EPÓNIMOS

Epónimos relacionados con la biología

El experimento de Meselson-Stahl fue un experimento realizado en 1957 por Matthew Meselson y Franklin Stahlen el que se demostró que la replicación de ADN era semiconservadora. Una replicación semiconservadora es aquella en que la cadena de dos filamentos en hélice del ADN se replica de forma tal que cada una de las dos cadenas de ADN formadas consisten en un filamento proveniente de la hélice original y un filamento nuevo sintetizado.

El experimento permitió confirmar las teorías de James Watson y de Francis Crick sobre el método de replicación del ADN.

Resumen de los tres métodos postulados de síntesis de ADN.

Hipótesis

Para investigar la forma de replicación del ADN, Meselson y Stahl idearon una forma muy ingeniosa que se basa en dos premisas fundamentales, por una parte está el hecho de que el nitrógeno es uno de los principales elementos del ADN, y por la otra el nitrógeno posee dos isótopos que pueden ser distinguidos mediante técnicas de laboratorio.

Aunque el ¹⁴N es el isótopo más abundante del nitrógeno, el ADN es también viable con el isótopo ¹⁵N el cual es más pesado. El isótopo ¹⁵N no es radioactivo, solo es más pesado que el nitrógeno común.

De esta forma Meselson y Stahl mediante un inteligente planteo del experimento, en el que utilizaron bacterias y observaron cómo replicaban su ADN, pudieron obtener información que les permitió identificar el mecanismo de replicación del ADN y descartar ciertas teorías alternativas.

Desarrollo del experimento

Se realizó un cultivo de E. coli durante varias generaciones en un medio con ¹⁵N. Al extraer ADN de estas células y centrifugarlo en un gradiente de cloruro de cesio, las moléculas de ADN se situaban en el punto donde su densidad igualaba la del medio. El ADN de estas células tenía una mayor densidad que el de otras cultivadas con ¹⁴N. Posteriormente, las células de E. coli que sólo contenían ¹⁵N en su ADN se colocaron en un medio con ¹⁴N y se les permitió que se replicaran una sola vez. Se extrajo el ADN de estas células y se comparó con el preparado con ¹⁴N y con el preparado con ¹⁵N, encontrando que su densidad era prácticamente el promedio. Dado que una replicación conservadora hubiera producido iguales cantidades de ADN de mayor y menor densidad (pero sin producir ADN de una densidad intermedia), se descartó que la replicación siguiera el mecanismo conservador. Sin embargo, este resultado era consistente tanto con una replicación semiconservadora como con una de tipo dispersante. Una replicación semiconservadora hubiera dado por resultado una doble hélice de ADN donde un filamento tiene ¹⁵N mientras que el otro filamento tiene ¹⁴N, mientras que una replicación dispersante hubiera dado por resultado una doble hélice de ADN con ambos filamentos conteniendo mezclas de ¹⁵N y¹⁴N; en ambos casos la densidad del ADN tendría un valor promedio entre las densidades de los ADN de ¹⁵N y ¹⁴N.

Se extrajo ADN de células que habían crecido por varias generaciones en un medio con ¹⁵N, y a las que se les había permitido que realizaran dos replicaciones en un medio con ¹⁴N. Al analizar estas células se encontró que contenían cantidades iguales de ADN con dos densidades distintas, una igual a la obtenida tras una sola replicación en un medio con ¹⁴N, mientras que la otra correspondía al ADN producido exclusivamente con ¹⁴N. Este resultado era claramente inconsistente con una replicación dispersante, que hubiera dado como producto ADN con una densidad única e inferior a la de una sola generación, pero mayor que la de ¹⁴N, ya que el ADN original con ¹⁵N se habría repartido de forma uniforme entre todos los filamentos de ADN. Este resultado era consistente con una replicación semiconservadora, en cuanto a que la mitad del ADN de segunda generación tiene un filamento original con ¹⁵N y otro con ¹⁴N, lo que da como resultado un ADN con una densidad intermedia, mientras que la otra mitad del ADN contiene en su totalidad ¹⁴N --un filamento sintetizado en la primera división y otro en la segunda división. Este descubrimiento fue sumamente importante en el desarrollo de la biología y es de gran ayuda en la investigación y tratamiento de enfermedades (por ejemplo cáncer).

Experimento de Meselson y Stahl para probar el modelo semiconservativo de la replicación del ADN

		Meselson y Stahl prueban que el modelo semiconservativo de la replicación del ADN es correcto. Las figuras siguientes ilustran el experimento Meselson y Stahl que demostró lo correcto del modelo semiconservativo de la replicación del ADN. Usted será capaz de "correr" la centrifugación del CsCl ( cloruro de cesio) y ver la banda o bandas del ADN para cada condición de cultivo (el tubo derecho en cada caso), comparado con la banda control, marcada como 14N (ligera) del ADN ( tubo izquierdo). Haga Click sobre cada tubo de muestreo de ADN para correr la centrifugación. Haga Click sobre "de cerca" para más información sobre el Cloruro de Cesio. Las bacterias crecen en el medio 14N o 15N. Muestras removidas y el ADN extraído. Centrifugue las muestras de ADN haciendo click en los tubos de muestra de ADN de abajo.
		Descripción del experimento Meselson y Stahl  Meselson y Stahl probaron la hipótesis de la replicación del ADN. Ellos cultivaron bacterias en un medio 15N. El 15N es un isótopo pesado de nitrógeno, por lo tanto el ADN sintetizado es de densidad pesada. Ellos entonces cambiaron las bacterias al medio 14N. El ADN se aisló diferentes veces que corresponden a los ciclos de replicación 0, 1, y 2. Después de un ciclo de replicación, el ADN fue todo de densidad intermedia. Esto descarta el modelo conservador de la replicación, que predice que ambos ADN (pesado y liviano) estarán presentes, pero ninguno de densidad intermedia estará presente. Este resultado es consistente con el modelo semiconservativo de replicación, que predice que todas las moléculas de ADN consistirán de una cadena 15N de ADN y una cadena 14N de ADN. El resultado no descarta el modelo dispersivo de replicación, que también predice que todo el ADN será de densidad intermedia, consistiendo de segmentos intercalados de doble cadena 15N y 14N. Después de dos ciclos de replicación, se ven dos bandas de ADN, una de densidad intermedia y una de densidad liviana. Este resultado es exactamente lo que el modelo semiconservativo predice: la mitad debería ser densidad intermedia 15N-14N la intermedia y la mitad de densidad liviana 14N-14N. Este resultado descarta el modelo dispersivo de la replicación, que predice que después del ciclo 1 de replicación, la densidad del todas las moléculas de ADN, gradualmente llegarían a ser más bajas. Por lo tanto, ningún ADN de densidad intermedia intermedio debería permanecer después del ciclo 2. El modelo semiconservativo es correcto. Por todo el mundo, existen miles de científicos que realizan experimentos en cualquier momento. De vez en cuando un experimento es realizado y publicado que parece ser tan inteligente, tan importante y tan exitoso en sus metas que es destinado a ser aplaudido por científicos a lo largo y a lo ancho y es explicado en clases y aulas de ciencia durante varias décadas en el futuro. Sin embargo, con el paso del tiempo, estos llamados “experimentos clásicos” parecen mas dramáticos, mas ingenuos y mas claros de lo que eran en su tiempo contemporáneo al desaparecer las memorias de complicaciones, contradicciones y controversias. Sin embargo, lo que frecuentemente separa a estos experimentos clave no es de que no son particularmente complejos, si no que son elegantemente simples. El poder de la simplicidad en un experimento es que reduce el chance de explicaciones alternativas para los resultados. Como fue explicado en nuestro módulo Las ideas en la ciencia: teoría, hipótesis y leyes, una característica clave del método científico moderno es que hipótesis científicas validas predicen lo que puede ser examinado. Por ende, la examinación y comprobación de predicciones es una gran parte de la investigación científica y parte de la naturaleza histórica de muchos experimentos clásicos es que probaron las predicciones de una hipótesis científica clave de manera que proveía una respuesta clave. El experimento de 1958 por Matthew Meselson y Franklin Stahl es un ejemplo de tal experimento y es uno de los mas famosos en toda la biología molecular. Con un experimento diseñado inteligentemente, comprobaron las predicciones de tres diferentes hipótesis científicas simultáneamente y el campo de la biología de ADN fue cambiado por siempre.  to top Replicación de ADN Después del descubrimiento del ADN como el material genético (vea ADN I), el nuevo campo de biología molecular se enfocó atentamente en como funciona el ADN. Una de las características mas importantes del ADN es la habilidad de ser copiado con exactitud. Cuando una célula, ya sea de levadura, de bacteriao una célula humana, se divide en dos, ambas células resultantes son genéticamente idénticas entre si y a la célula madre original. Por ende, antes de la división, la célula de alguna manera tiene que copiar todo su ADN para que ambas células resultantes tengan el complemento completo de material genético. De hecho, los científicos como Edwin Chargaff y otros han observado que la cantidad de ADN en una célula se multiplica por dos antes de la división celular. El grupo de ADN después se divide en partesiguales entre las dos células hijas, para que ambas tengan la misma cantidad de ADN como la cantidad que tenía la célula madre original. ¿Pero como exactamente es que esta multiplicación de ADN sucede fue el primer misterio y los científicos comenzaron a proponer varios mecanismos posibles o “modelos de la replicación de ADN. Siguiendo la propuesta y eventualmente la aceptación del modelo Watson-Crick de la estructura delADN, biólogos moleculares creían de que cada hebra de ADN servía de una manera como una plantilla de copia para la síntesis de una nueva molécula de ADN (vea nuestro ADN II para mas información). Sin embargo, siguieron existiendo algunos acertijos. Lo mas importante es que los científicos tuvieron dificultad imaginándose como dos hebras de ADN que son inmensamente largas e interlazadas entre sí podían separarse sin resultar en algo rompiéndose o enrollarse demasiado. Adicionalmente, científicos se preguntaban como las dos hebras podían separarse dado el gran número de enlaces de hidrógeno que los mantiene juntos. Algunos visionaron la replicación sucediendo en pequeños momentos, mientras que otros se lo imaginaban un proceso continuo como una cremallera. Esta paradoja también causó a algunos científicos prominentes de ese entonces que dudaran por completo la estructura de doble hélice del ADN. Sin embargo, estudiantes comenzaron a trabajar en posibles soluciones teoréticas a la separación de dos hebras de ADN interlazadas y al final de la década de 1950, tres modelos hipotéticos para la síntesis de ADN habían sido debatidos: el modelo conservativo, el modelo semi-conservativo y el modelo dispersivo. La Figura 1 a continuación provee un diagrama de cada uno de estos mecanismos. Figura 1: Tres modelos rivales de replicación de ADN en las décadas de 1950 y 1960.image © N. Lents Brevemente declarado, el modelo conservativo de la replicación de ADN mantiene que cuando el ADN es replicado antes de la división celular, una de las dobles hebras reciben todas las replicaciones nuevas de ADN en ambas hebras, mientras que la otra recibe solamente las dos hebras originales de ADN en la célula madre. Sin embargo, el modelo semi-conservativo (también llamado “modelo de cremallera” por James Watson), mantiene de que las dos hebras originales de ADN se separan y las dos moléculas hijas consisten en una hebra “vieja” de ADN de la célula madre y una hebra nueva. Finalmente, el modelo dispersivo mantiene de que el ADN es copiado en pequeños momentos y que ambas hebras hijas de ADN reciben una mezcla del ADN original y el nuevo ADN. Cada uno de estos tres posibles modelos han sido propuestos por diferentes científicos y cada uno tenía ciertas ventajas en explicar la separación del ADN patrón interlazado. Sin embargo, la evidencia para desprivar o apoyar cualquiera de estos modelos eran escasos. Control de Comprensión In the 1950s, scientists were not sure whether DNA replicated. how DNA replicated. Ésto cambió cuando Matthew Meselson y Franklin Stahl, dos científicos trabajando en el Instituto de Tecnología de California (CalTech), construyeron un experimento ingenuo que probó todos los tres modelos al mismo tiempo. Para entender como este experimento funciona es importante recordar comoisótopos se comportan. Aunque un isótopo pesado de un átomo dado se comporta en una manera completamente normal en reacciones químicas, la presencia de uno (o mas) neutrones adicionales le da al átomo una masa atómica un poco mas grande. Como resultado, las moléculas que contienen estos isótopos son mas densas. Esta pequeña diferencia en densidad permite a los científicos que separen las moléculas físicamente con diferentes isótopos basadas en la diferencia de su densidad. Para su experimento, Meselson y Stahl utilizaron una forma especial de nitrógeno: 15N. Normalmente, casi todo el nitrógeno en cualquier célula es 14N y por ende contiene siete neutrones adicionales a los siete protones. Entonces 15N, con ocho neutrones es considerado “nitrógeno pesado” (pero no es radioactivo). Cuando células en crecimiento son alimentadas con nitrógeno pesado, el isótopo 15N entra al metabolismo de la célula y cantidades significantes del mismo serán incorporadas a los nucleótidosricos en nitrógeno y en ADN. Por ende las células de ADN cultivadas con 15N es su fuente alimenticia serían mas densas que células normales. El poder de tener ADN de diferentes densidades es que pueden ser separadas por centrifugación. Para este proceso, células fueron abiertas primero, después de eso el contenido celular (llamado el “extracto crudo”) fueron mezclados con una solución de sal cloruro de cesio y puestos en un tubo de centrífuga con cuarzo transparente que permitió que la solución fuese fotografiada mientras daba vueltas. La célula después fue dada vuelta en el tubo a velocidades muy altas por muchas horas y los iones con mucho cesio fueron jalados hacia abajo de la célula por fuerza centrífuga. Eventualmente el equilibrio se alcanzó y un “gradiente de densidad” fue establecido en la célula con la parte de abajo conteniendo la concentración mas alta de cesio y la parte de arriba del tubo conteniendo la concentración mas baja. Adentro de un gradiente de densidad como este, todas las moléculas de un extracto de célula incluyendo el ADN “flotarán” o se “hundirán”, migrando al lugar en el gradiente que corresponde a su densidad. Las moléculas mas densas fueron jaladas hacia la parte de abajo de una célula, mientras que las moléculas mas livianas se mantienen mas arriba en la célula, como se puede ver en la Figura 2. Figura 2: El principio de la centrifugación de gradiente de densidad. Cuando una solución líquida que contiene una proteína grande de componentes de ADN se coloca en un tubo de ensayo o de centrífuga y se da vuelta a una alta velocidad durante muchas horas, las moléculas individuales se separan basándose en su densidad. Las moléculas mas densas caen y las menos densas suben.image © N. Lents Antes de comenzar su análisis de replicación de ADN, Meselson y Stahl primero mostraron de que el ADN que consiste de 14N puede ser separado del ADN que contiene 15N. Alcanzaron esto al cultivar dos grupos separados de bacteria de Escherichia coli, alimentando a cada grupo un isótopo de nitrógeno diferente. Después, abrieron las células bacteriales mezcladas con extractos de ambos grupos en una célula centrífuga y le dieron vuelta para establecer el gradiente de densidad. Para detectar el ADN, lo alumbraron con luz ultravioleta (UV) en la centrífuga en movimiento debido a que el ADN absorbe luz UV y por ende forma una sombra durante la exposición a película fotográfica. Figura 3: La centrifuga del gradiente de densidad de una mezcla de 15N y 14N. Meselson y Stahl primero mostraron que pueden separar una mezcla de ADN de las dos diferentes densidades. La imagen a la izquierda es una fotografía UV mostrando la alineación en bandas del ADN de diferentes densidades después de la centrifugación. La gráfica a la derecha muestra es un trazo de la intensidad de las bandas en la foto.image © Meselson and Stahl Control de Comprensión Meselson and Stahl used 15N because it caused DNA molecules to become more dense. radioactive. Después, Meselson y Stahl realizaron algo interesante. Criaron un gran grupo de bacteria en nitrógeno pesado (15N) y después cambiaron la bacteria a una dieta que contenía solamente nitrógeno regular (14N). Esto les permitió distinguir entre el ADN pre-existente de las células paternales y ADN recién sintetizado, debido a que todas las hebras recién sintetizadas contenían 14N y son menos densas. Utilizaron este arreglo experimental para poner a prueba los tres posibles modelos de replicación de ADN. Como todas las hipótesis científicas propias, cada uno de los tres modelos de replicación de ADN hace ciertas predicciones y la comprobación de predicciones hipotéticas es una parte clave de la investigación científica. En el caso del experimento de Meselson y Stahl, las predicciones que hace cada uno de estos modelos son los siguientes. Si el modelo conservativo de la replicación de ADN es verdadero, entonces uno predicaría de que las células bacteriales cultivadas para una generación (20 minutos) con 14N tuvieran dos diferentes tipos de ADN: el ADN original sería la densidad de ADN cultivado con solamente nitrógeno 15N, mientras que ambas hebras del nuevo ADN serían la banda mas liviana 14N. Sin embargo, si cualquiera de los modelos de la replicación de ADN, el semi conservativo o dispersivo están correctos, el ADN de doble hebra dentro de una bacteria después de una generación sería una mezcla de ADN nuevo y ADN viejo y por ende, una hebra estaría compuesta de 15N y una hebra estaría compuesta de de14N. Por ende, este ADN “hibrido” podría ser una densidad intermedia entre bandas ADN de 15N 14N. En la figura 4 a continuación, se puede ver lo que predicen los tres modelos de replicación de ADN que va a suceder en el experimento de Meselson y Stahl, seguido por lo que observan en realidad. Figura 4: El gradiente de densidad de E. coli y el ADN después de una división celular. Panel de arriba: las tres predicciones experimentales de tres modelos competidores de la replicación de ADN. Panel de abajo: Los datos actuales. E. coli criado en 15N fueron cambiados a 14N y luego fueron cosechados en cinco diferentes puntos de tiempo. El ADN fue centrifugado resultando en el patrón de banda que se muestra aquí.image © N. Lents/Meselson and Stahl Como se puede ver de los resultados arriba, después de una generación de división celular, el ADN total de la bacteria creciente tiene una densidad intermedia, como la densidad entre N y 15N DNA. Esto fuertemente refutó el modelo conservativo de ADN, el cual mantuvo que las dos hebras originales del ADN persistirían y se mantienen ligados a si mismo y una nueva copia de dos hebras de ADN serían sintetizadas. En otras palabras, el modelo conservativo de la replicación de ADN predeciría , después de una generación, la mitad de las moléculas de ADN tendrían solamente ADN 15N y la otra mitad tendría ADN 14N, la cual aparecería como dos bandas distintas de densidad de ADN. Pero como es visto aquí, todas las moléculas de ADN eran de densidad intermedia. Sin embargo, los dos modelos restantes, el semi conservativo y el dispersivo, aún eran consistentes con estos resultados. De manera de examinar los dos modelos restantes de la replicación de ADN, debemos examinar generaciones adicionales de crecimiento de bacterial con el isótopo normal de nitrógeno 14N. En la figura 5 a continuación están las predicciones de los tres modelos de replicación de ADN a través de múltiples generaciones: Figura 5: Predicciones experimentales de tres modelos competidores de la replicación de ADN a través de tres generaciones.image © N. Lents Y ahora, aquí están las observaciones de Meselson y Stahl (Figura 6): Figura 6: La centrífuga del gradiente de densidad de ADN E. Coli a través de múltiples generaciones. E. coli criado en15N fueron cambiados a 14N y después cosechados en nueve diferentes puntos de tiempo. El ADN fue centrifugado resultando en un patrón de bandas mostrado aquí.image © Meselson and Stahl Mientras las células bacteriales crecían y se dividían más, Meselson y Stahl observaron de que la bandaADN 15N desaparecía y una banda de ADN 14N aparecía y después se ponía progresivamente mas obscura y una banda de densidad intermedia aparecía y persistía en la misma intensidad. Esto descrédito fuertemente el modelo dispersivo de la replicación de ADN, el cual predijo de que solo una banda de ADN existiría y se haría progresivamente menos densa que la cantidad de ADN 14N el la mezcla dispersiva incrementaba con cada generación. Por ende, en un simple experimento con resultados bien claros, Meselson y Stahl refutaron sólidamente dos de los posibles modelos de replicación de ADN, al mismo tiempo apoyando fuertemente otro posible modelo.