Estudios de la Histología humana

Coloraciones y reacciones histológicas frecuentes

ácidos son DNA y RNA, el núcleo y ciertas regiones de citoplasma se tiñen de color azul obscuro. Se denominan componentes basófilos. La eosina es un ácido que imparte una coloración sonrosada a los componentes básicos de la célula. Como muchos constituyentes citoplásmicos tiene pH básico, las regiones del citoplasma se tiñen de color sonrosada. Se dice que estos elementos son acidófilos. Se utilizan también otras muchas tinciones para preparar ejemplares para estudio histológico (cuadro 1-1c).
Las moléculas de ciertas tinciones como el azul de toluidina, se polimerizan entre sí cuando se exponen a concentraciones elevadas de polianiones en un tejido. Estos agregados adoptan un color diferente al de sus moléculas individuales. Por ejemplo, el azul de toluidina tiñe de azul a los tejidos, salvo los que son ricos en polianiones (p. ej., matriz cartilaginosa y gránulos de los mastocitos) , que adoptan un color purpúreo. Se dice que el tejido o el componente celular que se tiñe de color purpúreo con este colorante es metacromático, y se dice que el azul de toluidina hace manifiesta a la metacromasía.
Microscopio de luz
El microscopio de luz actual recurre a una distribución específica de grupos de lentes para amplificar las imágenes (fig. 1-1e). Como se emplea más de una lente, este instrumento se conoce como microscopio compuesto. La fuente luminosa es un bulbo eléctrico con filamento de tungsteno cuya luz es dirigida a un solo punto por la lente condensadora.
El haz luminoso se localiza por debajo y se enfoca sobre la preparación en estudio. La luz que pasa a través de la preparación entra en una de las lentes objetivos; estas lentes se encuentran asentadas sobre una torreta movible localizada justamente por arriba de la preparación. Por lo general estos instrumentos disponen de cuatro lentes objetivos en una sola torreta, que brindan amplificaciones baja; media, alta y de inmersión en aceite. Las tres primeras lentes efectúan amplificaciones de 4, 10, 40 veces, respectivamente, y se emplean sin aceite; la lente de inmersión en aceite amplifica la imagen 100 veces.
La imagen de la pieza ocular capta y amplifica en mayor grado aún la imagen proveniente de la lente objetivo. Esta lente suele amplificar la imagen por un factor de 10, lo que da por resultado amplificaciones de 40, 100, 400 y 1000 veces y enfoca la imagen resultante sobre la retina.
El enfoque de la imagen se efectúa con los tornillos estriados de las cremalleras que mueven a las lentes objetivos hacia arriba y hacia abajo por encima de la preparación. El tornillo de enfoque grueso mueve a las lentes en incrementos mayores que el tornillo de enfoque fino o milimétrico. Es interesante observar que la imagen proyectada sobre la retina está invertida de derecha a izquierda, y que se encuentra orientada de arriba hacia abajo.

La mayoría de los tejidos, sobre todo los de los animales, son incoloros y por ello necesitamos teñirlos para observar sus características morfológicas. Las tinciones generales están basadas en el uso de colorantes, sustancias mediante las cuales se consigue colorear a los tejidos. Los colorantes son normalmente hidrosolubles y se caracterizan por unirse a ciertas moléculas presentes en los tejidos gracias a afinidades electro-químicas. Se utilizan normalmente para teñir a las células y componentes tisulares que van a ser observados con el microscopio óptico y por ello se realizan habitualmente sobre secciones de tejido, siendo las más utilizadas las secciones obtenidas a partir de inclusiones en parafina u obtenidas en el criostato. Los colorantes son los elementos principales de las tinciones generales. Son moléculas que poseentres componentes importantes: un esqueleto incoloro, que normalmente es un anillo aromático de benceno, al cual se le unen dos tipos de radicales: uno que aporta el color, denominadocromóforo, y otro que posibilita la unión a elementos del tejido denominado auxocromo. Al conjunto de estos tres elementos unidos en una molécula se denomina cromógeno.

Según la naturaleza química del cromóforo hay varios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos, derivados de la antroquinona, derivados de la acridina, derivados de iminas quinónicas, derivados de diferrilmetano y triferrilmetano, derivados del xanteno y derivados de las talocianinas.

Según la naturaleza química del radical auxocromo los colorantes se clasifican en:

Básicos: son sales en las que la base aporta el color, mientras que la parte ácida es incolora. Tienen apetencia por sustancias ácidas del tejido como el ADN o ciertos componentes de la matriz extracelular como los glicosaminoglicanos. Así, ponen de manifiesto el núcleo y el ARN, sobre todo el ARNr presente en los ribosomas por ser muy abundante, así como ciertas matrices extracelulares ricas en componentes ácidos. Ejemplos de colorantes básicos son la tionina, safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o la hematoxilina

Ácidos: son sales con el anión coloreado y la base incolora. Tienen apetencia por sustancias básicas, sobre todo estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular y también por el colágeno de la matriz extracelular. Ejemplos de colorantes ácidos son la fucsina ácida, verde rápido, naranja G o la eosina.

Neutros: poseen una porción ácida y otra básica, ambas con capacidad para aportar color. Por tanto un mismo colorante puede teñir tanto las partes básicas como las ácidas de los tejidos. Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno.

Indiferentes: realmente no se unen a elementos de los tejidos por afinidad química sino porque se disuelven en ellos. Por ejemplo, el colorante sudán se disuelve en los lípidos y por tanto teñirá a las gotas de lípidos, especialmente en los adipocitos.

En algunas ocasiones necesitamos resaltar elementos tisulares de manera específica y para ello usamos colorantes que tienen apetencia por dichas estructuras. Por ejemplo, la tinción denominada azán contiene azocarmín y naranja-anilina-ácido acético que tiñe los núcleos de rojo y sobre todo destaca el conectivo intensamente teñido de azul. Otra tinción combinada es el tricrómio de Mallory que tiñe el colágeno de verde, las células musculares de rojo.

Cuando un colorante se une al tejido y refleja un color diferente al que tiene en solución se dice que ha ocurrido un fenómeno de metacromasia. Esto se debe a que las propiedades de absorción de la luz del colorante cambian al unirse a componentes celulares. Por ejemplo, el azul de toluidina se vuelve púrpura cuando se une a ciertos gránulos de los mastocitos. Cuando el colorante unido al tejido tiene el mismo color que en solución se denomina ortocromasia.

Tinción general. Una de las tinciones más comúnmente usada en histología es lahematoxilina-eosina sobre cortes de parafina. Como vemos se usa un colorante básico y otro ácido para teñir de diferente color a las estructuras ácidas y básicas de la célula. Antes de proceder a la tinción, si partimos de cortes de parafina, tenemos que llevar a cabo unos tratamientos previos sobre las secciones como es el desaparafinado, y la hidratación puesto que estos colorantes son hidrosolubles. Si partimos de cortes de criostato esto no se lleva a cabo.

Sección de un glomérulo de un riñón de mamífero obtenida a partir de una inclusión en parafina y teñido con hematoxilina-eosina. Los núcleos aparecen de color violáceo (hemtoxilina) y el citoplasma de color rosado (eosina).

Pasos que se siguen durante una tinción general de hematoxilina-eosina. Los tiempos son aproximativos porque dependen del grosor de los cortes y de la concentración de los colorantes. El desparafinado permite eliminar el medio de inclusión, la parafina. El paso por agua de grifo es típico de la hematoxilena y se denomina diferenciación. Las sales del agua permiten obtener una coloración más violácea, en vez de púrpura. La deshidratación final es necesaria porque el medio de montaje no suele ser hidrosoluble. Estos medios de montaje no afectan al tejido, ni a los colorantes y tienen unas propiedades ópticas excelentes. Además, conservan las preparaciones durante años en buenas condiciones. Tras el montado y secado (evaporación del xileno), las secciones se puede observar con el microscopio óptico.

Tinción de semifinos. Cuando se procesa material para microscopía electrónica es necesario, a veces, hacerse una idea de qué zona del tejido vamos a cortar. Téngase en cuenta que el área de una sección para observar con el microscopio electrónico es muy pequeña. Además, el proceso de osmificación que ha de llevarse a cabo previamente a la inclusión acarrea el oscurecimiento del tejido, con lo que dificulta aún más la orientación de la muestra. Por ello es frecuente hacer secciones de 0.5 a 1 µm de grosor con el ultramicrotomo para orientarnos en la muestra y seleccionar la zona a partir de la cual haremos las secciones ultrafinas. Los semifinos suelen tener áreas más grandes que las que posteriormente vamos a usar para la obtención de las secciones ultrafinas. El colorante usado para teñir secciones semifinas es normalmente el azul de toluidina, el cual puede infiltrase en la resina calentada en un plancha y llegar hasta el tejido.

Sección semifina de un glomérulo de un riñón obtenida a partir de una inclusión en resina y teñida con azul de toluidina.

Proceso de tinción de una sección semifina. La porosidad de la resina, el calor y las propiedades del colorante (azul de tolouidina) hacen que se pueda teñir el tejido sin necesidad de eliminar previamente la resina .

Contraste de ultrafinos. El contraste no es una tinción, puesto que no aporta color a la muestra, pero sí es un proceso habitual para poder observar los componentes ultraestructurales de la célula. Por ese motivo lo incluimos en este apartado. Aunque las secciones para microscopía electrónica se pueden observar directamente con el microscopio electrónico se suelen tratar previamente con metales pesados en un proceso denominado contraste, obteniendo así una imagen óptima de la ultraestructura celular. Téngase en cuenta que en la microscopía electrónica lo importante no es añadir sustancias coloreadas sino moléculas que puedan interferir con el camino de los electrones emitidos por el microscopio y que chocan contra la muestra. Los electrones que logran atravesar la muestra inciden sobre una pantalla fosforescente que emitirá destellos de luz cuando reciban el impacto de un electrón y permite observar las características del tejido. Los metales pesados unidos al tejido impedirán que pasen los electrones y por tanto se verá una zona negra en la pantalla fosforescente, mientras que en aquellas zonas de la célula donde no estén estos metales provocarán áreas luminosas en dicha pantalla. Por ello todas las imágenes originales de microscopía electrónica son en blanco y negro, aunque se puedan colorear posteriormente con un ordenador.

Proceso de contraste de secciones ultrafinas. Los tiempos de incubación en citrato de plomo y acetato de uranilo son aproximativos. Las lentejas de hidróxido sódico eliminan humedad del aire y dificultan la pricipitación del citrato de plomo. Los lavados en agua se llevan a cabo sumergiendo repetidas veces (en inglés, "deeping") la rejilla en el agua durante un tiempo de aproximadamente 30 segundos en cada pocillo con agua destilada.