análisis estadístico de sus proporciones relativas, y con el descubrimiento por Landsteiner y Levène (1927) de los nuevos sistemas MN y P. Los experimentos de transfusiones sanguíneas interespecíficas permitieron distinguir la gran complejidad de los antígenos sanguíneos, explicables según unos 300 alelos múltiples.

Una contribución esencial a las ideas sobre el mecanismo de formación de los anticuerpos la realizó el australiano Macfarlane Burnet (1899-1985), al establecer su teoría de la selección clonal; ésta argumenta que cada linfocito B sintetiza un único tipo de anticuerpo, específico para cada antígeno(determinante antigénico), de modo que la unión del antígeno causa la proliferación clonal del linfocito B, con la consecuente síntesis incrementada de anticuerpos específicos. Igualmente, Burnet lanzó una hipótesis sobre el mecanismo subyacente a la auto-tolerancia inmunológica, que fue confirmada experimentalmente por Peter Medawar. Más recientemente Niels Jerne ha realizado nuevas aportaciones y refinamientos a la teoría de la selección clonal, proponiendo un modelo de regulación inmune conocido como teoría de las redes idiotípicas.

Los avances en Inmunología durante los últimos años han sido espectaculares, consolidando a ésta como ciencia independiente, con su conjunto propio de paradigmas, ya relativamente escindida de su tronco originario microbiológico. Entre los hitos recientes hay que citar la técnica de producción deanticuerpos monoclonales a partir de hibridomas, desarrollada originalmente por César Milstein y Georges Kohler en 1975, y que presenta una enorme gama de aplicaciones en biomedicina, o el desentrañamiento de los fenómenos de reorganización genética responsables de la expresión de los genes de inmunoglobulinas, por Susumu Tonegawa.

2.10 ORIGEN Y DESARROLLO DE LA VIROLOGÍA

La Virología ha sido la ciencia microbiológica de origen más tardío, habiendo surgido como resultado del hallazgo de enfermedades infecciosas en las que la demostración de implicación de microorganismos se demostraba esquiva con los medios habituales disponibles a finales del siglo XIX. La euforia que se vivía en los ámbitos científicos y médicos, al socaire de la edad de oro de aislamiento de bacterias patógenas, se plasmó en el prejuicio de que la incapacidad de hacer crecer los agentes causantes de ciertas enfermedades se debía a una técnica inapropida o mal aplicada.

El botánico ruso Dimitri Iwanovski había observado (1892) que la enfermedad del mosaico del tabaco podía ser reproducida experimentalmente usando el fluido que atravesaba los filtros de porcelana que normalmente retenían a las bacterias, pero siendo incapaz de aislar y crecer el supuesto microorganismo, abandonó la investigación. Pocos años más tarde (1898), y probablemente sin tener noticias del trabajo de Iwanovski, Beijerink realizó experimentos similares con el mismo sistema, y en otro rasgo de su genio, enfrentándose a los conceptos de la época, avanzó la idea de que el agente filtrable (un contagium vivum fluidum, según su expresión), debía de incorporarse al protoplasma vivo del hospedador para lograr su reproducción. Este tipo de agentes infectivos que atravesaban los filtros de porcelana fueron llamados en principio "virus filtrables", quedando más tarde su denominación simplemente como virus. Aquel mismo año de 1898 Loeffler y Frosch descubren los virus animales al comprobar que un virus filtrable es responsable de la glosopeda del ganado. En 1901 Reed descubre el primer virus humano, el de la fiebre amarilla, y en 1909 Landsteiner y Pope detectan el de la poliomielitis. A comienzos de siglo Copeman desarrolla su técnica de multiplicación de virus animales en embriones de pollo, con la que P. Rous aisla y cultiva el virus del sarcoma aviar (1911).

Los virus bacterianos fueron descubiertos en 1915 por F.W. Twort, si bien su trabajo no alcanzó la elegancia y claridad del desarrollado poco más tarde por el canadiense Félix d'Hérelle (1917); fue éste quien acuñó el término bacteriófago, y supuso correctamente que el fenómeno de lisis por estos agentes debía de estar ampliamente difundido entre las bacterias. Aunque su esperanza en la aplicación de los fagos como elementos bactericidas para uso médico no pudo satisfacerse, la contribución de los virus bacterianos al avance de la genética y biología moleculares ha sido decisiva: de hecho, los primeros estudios cuantitativos sobre replicación virásica se realizaron sobre fagos de Escherichia coli, lo que suministró modelos aplicables a otros virus, incluidos los de animales. En 1925 Bordet y Bal describen por primera vez el fenómeno de lisogenia, pero las relaciones entre los ciclos lítico y lisogénico de los fagos no fueron aclaradas hasta los estudios de André Lwoff (1950).

La primera visualización de un virus se debe a las observaciones a microscopio ultravioleta del bacteriólogo inglés Barnard (1925), y en 1939 se realiza la primera fotografía de un virus a microscopio electrónico. Pero los avances más significativos en el estudio de la composición y estructura de los virus se inician con la purificación y cristalización, por Wendell M. Stanley, del virus del mosaico del tabaco -TMV- (1935), aplicando procedimientos típicos de la cristalización de enzimas. Inicialmente Stanley comprobó que el TMV contenía gran proporción de proteína, pero poco más tarde detecta, además, la presencia de ácido nucleico. A partir de aquí, la Virología entra en una fase de ciencia cuantitativa, en la que participan numerosos físicos, bioquímicos y genetistas, en un esfuerzo interdisciplinar que da origen a la moderna Biología Molecular.

Un importante avance metodológico para el estudio de los virus animales se debió a Enders, Weller y Robbins (1949), al desarrollar por primera vez un método para la multiplicación virásica sobre cultivos de tejidos de mamíferos, técnica que fue perfeccionada más tarde por el equipo de Renato Dulbecco.

Los recientes progresos en las numerosas técnicas de biología molecular han propiciado una auténtica explosión de descubrimientos sobre la biología de los virus y de sus células hospedadoras; baste citar la replicación del genomio de ARN de los retrovirus por reversotranscripción a ADN, los fenómenos de transformación oncogénica virásica y su aplicación a los estudios generales delcáncer, el diseño de vacunas recombinantes por manipulación in vitro de genomios virásicos, la próxima aplicación clínica de la primeras terapias génicas en humanos recurriendo a vectores virásicos, etc. En el terreno de las necesidades urgentes, la metodología existente ha permitido la rápida identificación y caracterización del virus de la inmunodeficiencia humana, lo que se está traduciendo en una intensa y racional búsqueda de procedimientos para prevenir y eliminar la inesperada epidemia de SIDA.

En años recientes han sido descubiertos dos nuevos tipos de entidades infectivas, subvirásicas: T.O. Diener describió en 1967 la existencia de ARN desnudos infectivos en plantas, a los que llamóviroides, y en 1981 Prusiner puso de manifiesto que determinadas enfermedades de mamíferos se deben a partículas proteicas aparentemente desprovistas de material genético, a las que bautizó como priones.

2.11 RELACIONES ENTRE LA MICROBIOLOGÍA Y OTRAS CIENCIAS BIOLÓGICAS.

El auge de la microbiología desde finales del siglo XIX se plasmó, entre otras cosas, en el aislamiento de gran variedad de cepas silvestres de microorganismos, lo que suministró un enorme volumen de nuevo material biológico sobre el que trabajar, aplicándose una serie de enfoques que eran ya habituales en las ciencias naturales más antiguas; así, había que crear un marco taxonómico (con sus normas de nomenclatura) para encuadrar a los organismos recién descubiertos, era factible desarrollar trabajos sobre morfología y fisiología comparadas, sobre variabilidad y herencia, evolución, ecología, etc. De este modo la joven Microbiología fue objeto, en pocos años, de la utilización, a un ritmo acelerado, de los métodos taxonómicos y experimentales que habían ido surgiendo y madurando desde el siglo XVIII en los ámbitos de la "Historia Natural" clásica.

Aunque nos referiremos en otro apartado (véase cap. 2) a los avances de Taxonomía Microbiana, vale la pena reseñar aquí los esfuerzos tempranos para lograr un clasificación bacteriana por parte de Cohn (1875) y Migula (1894), que sustentaban su concepto de especie predominantemente sobre caracteres morfológicos. Pero hacia 1900 era evidente la arbitrariedad e insuficiencia de este tipo de clasificaciones, de modo que los intentos posteriores hicieron uso de caracteres bioquímicos (Orma Jensen, 1909), o de una mezcla de rasgos morfológicos, bioquímicos, patogénicos y de tinción (Buchanan, 1915). El sistema de taxonomía bacteriana adquirió un nuevo impulso a partir de la 1ª edición del "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" (1923), y de las propuestas de Kluyver y van Niel ("Prospects for a natural system of classification of bacteria", 1936). En cuanto a la nomenclatura, no fue hasta 1958 en que cuajó un Código Internacional de Nomenclatura Bacteriológica, aunque ya se venía aplicando desde hacía tiempo el procedimiento tipológico para los microorganismos, con criterios similares a los de la Zoología y la Botánica.

El establecimiento de relaciones taxonómicas precisó el recurso a métodos cada vez más amplios y afinados de análisis genético, estructural o fisiológico. En un apartado anterior ya vimos las conexiones tempranas entre la Bioquímica y la Microbiología a propósito del descubrimiento de la base enzimática de las fermentaciones, lo cual abrió el camino para dilucidar el metabolismo energético microbiano, y para demostrar su similitud química con rutas metabólicas de organismos superiores. Otro paso importante en la percepción de la unidad bioquímica del mundo vivo deriva del descubrimiento de las vitaminas (término acuñado por Funk em 1911), al establecerse que determinados factores de crecimiento requeridos por algunos microorganismos eran químicamente similares a las vitaminas necesarias en la dieta de los animales, y que este tipo de compuestos representa precursores biosintéticos de coenzimas del metabolismo celular. Así pues, este tipo de investigaciones sentó claramente la idea de la unidad química de los seres vivos, independientemente de su encuadre taxonómico, y encauzó una buena parte de los trabajos bioquímicos hacia los microorganismos, dadas sus cualidades de facilidad de manejo y cultivo en laboratorio.

En cuanto a las conexiones de la Microbiología con la Genética, ya Beijerink, en 1900, tras analizar la teoría de la mutación de De Vries, había predicho que los microoganismos podrían convertirse en objetos de investigación más adecuados que los sistemas animales o vegetales. Pero las primeras conexiones entre ambas ciencias arrancan de la necesidad que hubo, a principios del siglo XX, de determinar la sexualidad de los hongos con fines taxonómicos. En 1905 Maire demostró la existencia de meiosis en la formación de ascosporas, y Claussen (1907) evidenció fusión de núcleos en Ascomicetos, mientras que Kniepp, hacia finales de los años 30 había recogido un gran volumen de información sobre procesos sexuales en Basidiomicetos. El sueco Lindegren (1936) realiza las primeras cartografías genéticas en cromosomas de Neurospora, durante su estancia en el laboratorio californiano de Morgan; este último, propugnador de la "teoría de los genes" (1926), confiaba desde hacía años en ampliar sus éxitos, logrados en Drosophila, hacia el estudio de la genética microbiana. En 1941, otros dos discípulos de Morgan, Beadle y Tatum, aislan mutantes auxotróficos deNeurospora, con lo que se inicia el estudio de la base bioquímica de la herencia, y convierten a este hongo en una valiosa herramienta de trabajo en esta línea de investigación.

Las estrategias diseñadas por Beadle y Tatum fueron aplicadas por Luria y Delbrück (1943) a cultivos bacterianos, investigando la aparición de mutaciones espontáneas resitentes a fagos o estreptomicina. La conexión de estos experimentos con las observaciones previas de Griffith (1928) sobre la transformación del neumococo, llevó a Avery y colaboradores (1944) a demostrar que el "principio transformante" portador de la información genética es el ADN. En 1949 Erwin Chargaff demuestra bioquímicamente la transmisión genética mediante ADN en Escherichia coli , y en 1952 Alfred Hershey y Martha Chase, en experimentos con componentes marcados de fagos, ponen un elegante colofón a la confirmación de la función del ADN, con lo que se derribaba el antiguo y asentado "paradigma de las proteínas" que hasta mediados de siglo intentaba explicar la base de la herencia. De esta forma, la Microbiología experimental se sitúa en pleno centro del nacimiento de la Genética molecular, de la mano de los avances paralelos en Bioquímica (análisis por rayos X de la estructura del ADN debido a Maurice Wilkins y Rosalind Franklin, modelo de Watson y Crick de la doble hélice del ADN, etc.), dando origen esta confluencia a lo que se ha llamado la "edad de oro" de la Biología Molecular.

3 OBJETO DE ESTUDIO DE LA MICROBIOLOGÍA

El objeto de estudio de una ciencia se puede desglosar en dos apartados: objeto material y objeto formal.

3.1 OBJETO MATERIAL: LOS MICROORGANISMOS

La Microbiología es la ciencia que se ocupa del estudio de los microorganismos, es decir, de aquellos organismos demasiado pequeños para poder ser observados a simple vista, y cuya visualización requiere el empleo del microscopio. Esta definición implica que el objeto material de la Microbiología viene delimitado por el tamaño de los seres que investiga, lo que supone que abarca una enorme heterogeneidad de tipos estructurales, funcionales y taxonómicos: desde partículas no celulares como los virus, viroides y priones, hasta organismos celulares tan diferentes como las bacterias, los protozoos y parte de las algas y de los hongos. De esta manera la Microbiología se distingue de otras disciplinas organísmicas (como la Zoología y la Botánica) que se centran en grupos de seres vivos definidos por conceptos biológicos homogéneos, ya que su objeto de indagación se asienta sobre un criterio artificial que obliga a incluir entidades sin más relación en común que su pequeño tamaño, y a excluir a diversos organismos macroscópicos muy emparentados con otros microscópicos.

A pesar de esto (o incluso debido a ello), la Microbiología permanece como una disciplina perfectamente asentada y diferenciada, que deriva su coherencia interna del tipo de metodologías ajustadas al estudio de los organismos cuyo tamaño se sitúa por debajo del límite de resolución del ojo humano, aportando un conjunto específico de conceptos que han enriquecido la moderna Biología.

Podemos definir, pues, a los microorganismos como seres de tamaño microscópico dotados de individualidad, con una organización biológica sencilla, bien sea acelular o celular, y en este último caso pudiendo presentarse como unicelulares, cenocíticos, coloniales o pluricelulares, pero sin diferencianción en tejidos u órganos, y que necesitan para su estudio una metodología propia y adecuada a sus pequeñas dimensiones. Bajo esta denominación se engloban tanto microorganismos celulares como las entidades subcelulares.

3.1.1 MICROORGANISMOS CELULARES

Comprenden todos los procariotas y los microorganismos eucarióticos (los protozoos, los mohos mucosos, los hongos y las algas microscópicas). El encuadre de todos estos grupos heterogéneos será abordado en el próximo capítulo.

3.1.2 VIRUS Y PARTICULAS SUBVIRASICAS

Otro tipo de objetos de estudio de la microbiología son las entidades no celulares, que a pesar de no poseer ciertos rasgos atribuibles a lo que se entiende por vida, cuentan con individualidad y entidad biológica, y caen de lleno en el dominio de esta ciencia.

Los virus son entidades no celulares de muy pequeño tamaño (normalmente inferior al del más pequeño procariota), por lo que debe de recurrirse al microscopio electrónico para su visualización. Son agentes infectivos de naturaleza obligadamente parasitaria intracelular, que necesitan su incorporación al protoplasma vivo para que su material genético sea replicado por medio de su asociación más o menos completa con las actividades celulares normales, y que pueden transmitirse de una célula a otra. Cada tipo de virus consta de una sola clase de ácido nucleico (ADN o ARN, nunca ambos), con capacidad para codificar varias proteínas, algunas de las cuales pueden tener funciones enzimáticas, mientras que otras son estructurales, disponiéndose éstas en cada partícula virásica (virión) alrededor del material genético formando una estructura regular (cápsida); en algunos virus existe, además, una envuelta externa de tipo membranoso, derivada en parte de la célula en la que se desarrolló el virión (bicapa lipídica procedente de membranas celulares) y en parte de origen virásico (proteínas).

En su estado extracelular o durmiente, son totalmente inertes, al carecer de la maquinaria de biosíntesis de proteínas, de replicación de su ácido nucleico y de obtención de energía. Esto les obliga a un modo de vida (sic) parasitario intracelular estricto o fase vegetativa, durante la que el virión pierde su integridad, y normalmente queda reducido a su material genético, que al superponer su información a la de la célula hospedadora, logra ser expresado y replicado, produciéndose eventualmente la formación de nuevos viriones que pueden reiniciar el ciclo.

Los viroides son un grupo de nuevas entidades infectivas, subvirásicas, descubiertas en 1967 por T.O. Diener en plantas. Están constituidos exclusivamente por una pequeña molécula circular de ARN de una sola hebra, que adopta una peculiar estructura secundaria alargada debido a un extenso, pero no total, emparejamiento intracatenario de bases por zonas de homología interna. Carecen de capacidad codificadora y muestran cierta semejanza con los intrones autocatalíticos de clase I, por lo que podrían representar secuencias intercaladas que escaparon de sus genes en el transcurso evolutivo. Se desconocen detalles de su modo de multiplicación, aunque algunos se localizan en el nucleoplasma, existiendo pruebas de la implicación de la ARN polimerasa II en su replicación, por un modelo de círculo rodante que genera concatémeros lineares. Esta replicación parece requerir secuencias conservadas hacia la porción central del viroide. Los viroides aislados de plantas originan una gran variedad de malformaciones patológicas. El mecanismo de patogenia no está aclarado, pero se sabe que muchos de ellos se asocian con el nucleolo, donde quizá podrían interferir; sin embargo, no existen indicios de que alteren la expresión génica (una de las hipótesis sugeridas); cada molécula de viroide contiene uno o dos dominios conservados que modulan la virulencia.

En 1986 se descubrió que el agente de la hepatitis delta humana posee un genomio de ARN de tipo viroide, aunque requiere para su transmisión (pero no para su replicación) la colaboración del virus de la hepatitis B, empaquetándose en partículas similares a las de este virus. A diferencia de los viroides vegetales, posee capacidad codificadora de algunas proteínas.

Los ARNs satélites son pequeñas moléculas de tamaño similar al de los viroides de plantas (330-400 bases), que son empaquetados en cápsidas de determinadas cepas de virus (con cuyos genomios no muestran homologías). Se replican sólo en presencia del virus colaborador específico, modificando (aumentando o disminuyendo) los efectos patógenos de éste.

Los virusoides constituyen un grupo de ARNs satélites no infectivos, presentes en el interior de la cápsida de ciertos virus, con semejanzas estructurales con los viroides, replicándose exclusivamente junto a su virus colaborador.

Los priones son entidades infectivas de un tipo totalmente nuevo y original, descubiertas por Stanley Prusiner en 1981, responsables de ciertas enfermedades degenerativas del sistema nervioso central de mamíferos (por ejemplo, el "scrapie" o prurito de ovejas y cabras, la encefalitis espongiforme bovina), incluyendo los humanos (kuru, síndrome de Gerstmann-Straüssler, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob). Se definen como pequeñas partículas proteicas infectivas que resisten la inactivación por agentes que modifican ácidos nucleicos, y que contienen como componente mayoritario (si no único) una isoforma anómala de una proteina celular. Tanto la versión celular normal (PrP^C) como la patógena (PrP^Sc en el caso del "scrapie") son glicoproteínas codificadas por el mismo gen cromosómico, teniendo la misma secuencia primaria. Se desconoce si las características distintivas de ambas isoformas estriban en diferencias entre los respectivos oligosacáridos que adquieren por procesamiento post-traduccional.

A diferencia de los virus, los priones no contienen ácido nucleico y están codificados por un gen celular. Aunque se multiplican, los priones de nueva síntesis poseen moléculas de PrP que reflejan el gen del hospedador y no necesariamente la secuencia de la molécula del PrP que causó la infecciónprevia. Se desconoce su mecanismo de multiplicación, y para discernir entre las diversas hipótesis propuestas quizá haya que dilucidar la función del producto normal y su posible conversión a la isoforma patógena infectiva.

Recientemente se ha comprobado que, al menos algunas de la enfermedades por priones son simultáneamente infectivas y genéticas, una situación insólita en la Patología humana, habiéndose demostrado una relación entre un alelo dominante del PrP y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. El gen del prión (Prn-p) está ligado genéticamente a un gen autosómico (Prn-i) que condiciona en parte los largos tiempos de incubación hasta el desarrollo del síndrome.

UBICACIÓN DE LOS MICRORGANISMOS EN EL MUNDO VIVO

ENCLAVE TAXONÓMICO DE LOS MICROORGANISMOS: PERSPECTIVA HISTÓRICA| a Contenidos Tras el descubrimiento de los microorganismos, se intentó encuadrarlos en los dos grandes reinos reconocidos por la Biología de la época, en base a los rasgos que entonces servían para distinguir entre plantas y animales. De este modo, a finales del siglo XVIII el reino Plantae englobaba a las algas (inmóviles y fotosintéticas) y a los hongos (inmóviles y no fotosintéticos), mientras que en el reino Animalia Lamarck habilitó el grupo de los Infusoria para incluir los microorganismos que presentaban movilidad. El triunfo de la Teoría Celular a mediados del siglo XIX obligó a reconocer la heterogeneidad del grupo de los infusorios. El célebre microscopista Ehrenberg, en una extensa publicación aparecida en 1838, reconoció su diversidad y los definió como "organismos perfectos", dotados de todos los sistemas orgánicos presentes en seres superiores, con lo que, además, intentaba rebatir la noción, procedente de la filosofía de la naturaleza, de que su estructura sencilla probaba la teoría de la generación espontánea. Sus detallados trabajos, junto a los de otros, se plasmaron más tarde en la escisión de los Infusorios en tres grupos distintos: en uno de ellos se colocaron los organismos pequeños pero pluricelulares, considerados como metazoos; otro grupo era el de los Protozoos, considerados como animales primitivos unicelulares y flexibles; el tercer grupo, las Bacterias oSchyzomycetes, abarcaba los microorganismos más pequeños y sencillos, que se adscribieron al reino vegetal dada su semejanza con las cianofíceas (las consideradas durante mucho tiempo como algasverdeazuladas). Pero las paradojas y anomalías de esta sistemática no tardaron en ser patentes: lo único que caracterizaba a los hongos como plantas era su carencia de formas vegetativas móviles; muchas bacterias tampoco eran fotosintéticas y eran abundantes las dotadas de movilidad; muchas algas poseían formas móviles, incluso con grandes semejanzas con determinados protozoos (de hecho algunos flagelados eran estudiados simultáneamente por zoólogos y botánicos), etc. Haeckel, uno de los más importantes seguidores de Darwin, intentó poner orden en esta confusión en su famoso árbol filogenético de 1866, proponiendo la creación de un tercer reino, el Protista, definido como el que engloba a todos los seres vivos sencillos, sean o no fotosintéticos y/o móviles: protozoos, algas, hongos y bacterias (= Moneres). Esta aproximación, con su buena dosis de nominalismo, se ha prolongado en nuestro siglo, primero en Herbert Copeland, quien en 1938 aparta a las bacterias de los Protistas, creando para ellas el reino Monera, y más tarde en Whittaker y sus seguidores. Hacia mediados del siglo XX el advenimiento de avances metodológicos como la microscopía electrónica y las técnicas bioquímicas de separación de fracciones subcelulares permitieron diferenciar la presencia en las bacterias de componentes químicos y estructurales exclusivos de ellas. Esto supuso un apoyo experimental a las ideas del biólogo francés Chatton, quien ya en los años 30, en su intento de establecer una filogenia universal, se había dado cuenta que la ausencia de un auténtico núcleo rodeado de membrana en las bacterias justificaba crear dos grandes reinos: el de los procariotas y el de los eucariotas. A comienzos de los 60 eminentes biólogos como van Niel y Murray enuncian claramente el significado de estas observaciones y sus consecuencias para la clasificación de los seres vivos. En 1963, el prestigioso libro de texto de Stanier, Adelberg y Doudoroff (The microbial world, 30edición) afirma ya que "las diferencias en la estructura celular que separan las bacterias y algas cianofíceas de todos los demás organismos celulares representan probablemente la mayor discontinuidad evolutiva que pueda encontrarse en el mundo vivo". Hubo que esperar a la 80 edición del Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (1974) para ver estas ideas reconocidas de modo "oficial": se consideró la existencia del Reino Procaryotae, al que se dividió en Cyanobacteria  yBacteria. Sin embargo, la propuesta de dos reinos primarios no fue plenamente aceptada por todos. Robert Whittaker, en 1969, modifica la clasificación de Copeland -siguiendo, por tanto, en la tradición haeckeliana- y propone cinco reinos que, en la versión reciente de sus discípulas Lynn Margulis y Karlene Schwartz, quedan como sigue: aparte de las plantas (en el sentido de Metafitas) y de los animales (en el sentido de Metazoos), se establece el reino de los Moneras (sinónimo de Procariotas), el de los Protoctistas (microorganismos eucarióticos y sus parientes macroscópicos, incluyendo los mohos mucosos y excluyendo los hongos) y el de los Hongos (definidos como eucariotas no fotosintéticos que forman esporas y que carecen de undilipodios en todo su ciclo vital). En años recientes se ha comenzado a aplicar técnicas de biología molecular para intentar una clasificación más natural de los microorganismos, especialmente de las bacterias. Los resultados de esta nueva Taxonomía Molecular son aún incompletos, y hay que reconocer que ignoramos mucho todavía sobre las relaciones filogenéticas, pero se puede hablar ya de una auténtica convulsión en nuestras ideas previas, como lo prueba la puesta en entredicho de los dos reinos primarios de Murray reconocidos por el Bergey's. A continuación se hará un repaso breve de las características generales de los distintos grandes grupos biológicos con representantes microbianos, a lo que se añadirá un comentario sobre las perspectivas filogenéticas que se están abriendo con los nuevos enfoques. 1.1 PROCARIOTAS| a Contenidos Las bacterias son organismos con organización celular, es decir, al igual que el resto de seres vivos conocidos, su unidad vital funcional es la célula. El tipo de organización celular es la procariótica, caracterizada porque su material genético (normalmente un solo cromosoma circular de ADN de doble hebra) no está recluido en un recinto rodeado de membrana, sino inmerso en el citoplasma; este cromosoma se replica de modo amitótico y la división celular suele ser por fisión binaria; carecen de orgánulos rodeados de membrana tales como mitocondrias, cloroplastos, retículo endoplásmico, lisosomas, así como de undilipodios (cilios y flagelos de estructura fibrilar 9+2 y rodeados de membrana citoplásmica); sus ribosomas tienen un coeficiente de sedimentación de 70S; su citoplasma está envuelto por una membrana celular que sirve de barrera selectiva respecto del medio exterior, con funciones de transporte de nutrientes, producción de energía y de biosíntesis de ciertas moléculas. Con algunas excepciones (Mollicutes), la mayoría de las bacterias presentan, externamente a la membrana citoplásmica, una pared celular que, en el grupo de las eubacterias está basada en una macromolécula peculiar denominada peptidoglucano, mientras que en las arqueobacterias éste se ve sustituido por una variedad de tipos moleculares y estructurales exclusivos. Los primeros intentos de clasificaciones bacterianas descansaban prácticamente solo sobre criterios morfológicos (siguiendo la costumbre de la Botánica). Más tarde, con la introducción de los cultivos puros y el establecimiento de razas-tipo, conservadas en colecciones de cultivo, se pudieron comparar diversas características de las cepas aisladas. Las clasificaciones se realizaban aplicando valoraciones intuitivas tras un análisis más o menos detallado de distintos rasgos fenotípicos, dando mayor o menor peso a algunos de estos para establecer jerarquías. Este tipo de taxonomía "subjetiva" ha sido la imperante durante la mayor parte de este siglo. Una aproximación hacia criterios más "objetivos" fue posible a partir de los años 60, cuando el desarrollo de los ordenadores y de los métodos de análisis multivariante dieron nacimiento a la Taxonomía Numérica (o Taxometría), de base adansoniana. En este sistema se comparan distintos organismos respecto de gran número de rasgos fenotípicos, a cada uno de los cuales se le adjudica un peso valorativo semejante, y ha tenido éxito para definir grupos homogéneos ("clusters") de razas, asimilables a taxoespecies bacterianas. Igualmente permite evidenciar cierta estructura taxonómica y jerárquica (recurriendo a métodos como el análisis de "clusters"), que se puede traducir a dendrogramas que expresen relaciones fenéticas. Sin embargo, se ve limitado para establecer criterios válidos en categorías taxonómicas superiores, y presenta el inconveniente de que con él es difícil deducir relaciones filogenéticas. En suma, si bien hay que reconocer la utilidad práctica de los métodos taxonómicos basados en rasgos fenotípicos, hay que admitir su poco valor para dar una visión de las relaciones naturales de parentesco entre los taxones, así como la inestabilidad de la Sistemática a la que da origen. Las polémicas sobre la necesidad o no de una clasificación filogenética no es exclusiva de la Microbiología (en Botánica, bien entrado el siglo XX, aún se discutían las tentativas de definir las especies como unidades naturales reales y la pertinencia de establecer parentescos filogenéticos), pero la carencia, durante mucho tiempo, de una base firme para asentar ese tipo de clasificación, hizo que se abandonaran tales pretensiones filogenéticas en los esquemas taxonómicos, quedando estos como guías para la identificación de nuevos aislados. Los intentos de estudiar relaciones filogenéticas entre los organismos se basan en la existencia de elementos de referencia sobre los que dilucidar dichas relaciones. Estos elementos se pueden agrupar en dos clases: las moléculas semantoforéticas y las moléculas sintácticas. Las primeras son moléculas (ADN, ARN, proteínas) cuyas secuencias primarias representan una copia de la información genética, y su análisis comparativo posibilita establecer relaciones con significado filogenético; las segundas son sustratos o productos de las funciones ejercidas por las primeras, y se plasman en las propiedades fenotípicas que han servido de base a la taxonomía clásica. Como cada grupo se ha estudiado en función de propiedades sintácticas peculiares, la comparación a efectos filogenéticos con otros grupos definidos por otras propiedades sintácticas diferentes imposibilitó, en última instancia, una clasificación que revelara las relaciones evolutivas, siendo difícil evaluar la antigüedad de los grupos definidos por rasgos arbitrarios de los que se desconoce la importancia filogenética. Por otro lado, existía la creencia de que las bacterias, con sus ciclos vitales cortos, evolucionaban de modo tan rápido que sería imposible trazar su linaje genealógico. Sin embargo, a pesar de la rápida reproducción clonal y de la transferencia horizontal de información genética, la evolución estabilizadora permite fijar conjuntos de genes coadaptados que dan una base firme al concepto de especie bacteriana, y a su relativa estabilidad. Ya Orla-Jensen, en 1909, había intentado una clasificación filogenética, y en 1936 Kluyver y van Niel proponen otro esquema "natural" basado en criterios bioquímicos; pero ambas clasificaciones eran muy especulativas, y por supuesto basadas en los fenotipos, aunque al menos tuvieron el mérito de proporcionar un entramado conceptual sobre el que poder pensar más en serio. Al igual que en Zoología y Botánica sistemáticas (y quizá en mayor medidad que éstas), la taxonomía bacteriana se ha beneficiado de los resultados de la investigación general, básica, de modo que diversos conocimientos y metodologías de biología fundamental se han convertido en valiosos auxiliares de la investigación taxonómica, incorporándose a esta disciplina especial. Concretamente, desde inicio de los años 60 se vienen desarrollando una serie de enfoques y técnicas que parecen abrir, por fin, perspectivas serias de elaborar una clasificación natural de las bacterias. La base común de estos planteamientos es analizar moléculas semantoforéticas, esencialmente rasgos del genotipo. En 1974 la 80 edición del Bergey's incluía muchos porcentajes de G+C, aunque su valor de referencia filogenética es bastante limitado. La auténtica revolución comenzó con la cuantificación de homologías entre genomios de distintos microorganismos, mediante experimentos de hibridación entre ácidos nucleicos (heterodúplex ADN-ADN y ADN-ARN), que señalaban la necesidad de introducir correcciones a la taxonomía clásica. Se estableció, por ejemplo, que Salmonella consta de una sola especie; que las especies de Pseudomonas fitopatógenos no deberían clasificarse basándose en la planta parasitada; que Escherichia parece prácticamente homólogo con Shigella, etc. Este tipo de conclusiones preocuparon a algunos, que temieron la llegada de una clasificación poco práctica; de hecho razones de esta clase, junto con la muy asentada rutina de identificación, especialmente en clínica, hacen que la introducción de las nuevas propuestas se realice con cierta moderación. De todas formas, con pocas excepciones, es posible encontrar rasgos fenotípicos que se correlacionen bien con cada grupo de homología detectado por técnicas moleculares, de modo que aquellos puedan usarse en la identificación de nuevos aislados de forma rápida, cómoda y fiable. Las técnicas de hibridación entre ADN y ARN ribosómico, los catálogos de oligonucleótidos generados tras tratamiento del ARNr 16S con ribonucleasa T1, y más recientemente, la secuenciación total de dichos ARNr, permiten medir distancias filogenéticas mayores. Así, por ejemplo, el monumental y temprano estudio de Norberto Palleroni sobre Pseudomonas (1973) manifestó la existencia de cinco grupos distintos, que más tarde (1983) De Vos y De Ley demostraron que guardan menos relación entre sí que con otros géneros de bacterias Gram negativas, confirmando el carácter de "cajón de sastre" que se había creado bajo aquella denominación genérica. Algo parecido le ocurre a Clostridium (uno de los más ricos en especies), que consiste en no menos de cuatro grupos merecedores de rango de géneros distintos. Sobrepasando las implicaciones sobre adscripción a géneros, los resultados más excitantes y provocadores para la taxonomía bacteriana de estas técnicas, se iniciaron en 1977, cuando el grupo de Woese, Fox y Stackebrandt comienza a aplicar de forma amplia el sistema de la comparación de los catálogos oligonucleotícos (y más tarde, la secuenciación) del ARNr 16S de muy distintas especies, y cuya consecuencia más trascendental ha sido la propuesta de una clasificación filogenética bacteriana (Woese, 1987). El planteamiento descansa sobre los siguientes supuestos (bien asentados sobre la genética molecular): para cualquier rasgo fenotípico existen numerosos genotipos equivalentes; esto significa que la mayoría de los cambios que se fijan en el genotipo son selectivamente neutros, lo que les confiere un carácter cronométrico. Este tipo de variabilidad genética -sin cambios apreciables de fenotipo- no está sometida a presión selectiva darwiniana (del ambiente externo), por lo que los cambios mutacionales detectables a nivel de secuencia primaria se comportan como cronómetros moleculares que se pueden emplear para medir relaciones evolutivas y tiempos relativos de divergencia entre linajes distintos, pudiendo inferirse de ellos ciertas características mínimas del antepasado común. Los primeros cronómetros empleados fueron secuencias de proteínas, por ejemplo el citocromo c; sin embargo, es difícil encontrar una proteína distribuida universalmente en los grandes grupos de seres vivos (en el ejemplo citado, el citocromo cestá representado de modo general en eucariotas, pero sólo está presente en algunos procariotas), y además su función no suele ser siempre constante, de modo que en el transcurso evolutivo se pueden introducir mutaciones selectivas que empobrecen sus cualidades de cronómetro. Por consiguiente, un buen cronómetro molecular con amplio significado evolutivo ha de cumplir los siguientes requisitos: ser de distribución universal; cambiar con suficiente lentitud como para permitir detectar relaciones muy antiguas; poseer una función constante; ser de fácil aislamiento y purificación. Los ARN ribosómicos, especialmente los 16S bacterianos (y sus equivalentes 18S eucarióticos), cumplen con bastante adecuación estos puntos. Además, estudios comparativos de control usando otras "sondas evolutivas" (p. ej., reasociación entre ADNs) han dado resultados concordantes. Ahora bien, está claro igualmente que no tiene sentido aplicar de modo inflexible los parámetros filogenéticos como único criterio válido para circunscribir unidades taxonómicas, debido principalmente a que distintos grupos y géneros definidos fenotípicamente pueden tener distintas edades genealógicas (Stackebrandt, 1988; a este punto se hace referencia más adelante). Los principales resultados de este acercamiento a una clasificación filogenética de las bacterias se pueden resumir en los siguientes puntos: Las Arqueobacterias (término acuñado por Woese y Fox en 1977) representan una línea evolutiva de organización celular ciertamente procariótica, pero que parecen no estar más relacionadas con el resto de las bacterias de lo que lo están con el núcleo de los eucariotas. Muestran diferencias moleculares, de organización y expresión genética, fisiológicas y ecológicas suficientemente importantes respecto del resto de las bacterias como para justificar la creación de dos Reinos procarióticos perfectamente diferenciados: Archaeobacteria y Eubacteria, que junto a los Eucariotas, constituirían los tres grandes Reinos primarios del mundo vivo. Las Eubacterias parecen agruparse en 10 phyla o linajes naturales. En unos pocos casos, estos phyla, definidos según su secuencia de ARNr, coinciden con taxones identificados por criterios fenotípicos (tal es el caso del grupo de las bacterias con morfología y estructura espiroquetal); en otros casos elphylum coincide con bastante aproximación con una agrupación de bacterias que presentan un rasgo clásico en común (por ejemplo, el phylum de eubacterias Gram-positivas que, con pocas excepciones, engloba a todas los procariotas con pared celular típica Gram-positiva); sin embargo, la mayoría de los phyla de Woese carecen de una característica fenotípica clara en común (así ocurre, por ejemplo el grupo de Bacteroides, Flavobacterium y relacionados), y suponen un desafío a la Microbiología para encontrar las "marcas" unificadoras subyacentes. Por otro lado, de estos estudios surge por primera vez un esbozo de árbol filogenético universal, desprovisto de raíz , en el que se plantea la fascinante cuestión de cómo se relacionan evolutivamente los tres reinos primarios. Woese propone una entidad hipotética, antecesor universal (progenote), que pudo existir en tiempos remotos, y que quizá pudo dar lugar a las tres grandes líneas, cada una con un conjunto de soluciones a los problemas de transferencia de las instrucciones genéticas no resueltos por el progenote. Recientemente (1990) Woese ha recogido la evidencia actual sobre estas tres grandes líneas evolutivas del mundo vivo, y ha propuesto que sean admitidas con la categoría de dominios (=reinos primarios), con las siguientes denominaciones: los dos dominios con organización celular procariótica se rebautizan como Bacteria (equivalente a Eubacteria) y Archaea (sinónimo deArchaebacteria), y el dominio eucariótico pasa a denominarse Eukarya. A pesar de (o incluso, debido a) las grandes implicaciones de estos estudios, la mayor parte de sus conclusiones no han encontrado su traducción "oficial" en la reciente edición del Bergey's (convertido ya en Manual of Systematic Bacteriology), si bien en ésta se reconoce el valor de las nuevas propuestas y se introducen algunas novedades al respecto. En el Manual, Murray (1984) señala las dificultades de índole práctica que desaconsejaban en el momento de su redacción la inclusión de las derivaciones de todos los estudios moleculares, aparte de la necesidad de acumulación de más datos sobre una amplia variedad de grupos, de los que se carecía de suficiente información. La clasificación a niveles jerárquicos superiores propuesta por Gibbons y Murray en 1978 e incorporada a esta novena edición del Bergey's (1984) es la siguiente: se reconoce un solo reino bacteriano, el Procaryotae, en el que se distinguen cuatro divisiones, según la presencia y composición de la pared celular: División I. Gracilicutes, caracterizados por su pared de tipo Gram-negativo. Dentro de ella se incluyen tres clases: Scotobacteria, bacterias Gram-negativas indiferentes a la luz (no fotosintéticas),Anoxyphotobacteria, bacterias fototrofas con fotosíntesis anoxigénica, y Oxyphotobacteria, con fotosíntesis oxigénica. División II. Firmicutes, bacterias con una estructura de pared celular típicamente Gram-positiva, con peptidoglucano en varias capas. Se consideran dos clases: Firmibacteria, y Thallobacteria (estas últimas, bacterias con tendencia a formar hifas ramificadas, y las relacionadas con ellas). División III. Tenericutes, con la clase única de los Mollicutes; se trata de procariotas pleomórficos y flexibles, carentes de pared celular (micoplasmas) División IV. Mendosicutes, con una sola clase, Archaebacteria, caracterizados por sus paredes celulares (cuando existen) carentes de peptidoglucano. Actualmente estamos asistiendo a una intensa reevaluación de la Sistemática Bacteriana bajo los nuevos planteamientos. Parece que se consolida la Taxonomía Filogenética, y hay numerosas propuestas de modificar definiciones anteriores y la nomenclatura de géneros y especies, creándose combinaciones nuevas y descripciones "corregidas" de taxones clásicos. Un repaso a los últimos ejemplares del International Journal of Systematic Bacteriology, la publicación oficial del Comité Internacional de Bacteriología Sistemática, basta para tomar consciencia de las recientes tendencias. 1.2 MICROORGANISMOS EUCARIÓTICOS| a Contenidos Los microorganismos eucarióticos son seres vivos unicelulares o pluricelulares, pero nunca con diferenciación en tejidos, pudiendo ser coloniales, cenocíticos o miceliares, y cuyo pequeño tamaño obliga a emplear el microscopio para observarlos y analizar su estructura. Su organización celular eucariótica se caracteriza por su compartimentalización estructural y funcional: el material genético (ADN de doble hebra), repartido en varios cromosomas, y normalmente unido a proteínas básicas especiales, se alberga en un núcleo rodeado de membrana; pueden existir diversos orgánulos limitados por membrana: retículo endoplásmico, aparato de Golgi, lisosomas, mitocondrias, etc; las células pueden disponer de uno o más orgánulos de locomoción (cilios y flagelos, denominados genéricamente como undilipodios), con una estructura de 9+2 fibrillas internas, envueltas por prolongaciones de la membrana citoplásmica. Sus ribosomas, más grandes y complejos que los de procariotas, poseen un coeficiente de sedimentación de 80S, y el citoplasma contiene ciertos tipos de elementos citoesqueléticos (microtúbulos, microfilamentos y filamentos intermedios). Tradicionalmente se han venido considerando tres grupos dentro de los microorganismos eucarióticos: algas, protozoos y hongos, pero cada una de estas denominaciones no designa categorías filogenéticamente coherentes. Las Algas son eucariotas macro o microscópicos, normalmente aerobios y capaces de realizar fotosíntesis oxigénica por medio de cloroplastos (aunque algunos grupos presentan formas leucofíticas heterotrofas). Pueden ser unicelulares, cenocíticas, o pluricelulares (filamentosas, coloniales, etc.), pero nunca con diferenciación en tejidos, aunque muchas algas macroscópicas exhiben llamativas diferenciaciones morfológicas. Las algas microscópicas requieren el empleo de técnicas plenamente microbiológicas para su estudio. Actualmente se consideran varios grupos cuyas relaciones filogenéticas no están aclaradas: Chlorophyta (algas verdes), Gamophyta (algas conjugadas, que algunos incluyen en el phylum anterior), Euglenophyta (algas flageladas),Chrysophyta (algas doradas), Xantophyta, Bacillariophyta (diatomeas), Haptophyta(cocolitoforales), Cryptophyta, Phaeophyta (algas pardas) y Rhodophyta (algas rojas). Ejemplos de grupos disputados durante mucho tiempo por zoólogos y botánicos son los Euglenófitos y losCriptófitos. Los Protozoos constituyen un grupo heterogéneo de microorganismos eucarióticos unicelulares no fotosintéticos (exceptuando la clase Phytomastigophorea, dentro del subphulum Mastigophora), muchos con capacidad de movimiento en medios acuosos por medio de pseudópodos o de undilipodios, y con numerosos representantes con formas de vida parasitaria. Sus relaciones filogenéticas no están claras, si bien del estudio de los Dinoflagelados se deduce que al menos algunos grupos pudieron derivar de phyla de algas. La actual clasificación (Levine et al., 1980) distingue siete grandes phyla, que reseñamos brevemente a continuación. El phylum Sarcomastigophora se caracteriza por poseer un único núcleo (excepto en los foraminíferos heterocarióticos); cuando existe sexualidad, ésta es por singamia; la movilidad es por flagelos, pseudópodos, o por ambos. Dentro de este grupo, el subphylum de los Mastigophora(caracterizado por trofozoitos con uno o más flagelos) incluye los fotosintéticos Fitomastigóforos estudiados igualmente por los ficólogos, y los Zoomastigóforos, un grupo polifilético con numerosos órdenes de interés parasitológico, como los Kinetoplastida -Trypanosoma, Leishmania, etc.-, losDiplomonadida -por ejemplo, Giardia-, los Trichomonadida, etc. El subphylum Opalinata, consta de protozos que presentan numerosos cilios cubriendo toda su superficie en filas oblicuas. Elsubphulum Sarcodina se distingue por la posesión de pseudópodos o de flujo protoplasmático sin pseudópodos auténticos; de existir flagelos, quedan restringidos a las fases de desarrollo. La mayor parte son de vida libre. En la superclase de los Rizópodos, existen dos órdenes con relevantes representantes parasitos, el Amoebida (con Entamoeba, Acanthamoeba, Iodamoeba, etc.) y elSchizopyrenida (con Naegleria); muy interesante es el orden Pelobiontida, cuyas especies (por ej.,Pelomyxa), carecen de mitocondrias, pero presentan bacterias endosimbióticas. La otra superclase, la de los planctónicos Actinópodos, consta de los clásicos radiolarios (ahora escindidos en dos nuevas clases) y de los Heliozoos. El phylum de los Labyrinthomorpha es considerado por algunos como un representante de "hongos inferiores" (véase más adelante, bajo la denominación de Labyrinthulomycetes). El phylum Apicomplexa se caracteriza por el llamado complejo apical, un conjunto de anillos polares, roptrias, micronemas, microtúbulos, etc., distinguibles a microscopio electrónico. Carecen de cilios, su sexualidad es por singamia, y todos son parasitos. Dentro de la subclase Coccidia, de la clase Sporozoea, encontramos géneros de interés clínico, como Eimeria, Isospora, Cryptosporidium, Toxoplasma, Plasmodium, etc. La subclase Piroplasmia incluye al género Babesia. El phylum Microspora es muy interesante por su gran antigüedad filogenética, probablemente anterior a la "radiación eucariótica" que se produjo con el establecimiento de las condiciones oxidantes en la atmósfera. Posee esporas unicelulares con pared imperforada y carece de mitocondrias. Son parasitos obligados de muchos grupos de animales. Un representante con interés "histórico" es el género Nosema. El phylum Ascetospora presenta esporas multicelulares con uno o más esporoplasmas; igualmente son de vida obligadamente parasitaria. El phylum Myxozoa se define por sus esporas de origen multicelular, con una o más cápsulas polares y esporoplasmas. Finalmente, en el phylum Ciliophora se engloban los protozoos con cilios, ya sea simples, ya sea formando orgánulos ciliares compuestos, al menos en alguna fase de sus ciclos de vida. Presentan dos tipos de núcleos. Su fisión binaria es transversal, pero se encuentran también fisión múltiple y gemación. La reproducción sexual puede ser por conjugación, por autogamia o por citogamia. Poseen vacuolas contráctiles. La mayoría son de vida libre, pero existen representantes parasitos (por ejemplo, Balantidium). La denominación de Hongos es igualmente muy ambigua, ya que define genéricamente a seres heterotróficos cuya estructura vegetativa suele ser multinucleada y cenocítica, en muchos casos de crecimiento miceliar. La historia filogenética de los hongos no se conoce bien; aparentemente, el modo de vida de estilo fúngico ha surgido en repetidas ocasiones durante la evolución. Los denominados a veces como "hongos inferiores" consisten en varios grupos distintos cuya única característica en común reside en la posesión de formas móviles en al menos alguna fase de su ciclo de vida. Los principales taxones son los siguientes: Los Labyrinthulomycetes: forman colonias de células vegetativas fusiformes que se mueven aparentemente por deslizamiento sobre pistas mucilaginosas en retículo, formadas por ellos mismos. Se han descrito isogametos undilipodiados en algunas especies. Los Acrasiomycetes (mixomicetes celulares, que los zoólogos estudiaban con el nombre de Micetozoos) presentan un ciclo vital asexual con varias fases, todas ellas haploides: una fase de amebas solitarias fagotróficas, que en condiciones de carencia de nutrientes se agregan hacia unos centros de aglomeración, originando un pseudoplasmodio celular migrador provisto de vaina, y que más tarde entra en fructificación, generando un cuerpo fructífero pedunculado en cuyo ápice las amebas se diferencian a esporas, que al germinar, cierran el ciclo. Los Myxomycetes (mixomicetes plasmodiales), al igual que los anteriores, presentan una fase de células ameboides (mixamebas) que pueden interconvertirse en células flageladas (y viceversa). Cada uno de estos tipos morfológicos puede diferenciarse en dos sexos opuestos, que tras su fusión producen un zigoto que, por sucesivas divisiones nucleares origina un plasmodio multinucleado osmotrófico e inmóvil. En condiciones adversas el plasmodio se diferencia en varias zonas en esporangios pedunculados, en cuyos ápices los núcleos sufren meiosis (frecuentemente degenerativa), produciéndose esporas haploides, cada una de las cuales genera una mixameba. Los Quitridiomycetes (ficomicetes acuáticos) poseen talo vegetativo a base de hifas ramificadas no septadas que se introducen en el sustrato (rizoides) y que se encuentra separado por un tabique transversal respecto de un esporangio multinucleado, con forma de saco. Éste puede ser un mitosporangio o un meiosporangio, liberando en ambos casos esporas undilipodiadas uninucleadas. Los Hyphoquitridiomycetes son microorganismos holocárpicos o eucárpicos con hifas, septadas o no, de los que se desconocen fases sexuales, siendo su órgano reproductivo un zoosporangio que produce esporas flageladas. Los Oomycetes son microoganismos filamentosos cenocíticos, cuyas formas vegetativas carecen de septos, siquiera parciales, estando separadas por un tabique de estructuras reproductoras masculinas (anteridios) y femeninas (oogonios); al ponerse en contacto ambos, el anteridio emite un tubo de fertilización por donde migran los núcleos masculinos al encuentro de los femeninos (oosferas). La reproducción asexual es por zoosporas flageladas. Los "hongos superiores" (algunas veces denominados Eumycetes) presentan en común las propiedades de producir esporas y carecer de undilipodios en todas las fase de sus ciclos vitales. Exceptuando los "Hongos Imperfectos", todos poseen reproducción sexual, que es por conjugación de hifas de signos opuestos. Exponemos a continuación una breve descripción de los grupos. Los Zygomycetes (ficomicetes terrestres) tienen un micelio no tabicado, a excepción de la separación entre la porción vegetativa y la reproductiva. Las esporas haploides (conidiosporas) se forman en un esporangio sostenido por un esporangióforo pedunculado. La reproducción sexual se produce por hifas especializadas (gametangios) de signos opuestos, que al fusionarse por sus ápices dan lugar a una estructura engrosada donde se produce la cariogamia, seguida de meiosis. En los Ascomycetes la fusión de las hifas sexuales de signo opuesto da origen a un saco o asca, donde se produce la meiosis (muchas veces seguida de una o dos mitosis), con formación de ascosporas haploides. La reproducción asexual se produce por fragmentación del extremos de ciertas hifas, originando conidiosporas. Los Basidiomycetes se caracterizan por un micelio primario joven a base de hifas monocarióticas, multinucleadas y aseptadas, que más tarde desarrollan septos transversales incompletos que delimitan porciones uninucleadas; dos segmentos de hifas de signo opuesto se conjugan, sin fusión de núcleos, dando una hifa dicariótica (que puede ser homocariótica o heterocariótica, dependiendo del homotalismo o heterotalismo de la especie); estos micelios dicarióticos desarrollan unas estructuras especiales, denominadas basidios, con forma de maza, en cuya superficie se forman lasbasidiosporas haploides por migración, a los esterigmas correspondientes, de los núcleos producidos tras la cariogamia y la subsiguiente meiosis. Los Deuteromycetes o Fungi Imperfecti constituyen una clase-forma, o sea, no suponen un grupo natural; abarcan todos los géneros de eumicetos de los que no se ha podido demostrar fase sexual, aunque algunos exhiben fenómenos de parasexualidad. Es posible que muchas especies carezcan en realidad de procesos sexuales, representando formas de Ascomicetos y Basidiomicetos que perdieron la capacidad de producir ascas y basidios. Aunque, como se ha indicado más arriba, la filogenia de los hongos no se conoce bien, se ha propuesto que los Ascomicetos y Basidiomicetos pueden provernir de algún antepasado de tipo zigomiceto, que a su vez puede mantener alguna relación evolutiva con otros organismos eucarióticos que se reproducen por conjugación (algas gamofitas o rodofitas). 2 CARACTERES DISTINTIVOS DE LOS PROCARIOTAS| a Contenidos Los estudiaremos sobre la base de su comparación con los eucariotas. DIFERENCIAS ENTRE PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

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Datos relativos a:	Procariotas	Eucariotas
Genóforo o nucleoplasma	Un solo cromosoma circular cerrado covalentemente	Varios cromosomas lineares terminados en telómeros
	No existe membrana nuclear (no hay núcleo)	Existe membrana nuclear (núcleo auténtico)
	No hay histonas asociadas al ADN	Histonas asociadas al ADN
División del material genético	No mitosis	Mitosis
Organización del citoplasma	No orgánulos eucarióticos	Orgánulos (mitocondrias, cloroplastos, RE, Golgi, centriolos, etc)
	No citosqueleto (no corrientes citoplásmicas, ni mov. ameboide)	Citosqueleto (corrientes citoplásmicas)
	Ribosomas tipo 70S	Ribosomas tipo 80S

OTROS RASGOS (NO UNIVERSALES) DE LOS PROCARIOTAS| a Contenidos

• No existen esteroles en las membranas, aunque muchas bacterias poseen un tipo de politerpenoides llamados hopanoides. Los únicos procariotas con esteroles son algunas especies de cianobacterias y de bacterias metilotrofas. Los micoplasmas (Mollicutes) presentan esteroles, pero los obtienen a partir de sus hospedadores eucarióticos.
• No existen cilios ni flagelos eucarióticos (tipo 9+2 fibrillas). Pero muchos procariotas se mueven por un tipo de flagelos totalmente distinto, constituidos por subunidades de una proteína, arrolladas helicoidalmente.
• Pared celular a base de una molécula exclusiva de procariotas: la mureína (=mucopéptido o peptidoglucano), excepto los Mollicutes (micoplasmas), que carecen de pared celular, y las Arqueobacterias, cuya pared celular no se basa en peptidoglucano.

Los rasgos distintivos de las Arqueobacterias serán estudiados en el capítulo correspondiente de la sección de Taxonomía Bacteriana.

En este curso de Microbiología General vamos a estudiar de modo casi exclusivo los microorganismos procarióticos, de modo que casi podríamos titular la parte principal de este curso como "Bacteriología General", si bien abordaremos igualmente sendas introducciones a la Virología y a la Inmunología. Diversos aspectos de los microorganismos eucarióticos son materia de estudio de otras asignaturas (Zoología, Botánica, Parasitología).