La histología es la rama de la anatomía que estudia a los tejidos de los animales y las plantas. Esta obra, sin embargo, se dedica a los tejidos animales, y de manera más específica a los del hombre. En su aspecto más amplio, el término histología se utiliza como si fuera sinónimo de la anatomía microscópica, porque su material abarca no solo la estructura microscópica de los tejidos, sino también los de las células, los órganos y los sistemas orgánicos.
Debe comprenderse que el cuerpo está estructurado por (a) células, (b) matriz intercelular y un líquido, el líquido tisular (líquido extracelular), que baña a estos componentes. El líquido tisular, que se deriva del plasma sanguíneo, transporta nutrientes, oxígeno, y moléculas de señalamiento a las células del cuerpo. A la inversa, las moléculas de señalamiento, los productos de desecho y el dióxido de carbono descargados por las células del cuerpo llegan a la sangre y a los vasos linfáticos en el liquido tisular. Este líquido, los mismo que gran parte de la matriz intercelular, no son visibles en las preparaciones histológicas ordinarias, pero aún así el estudiante de histología debe percatarse de su presencia invisible.
La histología ya no se dedica nada más a la estructura del cuerpo; sino también a su función . De hecho, el tema básico de la histología guarda una relación directa con otras disciplinas, y es esencial para la comprensión de ellas. Este texto, por tanto, se entremezcla con las disciplinas de biología celular, bioquímica, fisiología y, según se considere apropiado, patología. El estudiante reconocerá la importancia de este tema al referirse al texto más adelante en su carrera. Se pondrá de manifiesto un ejemplo excelente de esta relación cuando el lector se percate de la histología del riñón y observe que la histología intrincada y casi sublime de ese órgano (hasta llegar al nivel molecular) es la encargada de la capacidad para efectuar su función. Las alteraciones de la estructura del riñón serán la causa de gran número de trastornos que ponen en peligro la vida.
En lo que resta de este capítulo se hablara de los métodos que emplean los histólogos para estudiar la anatomía microscópica del cuerpo.
Microscopia de la luz
Etapas de la preparación tisular
Se han desarrollado diversas técnicas para preparar los tejidos para su estudio, de modo que se parezcan muy de cerca a su estado viviente natural. Las etapas son fijación, embebimiento en un medio adecuado, corte en rebanadas delgadas que permitan ver las características por transiluminación, montaje sobre una superficie para facilitar la manipulación y tinción a fin de que se puedan distinguir los diversos componentes tisulares y celulares.
Fijación
El término fijación se refiere al tratamiento del tejido con agentes químicos que no sólo retardan la aparición de alteraciones del tejido después de la muerte (o después de retirarlo del cuerpo), Sino que además conservan su estructura normal. Los agentes fijadores empleados con mayor frecuencia para la microscopia de la luz son formaldehído amortiguado neutro y líquido fijador de Bouin. Ambas sustancias se fijan de manera cruzada con las proteínas, por lo que conservan una imagen del tejido como si estuviera vivo.
Deshidratación y aclaramiento
Como una gran parte de los tejidos consiste en agua, se utiliza una serie de baños en alcohol que se inician con la concentración de 50% y progresan en etapas graduadas de alcohol hasta la concentración de 100% para retirar toda el agua (deshidratación). A continuación el tejido se trata con xileno, sustancia química que se puede mezclar con parafina fundida. Este proceso se conoce como aclaramiento, puesto que el tejido se vuelve transparente por la acción del Xilol.
TIPOS DE MICROSCOPÍA QUE SE REALIZAN EN EL CENTRO
Microscopía de luz transmitida - campo claro
Es el método de microscopía óptica más usual, ya que con su ayuda se pueden observar sencilla y rápidamente los preparados bien contrastados o teñidos (p.ej. frotis sanguíneos).
Microscopia de luz trasnmitida- campo oscuro
Se utiliza para preparados biológicos no teñidos, tales como bacterias o cultivos celulares vivos, muy a menudo no o casi no se pueden reconocer en luz transmitida - campo claro debido a su transparencia. Esto cambia decisivamente al observar tales preparados en luz transmitida - campo oscuro porque aquí la apertura de la iluminación que se utiliza para iluminar el preparado es más grande que la del objetivo empleado.
En campo oscuro solamente los rayos de luz difractados y dispersados, que son importantes para Is formación de la imagen, penetran en el objetivo, mientras que los haces de luz directos, no influenciados, pasan por delante del objetivo. Entre otras cosas, a esto se debe que hasta estructuras finas, que en parte están fuera del poder resolutivo del microscopio óptico, pueden ser resueltas, apareciendo claramente brillantes sobre un fondo oscuro.
Microscopia de luz transmitida- Contraste de fases
El contraste de fases es el método de microscopía ideal para examinar preparados delgados y no teñidos, tales como cultivos de células. El ojo humano no está en condiciones de percibir las diferencias de fases; (diferencias de índices de refracción y diferencias de espesores) existentes entre los diferentes componentes de las células.
El método del contraste de fases utiliza los moduladores ópticos "diafragma anular de fases y anillo de fases", así como los procedimientos de interferencia en la formación de la imagen intermedia, para convertir las tenues diferencias de fases en diferencias de intensidad y color visibles por los ojos.
El canal óptico anular, definido por el diafragma anular de fases y el anillo de fases, sirve para atenuar las partes de luz intensas y directas, y ocasionar un desplazamiento de fase constante, Las partes de luz indirectas difractadas en diferentes componentes de las células, por el contrario, pasan por delante de este canal óptico y son influenciadas en cuanto a sus fases por las diferencias de los índices de refracción y espesores en el preparado,
Después de experimentar estas diferentes influencias, los rayos parciales se interfieren en el plano de la imagen intermedia y se intensifican o se atenúan según sean las posiciones de las fases. El resultado de estas interferencias son contenidos de imagen con diferencias de intensidad y color que son percibibles por el ojo humano.
Microscopia de luz transmitida-Constraste Diferencial Interferencial (DIC)
El método DIC con luz transmitida es un procedimiento de contraste alternativo a la polarización y permite la representación de detalles transparentes de los preparados con contrastes fuertes y en relieve.
La luz polarizada linealmente por un polarizador es desdoblada en dos rayos parciales por un prisma birrefringente. Estos rayos atraviesan a poca distancia dos detalles adyacentes del preparado y experimentan allí distintas diferencias de trayectorias a causa de las diferencias en el índice de refracción y el espesor del preparado. Luego, los dos rayos parciales son unidos en un segundo prisma birrefringente .y, habiendo atravesado e analizador, tienen la misma dirección de oscilación. Así, ambos rayos parciales pueden interferir entre si en la imagen intermedia, siendo convertidas las distintas diferencias de trayectorias en diferentes valores acromáticos (intensidades). Posteriormente, un compensador λ (placa lambda) convierte los valores acromáticos en colores.
Microscopia de luz reflejada- Epi-fluorescencia
Gracias a una lámpara especial, generalmente de mercurio, que se coloca en el microscopio y que actúa emitiendo una luz excitadora de los fluorocromos, con los que se tiñen las muestras a observar.El método de la epi-fluorescencia posibilita la representación bien contrastada de estas sustancias fluorescentes en los colores típicos para la fluorescencia. En el microscopio para epi-fluorescencia, la luz generada por esta lámpara potente pasa por un filtro antitérmico para llegar al filtro excitador (pasabanda). La radiación de excitación de ondas cortas filtrada es reflejada por un separador de rayos dicromático y enfocada por el objetivo al preparado. El preparado absorbe a radiación de ondas cortas para emitir después una radiación fluorescente de ondas más largas (principio de Stoke), la cual es abarcada por el objetivo y transmitida por el separador de rayos dicromático. Finalmente, los rayos pasan por un filtro supresor (paso largo/pasabanda), el cual permite el paso sólo a la radiación de ondas largas emitida por el preparado,.
Las características espectrales de los filtros excitador y supresor tienen que adaptarse entre sí con alta precisión. Se encuentran en un módulo reflector FL P&C junto con el correspondiente separador de rayos dicromático.
Microscopía ConfocalLa microscopía confocal, a diferencia de la microscopía de fluorescencia convencional, permite eliminar la señal fluorescente que proviene de una muestra semitranslúcida y que está fuera de foco, con lo cual se consiguen, de forma no destructiva, secciones ópticas a diferentes planos de la muestra. Estas secciones pueden ser utilizadas para hacer un análisis tridimensional o para la observación de una parte interna de la muestra.
La microscopía confocal produce un aumento significativo de la resolución óptica y del contraste de las
imágenes, ventajas que la convierten en una herramienta imprescindible en la obtención de imágenes de alta resolución y en estudios de colocalización. La microscopía confocal de reflexión sigue los mismos principios que la anterior, en este caso se recoge la luz reflejada por la muestra.
Las secciones ópticas obtenidas por microscopía confocal contienen la información para poder hacer posteriormente un análisis tridimensional: cuantificación volumétrica, distribución de la fluorescencia, análisis de la colocalización, etc.
Es el método de microscopía óptica más usual, ya que con su ayuda se pueden observar sencilla y rápidamente los preparados bien contrastados o teñidos (p.ej. frotis sanguíneos).
Microscopia de luz trasnmitida- campo oscuro
Se utiliza para preparados biológicos no teñidos, tales como bacterias o cultivos celulares vivos, muy a menudo no o casi no se pueden reconocer en luz transmitida - campo claro debido a su transparencia. Esto cambia decisivamente al observar tales preparados en luz transmitida - campo oscuro porque aquí la apertura de la iluminación que se utiliza para iluminar el preparado es más grande que la del objetivo empleado.
En campo oscuro solamente los rayos de luz difractados y dispersados, que son importantes para Is formación de la imagen, penetran en el objetivo, mientras que los haces de luz directos, no influenciados, pasan por delante del objetivo. Entre otras cosas, a esto se debe que hasta estructuras finas, que en parte están fuera del poder resolutivo del microscopio óptico, pueden ser resueltas, apareciendo claramente brillantes sobre un fondo oscuro.
Microscopia de luz transmitida- Contraste de fases
El contraste de fases es el método de microscopía ideal para examinar preparados delgados y no teñidos, tales como cultivos de células. El ojo humano no está en condiciones de percibir las diferencias de fases; (diferencias de índices de refracción y diferencias de espesores) existentes entre los diferentes componentes de las células.
El método del contraste de fases utiliza los moduladores ópticos "diafragma anular de fases y anillo de fases", así como los procedimientos de interferencia en la formación de la imagen intermedia, para convertir las tenues diferencias de fases en diferencias de intensidad y color visibles por los ojos.
El canal óptico anular, definido por el diafragma anular de fases y el anillo de fases, sirve para atenuar las partes de luz intensas y directas, y ocasionar un desplazamiento de fase constante, Las partes de luz indirectas difractadas en diferentes componentes de las células, por el contrario, pasan por delante de este canal óptico y son influenciadas en cuanto a sus fases por las diferencias de los índices de refracción y espesores en el preparado,
Después de experimentar estas diferentes influencias, los rayos parciales se interfieren en el plano de la imagen intermedia y se intensifican o se atenúan según sean las posiciones de las fases. El resultado de estas interferencias son contenidos de imagen con diferencias de intensidad y color que son percibibles por el ojo humano.
Microscopia de luz transmitida-Constraste Diferencial Interferencial (DIC)
El método DIC con luz transmitida es un procedimiento de contraste alternativo a la polarización y permite la representación de detalles transparentes de los preparados con contrastes fuertes y en relieve.
La luz polarizada linealmente por un polarizador es desdoblada en dos rayos parciales por un prisma birrefringente. Estos rayos atraviesan a poca distancia dos detalles adyacentes del preparado y experimentan allí distintas diferencias de trayectorias a causa de las diferencias en el índice de refracción y el espesor del preparado. Luego, los dos rayos parciales son unidos en un segundo prisma birrefringente .y, habiendo atravesado e analizador, tienen la misma dirección de oscilación. Así, ambos rayos parciales pueden interferir entre si en la imagen intermedia, siendo convertidas las distintas diferencias de trayectorias en diferentes valores acromáticos (intensidades). Posteriormente, un compensador λ (placa lambda) convierte los valores acromáticos en colores.
Microscopia de luz reflejada- Epi-fluorescencia
Gracias a una lámpara especial, generalmente de mercurio, que se coloca en el microscopio y que actúa emitiendo una luz excitadora de los fluorocromos, con los que se tiñen las muestras a observar.El método de la epi-fluorescencia posibilita la representación bien contrastada de estas sustancias fluorescentes en los colores típicos para la fluorescencia. En el microscopio para epi-fluorescencia, la luz generada por esta lámpara potente pasa por un filtro antitérmico para llegar al filtro excitador (pasabanda). La radiación de excitación de ondas cortas filtrada es reflejada por un separador de rayos dicromático y enfocada por el objetivo al preparado. El preparado absorbe a radiación de ondas cortas para emitir después una radiación fluorescente de ondas más largas (principio de Stoke), la cual es abarcada por el objetivo y transmitida por el separador de rayos dicromático. Finalmente, los rayos pasan por un filtro supresor (paso largo/pasabanda), el cual permite el paso sólo a la radiación de ondas largas emitida por el preparado,.
Las características espectrales de los filtros excitador y supresor tienen que adaptarse entre sí con alta precisión. Se encuentran en un módulo reflector FL P&C junto con el correspondiente separador de rayos dicromático.
Microscopía ConfocalLa microscopía confocal, a diferencia de la microscopía de fluorescencia convencional, permite eliminar la señal fluorescente que proviene de una muestra semitranslúcida y que está fuera de foco, con lo cual se consiguen, de forma no destructiva, secciones ópticas a diferentes planos de la muestra. Estas secciones pueden ser utilizadas para hacer un análisis tridimensional o para la observación de una parte interna de la muestra.
La microscopía confocal produce un aumento significativo de la resolución óptica y del contraste de las
imágenes, ventajas que la convierten en una herramienta imprescindible en la obtención de imágenes de alta resolución y en estudios de colocalización. La microscopía confocal de reflexión sigue los mismos principios que la anterior, en este caso se recoge la luz reflejada por la muestra.
Las secciones ópticas obtenidas por microscopía confocal contienen la información para poder hacer posteriormente un análisis tridimensional: cuantificación volumétrica, distribución de la fluorescencia, análisis de la colocalización, etc.
Embebimiento o infiltración
Con el objeto de distinguir las células sobrepuestas en un tejido y la matriz extracelular de otro, los tejidos deben embeberse en un medio apropiado, y a continuación, cortarse en rebanadas delgadas. Para la microscopia de la luz el método ordinario es parafina. Se coloca el tejido en un envase adecuado de parafina fundida hasta que quede totalmente infiltrado. Una vez que el tejido ha quedado impregnado de parafina, se coloca en un recipiente pequeño, se cubre con parafina fundida y, a continuación, se permite que ocurra el endurecimiento, con lo que se forma un bloque de parafina que contendrá el tejido.
Corte
Una vez que se rebajan los cortes del tejido para eliminar el material de embebimiento en exceso, se montan para el corte con un micrótomo. Este aparato está equipado con una hoja y un brazo que hace avanzar el bloque tisular en incrementos iguales específicos. Para la microscopia de luz el espesor de cada corte es de 5 a 10 micras (um).
Los cortes se pueden efectuar también en ejemplares congelados en nitrógeno líquido o sobre la barra de congelación rápida de crióstato. Estos cortes se montan en un medio de congelación rápida, y se cortan a temperaturas por debajo de los cero grados centígrados mediante una hoja de acero enfriada previamente. Los cortes se colocan en laminillas de vidrio también enfriadas de antemano, se permite que el montaje alcance la temperatura ambiental y se tiñe con colorantes especiales (o se tratan para histoquímica).
Montaje y tinción
Los cortes de parafina para la microscopia de luz ordinaria que se efectúan con hojas de acero inoxidable, se colocan (montan) sobre laminillas de vidrio (porta objetos) cubiertas con material adherente. Como muchos constituyentes tisulares tienen aproximadamente las mismas densidades ópticas, deben teñirse para microscopia de luz. La tinción para microscopia de luz se efectúa principalmente con colorantes hidrosolubles. Por tanto, primero se retira la parafina del corte y, a continuación, el tejido se rehidrata y se tiñe. Después de la tinción el corte se deshidrata una vez más de modo que pueda fijarse de manera permanente en el portaobjetos con un medio de montaje adecuado. El cubreobjetos no sólo protege al tejido del daño, sino que además se requiere para poder ver el corte con el microscopio.
Aunque existen varios tipos de tinciones que se han desarrollado para ver muchos componentes de las células y los tejidos, se pueden agrupar en tres clases: tinciones que distinguen entre los componentes ácidos, básicos de la célula; tinciones especializadas que distinguen a los componentes fibrosos de la matriz extracelular, y sales metálicas que se precipitan en los tejidos y forman depósitos metálicos en ellos.
La tinción empleada más a menudo en histología es la de hematoxilina y eosina, técnica a la que se hace frecuentemente referencia como H y E. La hematoxilina es una base que brinda un tinte azuloso preferencialmente a los componentes ácidos de la célula. Como la mayor parte de los componentes.
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