EXPRESIÓN DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA Y EXPORTACIÓN DE PROTEÍNAS

La mayor parte del genomio bacteriano consta de genes y conjuntos de genes. La mayoría de ellos son genes que codifican proteínas, bien sean estructurales o enzimáticas. La "ruta" de expresión por la que la secuencia de un gen se decodifica hasta proteína consta de dos fases: transcripción y traducción.
Un concepto muy importante a tener ya en cuenta, y que distingue la organización genética procariótica de la eucariótica es que los genes bacterianos relacionados con una misma función genética suelen estar agrupados de forma contigua, formando una unidad de transcripción y de regulación genética que se denomina operón.

1. TRANSCRIPCIÓN | a Contenidos

(Daremos aquí sólo unos conceptos básicos, que ampliaremos en el primer capítulo de la sección de Genética Bacteriana, aparte de remitir al lector a cursos generales de genética y bioquímica).
La transcripción es la fase de la expresión genética que produce copias del mensaje codificado en el ADN en forma de ARN mensajero. Las enzimas que realizan este proceso se denominan genéricamente ARN-polimerasas.
Durante la transcripción la ARN polimerasa emplea las reglas de emparejamiento de bases entre los desoxirribonucleótidos del ADN-molde y los ribonuclótidos que va incorporando al ARN:

A del molde se empareja con U (uracilo, que "sustituye" a la T en el ARN)
C del molde se empareja con G
T del molde se empareja con A
G del molde se empareja con C

Estos emparejamientos son transitorios (mientras está actuando la ARN polimerasa). El resultado final es una cadena de ARN libre cuya secuencia es complementaria de la cadena de ADN-molde.
La ARN polimerasa de eubacterias consta de:

un núcleo o corazón formado por cuatro polipéptidos (a ₂ ß ß');
una subunidad s (sigma) que, al unirse al núcleo permite que la holoenzima pueda reconocer una secuencia situada al inicio del operón, concretamente una secuencia de reconocimiento denominada promotor. Tras la unión al promotor, la holoenzima de la ARN polimerasa puede iniciar la transcripción.

Debido a la estructura en operones de los genes bacterianos, los ARN correspondientes a muchos operones son policistrónicos, es decir, en un mismo ARNm está transcrita la información de los distintos genes de ese operón.

Cada célula de Escherichia coli tiene, por término medio, unas 2000 moléculas de núcleos de ARN-polimerasa. Si tenemos en cuenta que el genoma de esta bacteria posee unos 4000 genes, esto significa que no todos los genes están activos al mismo tiempo. De hecho, la bacteria está eligiendo los genes que se transcriben y los que no. Esta especificidad funcional a la hora de la transcripción, se logra en dos pasos:

en el primero, el núcleo de la polimerasa se une a uno de los tipos de subunidad s, con su capacidad de reconocimiento y unión a un tipo de promotor (pero no a otros);
como veremos en el capítulo 22, para que la holoenzima pueda transcribir eficientemente muchos operones, requiere el concurso de una o más proteínas especializadas (factores de transcripción o activadores de la transcripción).

Subunidad sigma (s)	Tamaño (nº de aminoácidos)	Gen que la codifica	Genes reconocidos por la correspondiente holoenzima
s⁷⁰ (s^D)	613	RpoD	Genes expresados durante fase exponencial
s⁵⁴ (s^N)	478	RpoN	Genes expresados durante desequilibrio de nitrógeno
s³⁸ (s^S)	362	RpoS	Genes de fase estacionaria
s³² (s^H)	284	RpoH	Genes de respuesta al calor (heat-shock)
s²⁸(s^F)	239	RpoF	Genes de quimiotaxis y flagelos
s²⁴ (s^E)	202	RpoE	Genes de proteínas extracitoplásmicas y periplásmicas
s¹⁸ (s^Fecl)	173	fecl	Genes extracitoplásmicos y de captación de hierro

La subunidad empleada en la transcripción de los genes durante la fase exponencial de crecimiento es la s⁷⁰.

2. TRADUCCIÓN | a Contenidos

Tan pronto como ha comenzado la transcripción de un operón, los ribosomas se unen al extremo 5' del mensajero naciente, y da comienzo enseguida la traducción del mensaje (observar las micrografías electrónicas). Esto constituye otro rasgo distintivo de la expresión genética en procariotas: la transcripción y la traducción están estrechamente acopladas. Igualmente característico de las bacterias es el hecho de que el primer aminoácido que se incorpora no es la metionina, sino la N-formil-metionina.

2.1 LA MAQUINARIA DE TRADUCCIÓN: EL RIBOSOMA

Como ya vimos, en las micrografías electrónicas de cortes finos de bacterias el citoplasma aparece muy granulado, correspondiendo estos granos a los 10.000 a 15.000 ribosomas que posee cada célula (dependiendo de la fase de crecimiento).
El ribosoma es probablemente el complejo supramacromolecular más estudiado, a pesar de lo cual, y debido a su extraordinaria complejidad, aún reserva una buena cantidad de aspectos no totalmente comprendidos.
Nos referiremos a la composición y estructura del ribosoma eubacteriano (concretamente, de la especie en que está mejor estudiado: Escherichia coli, por supuesto).
El ribosoma está compuesto de un 63% de ARN (que a su vez representa más del 90% del ARN total de la bacteria) y un 37% de proteínas. El ribosoma eubacteriano posee un coeficiente de sedimentación de 70S, frente al de 80S de los ribosomas citoplásmicos eucarióticos. Bajando la concentración de iones Mg⁺⁺ cada ribosoma se disocia en sus dos subunidades: la pequeña (30S) y la grande (50S). In vivo esta disociación ocurre cada vez que se completa la síntesis de una molécula de proteína, para volver a unirse las dos subunidades al inicio del mensaje de otro gen.
Múltiples técnicas moleculares (algunas relativamente recientes) permiten desentrañar aspectos de los ribosomas:

difracción de rayos X;
difracción de neutrones;
inmunoelectromicroscopia.

Subunidad pequeña (30S)Papeles:

Composición y estructura:

Subunidad grande (50S)Papeles:

Interviene principalmente en la formación del enlace peptídico entre el aminoácido situado en el sitio A (ligado a su ARNt) y el péptido naciente (unido a un ARNt) del sitio P. Composición y estructura:

2.2 EL MECANISMO DE LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS

Aún no tenemos un cuadro completo de cómo coordina el ribosoma la compleja serie de reacciones que forman parte de la traducción: unión y liberación de los ARNt, transpeptidación, movimientos coordinados del molde de ARNm y del péptido naciente, etc. Sin embargo, el intenso estudio al que se están sometiendo el ribosoma y el proceso de la traducción desde los años 60 ha permitido notables profundizaciones. El alumno de biológicas puede recurrir a los conocimientos que se imparten en otras asignaturas de la Licenciatura (Bioquímica, Genética, Biología Molecular) y a alguno de los excelentes textos modernos (Alberts y otros: "Biología Molecular de la célula"; Darnell y otros: "Biología Molecular y Celular"; Stryer: "Bioquímica"; Rawn; "Bioquímica"; Voet y Voet: "Bioquímica"; Watson y otros: "Molecular Biology of the Gene"). Nosotros, para evitar solapamientos y reiteraciones, renunciamos a tratar aquí estos aspectos de la traducción, aunque los repasaremos cuando tratemos el tema de los antibióticos que actúan inhibiendo la síntesis de proteínas. Por supuesto, animamos al alumno a abordar la lectura de algún artículo de revisión sobre aspectos concretos y novedosos de este tema (véase la bibliografía adjunta).

3. EL PLEGAMIENTO DE LAS PROTEÍNAS: PAPEL DE LAS PROTEÍNAS CELADORAS ("CHAPERONAS") | a Contenidos

Hasta hace poco se pensaba que el polipéptido naciente adquiría espontáneamente su configuración funcional al ser sintetizado en el ribosoma. Pero hoy se sabe que tanto el correcto plegamiento de las proteínas como su adecuado ensamblaje en complejos requiere el concurso de unas proteínas especiales, conocidas como proteínas celadoras o "carabinas moleculares", debido a que su papel es vigilar y eventualmente corregir el plegamiento. (Se está imponiendo, para denominarlas, la castellanización de su nombre inglés: chaperonas, procedente de chaperones). Estas proteínas están presentes en todos los seres vivos. Algunas de ellas se inducen ante determinados estrés ambientales; de hecho se descubrieron como proteínas inducibles ante un aumento de temperatura, por lo que se denominaron como proteínas del choque térmico ( con su acrónimo ingés Hsp).
En Escherichia coli se han estudiado especialmente la DnaK, DnaJ, GroEL y GroES. Parece que actúan de un modo secuencial:
La DnaK y la DnaJ se unen al polipéptido naciente, protegiendo sus dominios hidrofóbicos respecto del solvente, para evitar la formación de agregados.
A continuación, la GrpE facilita la disociación del complejo DnaK·DnaJ·polipéptido.
El polipéptido pasa a GroEL y GroES, que catalizan la correcta isomerización, de modo que la proteína adquiere su plegamiento nativo biológicamente activo.

4. SECRECIÓN DE PROTEÍNAS EN PROCARIOTAS | a Contenidos

Las proteínas que no van a formar parte del citoplasma, han de ser "encarriladas" a su localización celular correspondiente. En el caso de las bacterias Gram-negativas, estas localizaciones extra-citoplásmicas pueden ser:

De membrana citoplásmica
Periplásmicas
Membrana externa
Proteínas secretadas al medio.

Para ello las bacterias cuentan con sistemas de exportación de proteínas. Las proteínas cuya localización final es alguna de las envueltas bacterianas (membrana citoplásmica, periplasma y membrana externa) y las que deben excretarse al medio disponen, cuando acaban de ser sintetizadas (o aún están siendo sintetizadas por los ribosomas) de una secuencia señal que las capacita para ser exportadas. Por eso, este reparto se suele denominar como ruta de exportación general dependiente de péptido señal. En el caso de las proteínas de periplasma y de membrana externa esta secuencia señal, en el extremo aminoterminal original, es rota durante el tránsito a través de la membrana citoplásmica.

4.1 EXP ORTACIÓN DE PROTEÍNAS A TRAVÉS DE LA MEMBRANA CITOPLÁSMICA

La exportación de una proteína suele ocurrir cuando ésta aún no ha terminado de ser sintetizada por el ribosoma (pero a diferencia de la secreción de proteínas en el retículo endoplásmico de los eucariotas, en procariotas el acoplamiento entre traducción y secreción no es muy estrecho).
Las proteínas a exportar, antes de su transporte se suelen denominar pre-proteínas. Las pre-proteínas se caracterizan por poseer un extremo aminoterminal que no va a formar parte de la proteína madura, porque conforme la pre-proteína atraviese la membrana, el aparato de exportación corta, dejando el llamado péptido líder o secuencia-señal para la exportación, y el resto de la proteína atraviesa la membrana. Aunque las secuencias señal de las distintas proteínas no tienen ninguna homología, sí existen una serie de rasgos comunes que permiten realizar el "retrato robot" de este tipo de secuencia:

Su longitud está entre 15 y 30 aminoácidos.
Uno o más aminoácidos básicos en el extremo aminoterminal.
La parte central consta de 6 o 7 aminoácidos hidrofóbicos.
La parte carboxiterminal es hidrófila, y contiene la zona reconocida y cortada por la peptidasa del líder.

El aparato para la exportación de la proteína consta de una serie de proteínas llamadas proteínas Sec. Las principales proteínas Sec parece que forman un complejo en la membrana citoplásmica:

SecA: es una proteína periférica ligada al lado citoplásmico de la membrana. Cuando se une a ATP adquiere una configuración que la capacita para unirse a la pre-proteína y a la SecY.
SecY: es una proteína grande, integral de membrana, a la que atraviesa 10 veces.
SecE: también es una proteína integral (atraviesa tres veces), muy conservada evolutivamente en todas las eubacterias, lo que indica que es un componente central del aparato de exportación. Puede que forme de alguna manera un "canal para la exportación".

Durante su tránsito a través del sistema Sec, una proteasa especial, llamada endopeptidasa del lídero peptidasa Lep, rompe al final de la secuencia señal de la pre-proteína, y la proteína madura pasa al otro lado de la membrana citoplásmica. La Lep es una proteína integral de membrana, pero tiene su sitio activo ya inmerso en el periplasma.
Modelo hipotético del funcionamiento del sistema de exportación (Murphy y Beckwith, 1997)

Las proteínas exportables se sintetizan como pre-proteínas, con una secuencia señal (péptido líder) en su extremo aminoterminal. Al parecer, una primera función de esa secuencia es retrasar el plegamiento de la proteína naciente.
La pre-proteína sin plegar interacciona ahora con la membrana citoplásmica, y en concreto con el aparato de secreción. Esa interacción está facilitada por la porción hidrófoba central de la secuencia señal (que permitiría una mejor inserción en la bicapa lipídica).
La pre-proteína, a través del péptido líder interacciona con la SecA unida ya a ATP, con lo que el complejo de secreción queda "activado".
Entonces la actividad ATPasa de la SecA proporciona energía para el proceso de traslocación de la proteína. Se produce un cambio conformacional en el complejo SecA-SecY-SecE.
Durante la traslocación, la proteasa Lep rompe la secuencia señal: el péptido líder se escinde y se degrada, mientras que la proteina madura pasa al otro lado de la membrana citoplásmica.

4.2 SECR ECIÓN DE PROTEÍNAS AL MEDIO EXTRACELULAR

Las bacterias pueden secretar al medio proteínas extracelulares, que son importantes factores de adaptación a sus nichos ecológicos, facilitándoles la colonización y diseminación (por ejmplo, en el caso de bacterias patógenas que deben acceder a determinados tejidos del huésped y establecerse allí). Como las bacterias no tienen capacidad fagocítica, y como tampoco suelen transportar macromoléculas del medio al citoplasma, el modo habitual de aprovechar esas macromoléculas es secretando enzimas (exoenzimas) hidrolíticas al medio. Además, en el caso de muchas bacterias patógenas, secretan también enzimas que degradan componentes de los tejidos, lo cual les ayuda a dispersarse allí, e incluso algunas secretan exotoxinas (para matar células del huésped) y bacteriocinas (que matan a otras bacterias posibles competidoras en su nicho ecológico).
En el caso de las bacterias Gram-positivas, la secreción de proteínas al medio implica simplemente el sistema que hemos visto en el epígrafe anterior: la proteína atraviesa la membrana citoplásmica a través del sistema Sec, que reconoce y corta el péptido líder.
Sin embargo, en las Gram-negativas, la ruta es más compleja, ya que una vez que la proteína atraviesa la membrana citoplásmica, debe atravesar la membrana externa para acceder al medio exterior. Hay varios mecanismos para realizar esto, pero los más importantes son la ruta general de secreción y los transportadores de tipo ABC.
La mayor parte de las proteínas sintetizadas como pre-proteínas, y que han atravesado la membrana citoplásmica por la ruta Sec descrita, usan, para atravesar la membrana externa una ruta denominadaruta general de secreción. Esta ruta depende de numerosas proteínas (de 12 a 14, según las especies), y aún se desconocen muchos detalles de ella. Al parecer, las proteínas implicadas en la secreción detectan la configuración característica de alguna parte de la proteína a secretar mientras ésta se encuentra en el periplasma.
Muchas proteínas que carecen de péptido señal usan una ruta denominada de los transportadores de tipo ABC. En este sistema, las proteínas a secretar atraviesan la membrana citoplásmica y la membrana externa en un solo proceso, sin pasar por el espacio periplásmico, y usan un tipo especial de ATP-asas de membrana, junto con unas pocas proteínas auxiliares.
Hay muchos ejemplos de transportadores ABC, pero todos son proteínas de membrana citoplásmica, con un dominio hidrófobo inmerso en la membrana, y un dominio citoplásmico conservado que incluye un sitio de unión a ATP.

(A ese dominio se le ha dado el nombre de "cassette de unión al ATP", y de ahí deriva el nombre de estas proteínas: usando el acrónimo inglés de "ATP binding cassette" resulta ABC. Este módulo está conservado incluso en organismos superiores, incluyendo humanos. En bacterias existen ejemplos de proteínas ABC no sólo implicadas en secreción de proteínas, sino en captación de sustratos exógenos, como maltosa, histidina, oligopéptidos y sideróforos de hierro).

Aparte de la proteína ABC, el sistema usa dos proteínas accesorias, una en la membrana citoplásmica y otra en la membrana externa. Los sistemas de este tipo son muy específicos: cada uno sólo transporta un tipo de proteína (ello se refleja incluso en la organización genética, en la que los genes de los transportadores están junto al gen de la proteína a secretar). Al parecer, lo que reconoce el sistema (a través del transportador ABC) en la proteína a exportar es la configuración de su porción carboxiterminal.
La proteína auxiliar de la membrana interna es muy peculiar, porque al parecer sirve para juntar la membrana citoplásmica y la membrana externa: tiene un dominio aminoterminal hidrofóbico insertado en la membrana citoplásmica, seguido de una región hidrófila que atraviesa el espacio periplásmico, y termina en un dominio carboxiterminal en lámina b que podría interactuar con la membrana externa. Por esto se le ha dado el nombre de proteína de fusión entre membranas.

APÉNDICES FILAMENTOSOS BACTERIANOS

FLAGELOS

INTRODUCCIÓN: LA MOVILIDAD EN LAS BACTERIAS

Los procariotas capaces de moverse lo hacen por alguno de estos sistemas:

por flagelos
por deslizamiento sobre superficies sólidas
por sacudidas o contracciones (en algunos cocos Gram-negativos).

Los flagelos bacterianos típicos son largos apéndices filamentosos extracelulares, helicoidales, responsables del desplazamiento en medios líquidos de la mayor parte de las bacterias móviles. Aunque empleamos la misma palabra para designar a los orgánulos locomotores de procariotas y eucariotas, ambos son totalmente diferentes, tanto en estructura como en mecanismo de funcionamiento:

El filamento del flagelo bacteriano, que constituye su porción externa más visible, consta generalmente de un solo tipo de proteína, y en él no se realiza ningún trabajo quimiomecánico. El mecanismo del flagelo bacteriano es rotatorio, con un motor reversible (funciona en los dos sentidos de giro). La energía que propulsa a este motor no es ATP ni ninguna otra molécula con enlaces energéticos, sino que deriva directamente del gradiente de protones (fuerza protón-motriz).

OBSERVACIÓN

A microscopía óptica

En preparaciones en fresco, no se pueden detectar los flagelos individuales, debido a su extrema delgadez (están ligeramente por debajo del límite resolutivo del microscopio). En cambio, la microscopía óptica de alta intensidad en campo oscuro sí logra discernir los flagelos. El microscopio de contraste de fases logra visualizar los penachos densos de flagelos de ciertas bacterias.

Pueden estudiarse fácilmente mediante impregnación argéntica en preparaciones previamente fijadas por procedimientos suaves que no destruyan la estructura (alcohol-éter) y con mordientes que la engruesan artificialmente: ácido tánico, sales de Al y Cr.

A microscopía electrónica: Se suelen emplear las técnicas habituales de sombreado o tinción negativa con ácido fosfotúngstico.

ASPECTOS MORFOLÓGICOS

Sobre células intactas, los flagelos se observan como filamentos helicoidales largos y finos. La longitud es variable (no está determinada de modo fijo): de 5 a 10 mm, pero su anchura o diámetro es constante y uniforme para cada especie: en Escherichia coli es de 20 nm.

El carácter helicoidal del filamento es propio e intrínseco: para cada especie, y dadas unas condiciones ambientales determinadas (sobre todo de pH) los parámetros de la hélice son fijos y característicos:

longitud de onda (p. ej., de 2-2.5 mm)
amplitud o anchura de la hélice (0.4-0.6 mm).

Algunas especies presentan simultánemante dos tipos de flagelos, con dos longitudes de onda diferentes (normalmente una es la mitad de la otra). A este fenómeno se le denomina biplicidad.

El patrón de flagelación (es decir, el número y localización de los flagelos) varía entre especies, y reviste interés en la determinación taxonómica:

un solo flagelo: bacterias monotricas. Normalmente la inserción del flagelo (en bacterias bacilares) es polar o subpolar.
dos o más flagelos formando un penacho, normalmente en un polo: lofotricas. (por ejemplo, en Spirillum volutans hay más de 80 flagelos en el penacho).
dos penachos de flagelos, uno en cada polo: bacterias anfitricas.
flagelos repartidos por toda la superficie: bacterias peritricas. (Por ejemplo, Escherichia coliposee unos 10 flagelos, mientras que Proteus mirabilis posee cientos, dando aspecto muy denso a la disposiciòn de éstos).
Ciertas bacterias presentan flagelos de inserción lateral, bien en penachos densos(Selenomonas), bien diseminados (Pectinatus).

Existe una serie de especies Gram-negativas (Vibrio, Photobacterium, Bdellovibrio) que poseen flagelos muy engrosados, debido a que están envueltos en una vaina que presenta continuidad con la membrana externa. Por otro lado Pseudomonas rhodos tiene un flagelo con vaina a base de subunidades de una proteína.

1.1 COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ESTRUCTURA

Los flagelos pueden aislarse relativamente intactos por procedimientos suaves (que desorganicen y disuelvan el PG y la membrana citoplásmica, y en Gram-negativas, además, la membrana externa). La estructura del flagelo está bastante conservada entre los procariotas, lo que apunta a que debió ser un "invento evolutivo" relativamente temprano (aunque por lo visto, ningún eucariota lo ha heredado).

Se observan tres partes diferenciadas: filamento helicoidal largo, que es la única parte visible a microscopía óptica; está conectado a un corto segmento curvado denominado codo o gancho, que a su vez está unido al corpúsculo basal. Este corpúsculo basal está inmerso en las envueltas (membrana citoplásmica y pared), y consta esencialmente de un cilindro que ensarta 1 o 2 parejas de anillos.

FILAMENTO

Es la parte visible en las preparaciones de células intactas, y representa hasta el 95% de la masa total del flagelo. Se puede aislar fácilmente por agitación mecánica, con ulterior ultracentrifugación diferencial en gradientes de densidad.

Desde un punto de vista geométrico se puede considerar como un cristal unidimensional, de longitud indeterminada (en enterobacterias, de entre 5-10 micras), pero con un diámetro uniforme de 20 nm, y como ya vimos unos parámetros de hélice propios de cada especie. Los flagelos silvestres en reposo suelen ser hélices levógiras, pero como veremos enseguida, experimentan transiciones conformacionales inducidas mecánicamente en ciertas fases del proceso de movilidad.

Si sometemos los flagelos aislados a agentes desnaturalizantes (calor, pH ácido, urea, etc) se desintegran en subunidades de un solo tipo de proteína: la flagelina.

La flagelina:

Es una proteína globular relativamente elongada, con pesos moleculares variados, según las especies (desde unos 15 kDa en algunos Bacillus hasta unos 62 kDa en algunas enterobacterias).

Su composición química es bastante característica e inusual:

abundancia de aa. ácidos y neutros; ausencia de trp y de cys; escasez de aa. básicos (tyr, pro, his, met).

En condiciones físico-químicas adecuadas, las subunidades aisladas de flagelina se autoensamblan espontáneamente in vitro, generando filamentos idénticos a los nativos naturales. Este ensamblaje requiere cortos segmentos de filamentos que actúan como "cebadores". Las subunidades se van incorporando al extremo distal nativo.

Estructura tridimensional del filamento

Las subunidades de flagelina se disponen formando una matriz cilíndrica, con un empaquetamiento cuasi-hexagonal, donde se observan 11 hileras cuasi-axiales (casi verticales) de subunidades; las hileras cuasi-axiales se denominan fibrillas. El cilindro está hueco (deja un canal en su interior).

Existe una íntima relación entre esta estructura y la forma helicoidal del filamento, lo que a su vez en esencial para la función propulsora del flagelo.

Veamos pues, el fundamento de la helicidad del filamento, y de su carácter de propulsor:

Si todas las subunidades de flagelina establecieran los mismos enlaces con sus vecinas (o sea, si todos los enlaces fuesen equivalentes) el filamento sería totalmente recto, y por lo tanto, no podría actuar como propulsor. Pero la flagelina es una proteína muy notable, ya que puede cambiar reversiblemente entre dos estados distintos (se dice que es una molécula biestable). En un mismo filamento, cualquiera de las 11 fibrillas pueden cambiar cooperativamente entre los dos estados. El resultado es que la tensión que supone que algunas fibrillas estén en un estado distinto a las demás secompensa con una deformación del filamento en forma de hélice macroscópica. El filamento nativo consta de 9 fibrillas normales y 2 fibrillas en transición. Los entornos moleculares de las subunidades de flagelina de una misma fibrilla son idénticos entre sí, pero difieren de los de las otras fibrillas: es decir, los enlaces de distintas subunidades de fibrillas distintas son cuasi-equivalentes(pero no totalmente equivalentes). El filamento nativo en reposo y durante las fases de natación es una hélice levógira con 9 fibrillas normales y 2 en transición. Como veremos más adelante, el cambio del sentido de rotación del motor flagelar induce cambios moleculares en la longitud de onda y en la quiralidad (levo/dextrógira) que son esenciales en el mecanismo de la natación bacteriana. El filamento es notablemente rígido (tanto desde el punto flexional como torsional), de modo que durante el movimiento activo sólo se producen pequeñas deformaciones, pero sin afectar a los parámetros de la hélice. El movimiento de rotación del motor (situado en el corpúsculo basal) se comunica al filamento helicoidal rígido, que a modo de hélice de barco permite el avance de la bacteria.
Antigenicidad

Tanto la flagelina nativa aislada como los filamentos intactos son buenos antígenos, constituyendo el denominado antígeno H flagelar, específico para cada especie e incluso para cada estirpe o raza.

En enterobacterias (uno de cuyos hábitats naturales es el interior de los animales superiores) la porción central de la flagelina es muy variable, lo cual parece representar una respuesta evolutiva de tipo adaptativo, que les permite enfrentarse mejor al sistema inmune de sus hospedadores.

Las células flageladas reaccionan in vitro con sus antisueros específicos, dando una aglutinación floculenta y laxa, bastante típica. Esta reacción de aglutinación se emplea en la caracterización de las variedades de Salmonella (véase la clasificación de Kauffmann-White, en la sección de Taxonomía, capítulo dedicado a la familia Enterobacteriaceae).

CODO O GANCHO

Es una estructura curvada, acodada, de unos 80 nm de longitud, y unos 22 nm de diámetro, que conecta el filamento al corpúsculo basal. Consta de unas 130 unidades de una proteína elongada, distinta de la flagelina (42 kDa), dispuestas igualmente en una matriz cilíndrica de 11 fibrillas.

El codo también presenta cuasi-equivalencia, responsable de la helicidad del codo (aunque en este caso no llega a alcanzar una vuelta completa de hélice).

Parece ser que el codo actúa a modo de juntura universal o flexible entre el filamento y el corpúsculo basal.

Entre el codo y el filamento existen dos discos de proteínas accesorias del codo (HAP1 y HAP3). Cada uno de los discos consiste en dos giros de hélice, e intervienen en el control del ensamblaje del flagelo. Son estructuras adaptadoras que permiten la correcta interacción entre filamento y codo.

CORPÚSCULO BASAL

Es la estructura que, inmersa en la membrana citoplásmica y en la pared celular, ancla el flagelo a la célula, y está relacionada con la función del motor.

i) En Gram-negativas, la estructura típica consta de dos pares de anillos coaxiales atravesados por un cilindro.

Los dos anillos exteriores se denominan L y P, y están relacionados respectivamente con la membrana externa y con el peptidoglucano. Estos dos anillos están conectados por una pared cilíndrica que enmascara la porción del cilindro central. Los dos anillos interiores se denominan S y M: el S está en el espacio periplásmico, inmediatamente por encima de la membrana citoplásmica, y el M está inmerso plenamente en dicha membrana. Conectados al corpúsculo basal se localizan varias proteínas importantes para la función del motor y para el sentido del giro: Por debajo del anillo M existen tres proteínas (FliG, FliM y FliN) que están implicadas en la conmutación del sentido del giro del motor: permiten que el motor pueda girar en sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario al de las agujas del reloj. Recientemente se ha visto que estas proteínas configuran un quinto anillo (anillo C), por debajo del M, ya inmerso en el citoplasma. Rodeando al corpúsculo basal, a modo de empalizada cilíndrica, existen subunidades de dos proteínas: MotA y MotB. Aunque aún no está aclarada totalmente su intervención, parece que son elementos esenciales de la maquinaria que hace girar a una parte del corpúsculo basal (motor). Este giro se comunica probablemente al cilindro central, que a su vez debe de estar "fusionado" con algunos de los anillos. El giro se transmite al codo y al filamento, siendo ésta la base del movimiento rotacional del flagelo. Se supone que al menos algún anillo debe de permanecer fijo, anclado a alguna estructura de las envueltas, actuando a modo de estator del motor, pero se desconoce su identidad. Recientemente se ha demostrado que los anillos interiores (M y S) se mueven solidariamente, lo que permite descartarlos, en principio como estatores del motor. Un buen candidato a estator podría ser el anillo P, que podría interaccionar de modo fuerte con el PG, que es a fin y al cabo la estructura más rígida de las envueltas, pero este punto aún no se ha confirmado experimentalmente. Recientemente se están acumulando datos de que el giro se induce en el mismo anillo C (implicación de la proteína FliG)

Una "versión modificada" de la estructura del corpúsculo basal la encontramos en Caulobacter, que presenta un anillo extra (E), y que parece que tiene que ver con la eyección del complejo cilindro-gancho-filamento, que se produce en un momento determinado de su ciclo de vida. Además, anillo L es más ancho y el M es más grueso.

ii) En Gram-positivas la estructura del corpúsculo basal es más sencilla: cilindro central y una sola pareja de anillos (el M y el S).

GENÉTICA Y ENSAMBLAJE DEL FLAGELO

En la "construcción" del flagelo bacteriano intervienen unas 50 proteínas, entre proteínas estructurales que formarán parte de la estructura definitiva, y proteínas accesorias que sólo sirven durante este ensamblaje. Debido a esta complejidad, y a que, además, diversas partes del flagelo deben de interaccionar con las envueltas bacterianas (membrana, pared), no es de extrañar que este ensamblaje esté bien ajustado ni que la síntesis de las diversas "piezas" esté sometida a un estricto control genético.

ASPECTOS GENÉTICOS

Los alrededor de 40 genes relacionados con el flagelo y la quiomiotaxis se organizan en unos 14 operones. En Escherichia coli y Salmonella typhimurium los operones se expresan y regulan en un orden jerárquico de tres niveles:
Primer nivel: sólo incluye el operón flhD. Su expresión depende de la ausencia de represión catabólica (requiere CRP-AMPc). El operón contiene sólo dos genes, cuya expresión da lugar respectivamente a FlhC y FlhD, que constituyen heterotetrámeros de dos unidades de cada uno. Dichos tetrámeros son activadores transcripcionales de los operones de segundo nivel.
Segundo nivel: incluye la mayor parte de los genes de proteínas estructurales del corpúsculo basal, yfliA, que codifica un factor s alternativo necesario para la expresión de los operones del tercer nivel.
Tercer nivel: incluye tres operones:

Operón fliC: codifica el filamento flagelar (flagelina)
Los operones motA y tar determinan todas las proteínas de la transducción de la señal quimiotáctica, las proteínas del motor y los receptores transmembranales.

Al menos en estas bacterias, motilidad flagelar sólo se expresa después de la mitad de la fase exponencial. El significado adaptativo es que no tiene sentido sintetizar un sistema tan complejo en un medio que aún es rico. En la fase post-exponencial resulta ventajoso que las células se muevan en busca de nutrientes o que se alejen de productos tóxicos.

ENSAMBLAJE DEL FLAGELO

A grandes rasgos, el flagelo se va ensamblando "desde dentro hacia afuera", es decir, comenzando por el corpúsculo basal y avanzando hacia el codo y finalmente hasta el filamento.
Por encima de los detalles relativos a la colocación ordenada de cada "pieza", hay dos cuestiones generales interesantes en este ensamblado:
a) En principio, cada una de las estructuras tubulares del flagelo (cilindro del corpúsculo basal, codo y filamento) serían de longitud indeterminada. Sin embargo, tanto el cilindro como el codo tienen, de hecho una longitud definida, esencial para la funcionalidad de la estructura global. Parece ser que esto se logra mediante proteínas que se adicionan a uno de sus extremos una vez que se alcanza el tamaño adecuado:
Por ejemplo, el cilindro se "recubre" en su extremo distal de una proteína (FlgD), que señala el "fin" de ese cilindro y al mismo tiempo es la señal para que se ensamblen los siguientes componentes. El "fin" del codo es señalado por la entrada de la proteína HAP1.
De cualquier manera, se desconoce aún cómo "sabe" el sistema que se ha alcanzado la longitud adecuada del componente alargado para adicionar el componente que "corona" y finaliza esa pieza.
b) ¿Cómo se transportan los distintos componentes durante el ensamblado?

Los componentes situados al nivel de la membrana (anillo M) o del lado citoplásmico probablemente no tienen ningún mecanismo especial.
Los componentes del motor (MotA y MotB) parece que rodean a modo de empalizada al corpúsculo basal, y se encuentran anclados a la membrana citoplásmica a través de sus porciones hidrofóbicas. Se insertan sin previo procesamiento (no tienen péptidos-señal).
Las proteínas de los anillos externos (P y L) se sintetizan como precursores provistos de péptidos-señal en sus extremos N-terminales, que son rotos por el complejo de procesamiento del péptido señal, a su paso por la membrana citoplásmica.
Las unidades de flagelina recorren la porción central hueca del eje del flagelo: o sea, pasan por el interior del cilindro à codo à filamento, hasta llegar a la punta en crecimiento, en la que permanentemente hay una proteína (HAP2) encargada de "recibir" las nuevas unidades al final de su "viaje" y controlar su colocación final sobre el filamento cebador preexistente, evitando que escapen al medio exterior.

El filamento es una estructura de longitud indefinida, pero su tamaño medio viene determinado estadísticamente por tres variables:

tasa de síntesis de la flagelina;
tasa de rotura espontánea de los filamentos;
tasa de inserción de los monómeros de flagelina. Esta tasa decrece exponencialmente conforme aumenta la longitud del filamento cebador, debido a resistencias a la difusión y a la fricción de los monómeros conforme atraviesan el hueco axial.

1.2. MOVIMIENTO FLAGELAR

En este apartado nos vamos a plantear dos objetivos de estudio principales:

aspectos dinámicos y funcionales del flagelo: base del movimiento;
cómo se vé modificado el mecanismo flagelar básico ante la llegada de estímulos ambientales captados en la superficies celular.

DESCRIPCION DEL MOVIMIENTO DE UNA BACTERIA PERITRICA

Vamos a estudiar en primer lugar cómo se produce el movimiento en bacterias peritricas comoEscherichia coli o Salmonella tyiphimurium.

En ausencia de estímulos, en un medio ambiente uniforme, se puede observar un movimiento tridimensional aleatorio, formado por periodos de unos pocos segundos de natación en linea recta o ligeramente curvada (carreras o corridas), interrumpidos por breves episodios (décimas de segundo) de un movimiento angular caótico de la bacteria (viraje o cabeceo), tras de lo cual la célula entra en una nueva fase de natación en línea aunque con una nueva dirección.
En un gradiente espacial de un estímulo ambiental, la bacteria responde modificando el anterior patrón. Se alteran las probabilidades relativas de carreras y de virajes, de modo que la bacteria prolonga estadísticamente los periodos de natación hacia la dirección favorable (es decir, acercándose hacia un estímulo positivo y alejándose de uno negativo), y disminuye la frecuencia de cabeceo. De esta manera se obtiene una locomoción aleatoria pero estadísticamente sesgada, que propicia el avance neto en la dirección favorable. Este movimiento se denomina taxia.
El comportamiento táxico dura un tiempo limitado, que oscila de segundos a minutos, dependiendo de la naturaleza e intensidad del gradiente. Tras la fase de excitación inicial y de taxia, la bacteria se va adaptando al estímulo, de modo que regresa finalmente al patrón aleatorio de movimiento, sin avance neto en ninguna dirección.

Así pues, a continuación veremos la base de estos fenómenos:

Existencia de un rotor flagelar de tipo rotacional, que es reversible.
Veremos que la bacteria tiene mecanismos para detectar un gradiente espacial de un estímulo, y comprobaremos que este mecanismo actúa como si la bacteria estuviera detectando de hecho un gradiente temporal.
Conectado con el sistema de detección de estímulos, hay un sistema que hace que se vuelva al patrón aleatorio ante la persistencia del estímulo (mecanismo de adaptación).

MECANISMO DEL MOVIMIENTO ALEATORIO (EN AUSENCIA DE ESTÍMULO)

Resumen de lo que veremos:

El motor es rotatorio y tiene tres estados: giro en sentido contrario a las agujas del reloj (CAR), sentido igual al de las agujas del reloj (AR) y breves pausas.
Relación entre estos estados del rotor y el movimiento de la célula: "por defecto", el flagelo gira en sentido CAR, lo que provoca que los flagelos formen un penacho detrás de la célula, que de este modo nada en línea recta (corrida o carrera). Pero de vez en cuando hay breves pausas o el motor gira en sentido AR, lo que provoca un cambio conformacional en cada filamento: ahora cada filamento "tira" de la célula por su lado, lo que hace que la célula cabecee (viraje).
Posibles componentes del motor y del conmutador: empalizada de MotA y MotB alrededor del corpúsculo basal. Anillo C adosado al anillo MS posee proteínas (FliG, M y N) implicadas en el cambio de sentido (conmutador de giro).
Aspectos energéticos del motor: el motor gira a altas velocidades (unas 15.000 r.p.m), que permite que la bacteria nade a altas velocidades relativas (unas 60 veces su longitud por segundo, lo que a su escala sería superar la velocidad del guepardo). Este motor usa como combustible directamente la fuerza protón-motriz (fpm), es decir, la disipación de parte del gradiente electroquímico de protones a ambos lados de la membrana. El flujo es de unos 1.000 protones por cada giro. Se desconoce cómo se acopla este flujo de protones con el movimiento del motor, pero se sabe que la velocidad de rotación es proporcional a la fpm.

EL MOTOR ES ROTATORIO Y TIENE 3 ESTADOS

Desde hace varios años, por experimentos en los que las bacterias quedaban unidas a cubreobjetos por anclaje a ellos de los filamentos flagelares, se dedujo que el motor flagelar funciona como una máquina rotacional reversible, o sea, tiene dos sentidos: el de las agujas del reloj (AR) y el contrario (CAR).
Pero desde 1989 se sabe que el motor tiene un tercer estado intrínseco: la pausa breve, que parece deberse a ciclos fútiles de reversión de la rotación.
Veamos a continuación las relaciones que se dan entre estos tres estados funcionales del motor y los fenómenos de rotación en línea y virajes bruscos.

La natación en línea (carrera) se debe a la rotación continua, durante un periodo de unos segundos, del motor, en sentido CAR. En esta situación, la hélice del filamento es levógira, con 9 fibrillas en conformación normal y 2 en transición, lo que como ya dijimos, origina los parámetros característicos de la hélice. Durante el giro, la onda helicoidal aparente viaja desde el extremo proximal al distal. En las bacterias peritricas, las fuerzas hidrodinámicas y mecánicas hacen que los filamentos de los distintos flagelos se enrollen formando un haz o penacho paralelo al eje longitudinal de la célula. En este penacho, cada flagelo gira independientemente. El giro de los diversos filamentos helicoidales levógiros del penacho, empuja a la célula, originando la natación en linea recta, con una velocidad de unos 25 micrómetros/seg.
Cuando el motor gira en sentido inverso, o sea AR, en principio habría que esperar que la onda aparente del filamento helicoidal viajara desde el extremo distal al proximal. Pero la situación de hecho es más compleja: el giro en sentido AR del motor supone una carga torsional dextrógira que hace que el flagelo inicie una transición conformacional dextrógira, desde el extremo proximal en dirección al distal: van apareciendo ondas dextrógiras, cuya longitud de onda es 1/2 de la longitud de onda del filamento levógiro, lo que da un aspecto "rizado". Mientras no se complete la transición en toda su longitud, el filamento es de hecho heteromórfico: el extremo proximal rizado es dextrógiro; el extremo distal es normal, levógiro; ambas partes están separadas por un ángulo abrupto.
Los virajes bruscos que separan dos períodos de natación normal se producen precisamente porque los filamentos sufren una transformación incompleta desde levógiros a dextrógiros, apareciendo como heteromórficos transitoriamente.
Los filamentos heteromórficos no forman penachos, sino que están separados entre sí. Cada uno de ellos está tirando de un lado y empujando por otro. Ello hace que la célula se reoriente más o menos al azar, y bruscamente, antes del siguiente periodo de natación.
Estos virajes son, pues, en estas bacterias peritricas, un mecanismo activo, aunque aleatorio, de reorientación rápida.
Pero ¿por qué una vez comenzada la transición dextrógira, ésta no continua hasta el final, durante los periodos de rotación AR? Según investigaciones recientes, la respuesta estriba en que durante las fases de rotación AR, ocurren breves episodios de pausa del rotor, o bien de inversión de su sentido hacia CAR. Ello trae como consecuencia que la hélice dextrógira, que es más inestable, se convierta rápidamente en hélice levógira.
Existen mutantes que son incapaces de producir pausas o reversiones AR-->CAR durante las fases de rotación AR. Poseen flagelos totalmente dextrógiros que dan una natación más lenta y más oscilante que los levógiros.

COMPONENTES DEL MOTOR Y DEL CONMUTADOR

Como ya dijimos, parece que Mot A y Mot B forman parte del mecanismo del motor. Son proteinas necesarias para la rotación. A microscopía electrónica aparecen rodeando a los anillos interiores (M y S). ¿Funcionan como unidades generadoras de fuerza, quizás interaccionando con proteínas de alguno de los anillos, para originar la rotación?

El sentido intrínseco ("por defecto") de rotación del motor flagelar es el CAR.

Esto se ha observado en "vesículas flageladas", o sea, pequeñas esferas carentes de citoplasma y provistas del orgánulo flagelar

intacto.

En células normales, al sistema intrínseco flagelar se le superpone otro sistema que induce periódicamente la inversión del sentido de rotación. Este sistema que invierte el sentido de giro se denomina complejo conmutador, formado por tres tipos de proteínas (FliG, M, N), que parecen formar un quinto anillo (anillo C), adosado al lado citoplásmico del anillo M-S Este complejo recibe, por una lado, la información sensorial, e interacciona por otro con componentes del motor para invertir el sentido del giro.

ASPECTOS ENERGÉTICOS

En condiciones normales con disponibilidad de nutrientes energéticos en el medio ambiente de la bacteria, la forma de energía que alimenta el motor flagelar es la fuerza protón motriz (f.p.m.), es decir, el potencial electroquímico de protones (y en las bacterias alcalófilas, la fuerza motriz de los iones Na⁺).

segundo sistema de emergencia que transfiere protones directamente al motor

significado adaptativo del segundo sistema

La manera en que se acopla el flujo de protones al motor con la rotación de éste es un punto bastante oscuro y desconocido. He aquí un par de preguntas aún sin respuesta:

¿Existe un número fijo de H⁺ requerido para cada revolución del motor, o el acoplamiento es laxo y depende de la carga torsional y de la velocidad?
¿Qué tipo de máquina es el motor? Algunos han propuesto que es de tipo pulsante, es decir que funcionaría por pasos o saltos cuantizados.

VARIANTES DEL MOVIMIENTO EN OTRAS BACTERIAS

Para terminar este subapartado sobre mecanismos básicos de movilidad flagelar, haremos referencia a algunas variantes que se encuentran en diversos tipos bacterianos.
En bacterias uniflageladas, los dos estados rotacionales del motor se traducen en movimiento de avance y de retroceso, respectivamente, en línea recta. Las breves pausas sirven como mecanismo pasivo para reorientar la dirección aleatoriamente.
Existen bacterias que alternan simplemente entre rotación y pausas, de modo que durante estas últimas el movimiento browniano sirve para reorientar aleatoriamente a la célula (en Rhodobacter sphaeroides, que tiene un flagelo subpolar, y en Rhizobium meliloti, que es peritrica)
Un caso especial lo constituyen los espirilos, bacterias provistas de penachos polares (Ej:Rhodospirillum, Thiospirillum, Spirillum): Los flagelos de estas bacterias tienen muy poca helicidad, incluso inferior a una longitud de onda, pero en cambio los cuerpos celulares son helicoidales. Los flagelos forman apretados penachos polares en forma de cono, que ejercen una fuerza torsional sobre la célula espiral, lo que se traduce en un movimiento de avance a modo de sacacorchos. Nunca efectúan virajes. En Spirillum, los dos penachos polares están totalmente coordinados. La movilidad es reversible y simétrica (movimiento adelante-atrás, por inversión coordinada del sentido de rotacion de los penachos).

1.3. LAS TAXIAS

DEFINICIONES

En ausencia de un gradiente de estímulo, el movimiento de cada célula es a base de períodos de 2-4 segs de natación separados por virajes. El movimiento en un gradiente de estímulo se logra variando la frecuencia de virajes: si la concentración de un atrayente aumenta, o la de un repelente disminuye, las células no viran tan frecuentemente como lo harían en un entorno uniforme. Por lo tanto, el resultado es que nadan en la dirección favorable más tiempo, y este sesgo respecto de la natación aleatoria hace que exista un movimiento neto en relación con el gradiente.
Este mecanismo no es una taxia en sentido estricto (se le puede llama clinocinesis, aunque este término apenas se emplea); es un 50% menos efectivo que una taxia auténtica, pero probablemente requiere mucha menos inversión en maquinaria sensorial y motora.

TIPOS DE TAXIAS

Se distinguen principalmente aerotaxia, fototaxia y quimiotaxia.
1) aerotaxia: respuesta de migración ante un gradiente de oxígeno molecular.

Bacterias anaerobias à aerotaxia negativa.

Bacterias microaerófilas à atraídas a tensiones óptimas de O₂ (menores que la atmosférica).

Todas las bacterias aerobias y anaerobias facultativas à aerotaxia positiva.

La aerotaxia positiva, al menos en enterobacterias, y en bacterias purpúreas en crecimiento heterotrófico, tiene un mecanismo diferente del mecanismo táxico hacia otros atrayentes químicos: no existe en realidad un receptor específico del oxígeno. La señal estimulatoria consiste en la utilización del oxígeno como aceptor final de electrones en las cadenas transportadoras respiratorias. Esto provoca una alteración de la f.p.m., que de alguna manera provoca un cambio que aumenta la probabilidad de giro del rotor en sentido CAR.
Un mecanismo similar es el que subyace a la quimiotaxia hacia aceptores alternativos de electrones, como el fumarato y el nitrato.
2) Las fototaxias de las bacterias fotosintéticas anóxicas dependen de un mecanismo similar: detectan un gradiente de intensidad de luz, no mediante un receptor especial, sino por medio del transporte de electrones fotosintético, que a su vez provoca un cambio en el gradiente electroquímico de H⁺. Este cambio afecta al motor flagelar. Se desconoce si estos cambios son transmitidos directamente al flagelo o si existe mediación de proteinas "repetidoras" de la señal.
3) Las quimiotaxias, especialmente las de Enterobacterias, son las taxias mejor estudiadas.

ESTUDIO EN DETALLE DE LA QUIMIOTAXIAEn la quimiotaxia están implicados una serie de receptores específicos de superficie, que recogen la señal química (o sea, el quimioefector) y que inician un proceso de transducción intracelular de esta señal que finalmente llega al complejo conmutador del corpúsculo basal flagelar.

En estas enterobacterias los atrayentes orgánicos más potentes son sustancias que ocupan una situación central en el metabolismo (ciertos aminoácidos, azúcares, oligopéptidos y ácidos carboxílicos). Ahora bien, no existe una correlación entre el metabolismo de una sustancia y su capacidad como quimioatrayente.
El sistema sensorial de la bacteria, ante un gradiente espacial de atrayente o repelente, origina una migración neta (acercamiento o alejamiento, respectivamente) haciendo que la duración de una carrera en la dirección favorable sea mayor, y para ello influye sobre el conmutador flagelar binario que determina el sentido de rotación.
La bacteria capta ese gradiente espacial, detectándolo de hecho como si fuera un gradiente temporal autogenerado por ella misma mientras va moviéndose. Como veremos, la bacteria compara, mediante el mismo receptor de membrana que captó el estímulo, la concentración actual de la sustancia con la que tenía en los segundos anteriores.
Además, la bacteria vuelve al patrón aleatorio de movimiento tras varios segundos o minutos del contacto inicial con el gradiente: existe un mecanismo de adaptación al estímulo que, como veremos, implica una modificación covalente de los receptores.

Estos son los aspectos que vamos a pasar a considerar a continuación.

Estímulos químicos. Elementos de recepción y transducción de las señales químicas

En enterobacterias existen tres tipos de estímulos químicos según el tipo de receptores que los detectan.

un conjunto de azúcares que son detectados por el mismo sistema de transporte por traslocación de grupos (PTS) que los introduce en forma modificada al interior (repasar el tema 7); parece ser que el nivel de fosforilación de la enzima-II específica (por ej., la E-II^Glc) constituye la señal para controlar el conmutador flagelar en el caso de la atracción hacia cada azúcar.

una serie de atrayentes orgánicos y de repelentes orgánicos e inorgánicos que son captados directamente por proteínas integrales de membrana citoplásmica, y que funcionan exclusivamente como receptores sensoriales;

quimioatrayentes orgánicos que se unen primero a proteínas específicas del espacio periplásmico (PBP), que son las mismas proteínas periplásmicas implicadas en el transporte de estas sustancias sensible al choque osmótico (repasar el apartado correspondiente del tema 7). El complejo PBP-atrayente se puede unir al receptor específico de membrana de tipo similar al citado en el párrafo anterior. Por lo tanto, este sistema se puede considerar como una variante del anterior, en la que hay una "estación" intermedia de "recogida" del estímulo por parte de la correspondiente proteína periplásmica de transporte.

Estos dos últimos tipos de estímulos usan los receptores llamados MCP, es decir, proteínas quimiotácticas aceptoras de metilos:
Transmiten información desde el periplasma al citoplasma. Se han estudiado 4 proteínas MCP homólogas que atraviesan la membrana, Actúan como receptores y transductores, al unirse directamente a algunos aminoácidos y repelentes, y con proteínas de unión periplásmicas que se ligan a ciertos azúcares y dipéptidos (estas proteínas de unión sirven simultáneamente como parte de los sistemas de transporte sensibles a choque osmótico).

Receptor de tipo MCP

Aminoácidos atrayentes

Azúcares atrayentes ⁽¹⁾

Repelentes

Tsr

Ser

Ala

Gly

Acetato, leucina, benzoato, indol

Tar

Asp

Glu

Maltosa

Cobalto, níquel

Trg

Galactosa, ribosa

Tap

Dipéptidos

(1) Los azúcares no se unen directamente al MCP, sino que lo hace el complejo formado por el azúcar y su correspondiente proteína de unión periplásmica.
Ejemplos:

la maltosa se une a la proteína periplásmica de unión a la maltosa (MBP), que a su vez se une al receptor Tar(el mismo que recoge directamente aspártico y glutámico);

la galactosa se une a su proteína periplásmica (GBP), y a su vez el conjunto galactosa-GRP se une a un receptor de membrana citoplásmica llamado Trg.

Las proteinas receptoras de membrana citoplásmica que acabamos de citar son constitutivas, y funcionan exclusivamente en la recepción y transducción de estímulos químicos (a diferencia de las periplásmicas, que son inducibles y no son exclusivas de la quimiotaxis, sino que también están relacionadas con el transporte).

Organización molecular de un receptor de membrana:

Los receptores de membrana que hemos visto hasta ahora son proteinas de unos 60 kDa, bastante similares entre sí en sus secuencias, sobre todo en sus extremos C-terminales, y muestran una estructura terciara común:

segmento N terminal corto, citoplásmico

región ascendente en a -hélice, atravesando la membrana

dominio periplásmico, que contiene los sitios de unión para los efectores químicos

otra región en a -hélice, descendente, atravesando la membrana citoplásmica

dominio citoplásmico C-terminal, con dos zonas funcionales:

región transductora: genera la señal excitatoria hacia el motor flagelar;
región metilable, que como veremos enseguida, funciona en la adaptación al estímulo. Por ello estas proteinas se denominan MCP (iniciales inglesas de "quimiotácticas aceptoras de metilo"). Los aminoácidos metilables son de 4 a 6 glutámicos determinados (dependiendo del MCP concreto).

Proteínas implicadas en la ruta de transducción intracelular de la señal

Todos los tipos de receptores (sean MCPs o no) transmiten información al flagelo por medio de al menos parte de una cascada de fosforilación que implica 6 proteínas: CheA, CheW, CheY, CheZ, CheR y CheB.
CheA. Es una proteínquinasa que se autofosforila en una His concreta (His-48) del dominio amino-terminal. Es el regulador central del sistema quimiotáctico:

Modula el conmutador flagelar a través de CheY (el CheY-P origina más giro en sentido AR)

Retroalimenta el nivel de señalización de las MCP, a través de CheB (la CheB-P elimina metilos del MCP).

CheW. CheW es necesario para el acoplamiento entre CheA y el MCP. Se forman complejos funcionales {MCP·CheW·dímero de CheA}.
CheY. Es una pequeña proteína globular con 5 láminas b intercaladas con 5 hélices a. Se fosforila en el Asp-57. CheY es fosforilado por CheA, y en su forma CheY-P interacciona con el conmutador. La interacción entre CheY-P y el conmutador flagelar (sobre todo con FliM) parece que incrementa la probabilidad de una inversión del giro desde CAR a AR, con lo que aumenta la probabilidad de virajes.
CheZ. CheZ contrarresta la señal de viraje al facilitar la conversión de CheY-P en CheY (sin fosforilar). No se sabe si CheZ actúa como una desfosfatasa o simplemente estimula la intrínseca (aunque lenta) capacidad de CheY de desfosforilarse. CheZ es un dímero que al interaccionar con CheY-P se oligomeriza. Al parecer, esa oligomerización regula la actividad "fosfatasa" de CheZ.
La adaptación: CheR, CheB y la metilación de la MCP: La memoria celular para que la bacteria detecte gradientes de concentración en función del tiempo es el resultado de la metilación de las MCPs por la CheR, y de su desmetilación por CheB-P.
Dependiendo del receptor, la MCP puede metilarse en 4-6 sitios, que son siempre ciertos glutámicos (Glu) conservados, presentes en el dominio citoplásmico. La metiltransferasa CheR metila transfiriendo grupos metilo desde la S-adenosilmetionina (SAM) a dichos glutámicos específicos.
En ausencia de estímulo, hay un nivel basal de metilación, pero la unión de estímulo químico al dominio periplásmico del MCP provoca algún cambio conformacional en el citoplásmico, que hace que esos sitios sean más o menos accesibles a la metilación:

Si se une atrayente à más accesible a metilación

Si se une repelente à menos accesible a metilación.

La adaptación ocurre (al parecer) porque la metilación creciente disminuye progresivamente la capacidad del MCP unido al atrayente de suministrar la señal, de modo que el MCP regresa al estado anterior al estímulo.
CheB-P es una metilesterasa que ajusta el estado señalizador del MCP eliminando grupos metilo, que pasan a metanol. CheB se fosforila por CheA, y la forma fosforilada parece ser la responsable de la mayor actividad metilesterasa. El sitio de fosforilación reside en el dominio amino terminal, que presenta homología con CheY.

El ciclo de excitación-adaptación

¿Qué es lo que ocurre cuando cada quimioefector se une a su receptor correspondiente? ¿Cómo se transmite la señal hasta el motor flagelar? Esto es lo que vamos a tratar a continuación.
Cuando se coloca a una bacteria en un gradiente de atrayente se observa a lo largo del tiempo una respuesta con 3 fases distintas:

fase de latencia (que dura unos 0.2 seg.), en la que el patrón de rotación no se modifica.

rápida excitación (medida aquí como la probabilidad de encontrar al rotor girando en sentido CAR).

fase de adaptación lenta, hasta que se restablece el patrón inicial.

¿Cómo se puede explicar esto? Veamos una hipótesis:

MCP sin estímulo: à tiene una media de 1 metilo/molécula (nivel basal). En esta situación, la CheA tiene un nivel basal de fosforilación, que sirve para fosforilar a CheY y aCheB. El motor flagelar presenta un patrón de giro de unos cuantos segundos en sentido CAR (à natación en línea recta), y breves períodos de sentido AR (à virajes). Ahora veremos cómo este flujo basal de información hacia el flagelo y de metilación del MCP se altera con un estímulo químico. Veamos lo que ocurre con una sustancia atrayente.

adición del atrayente: fase de transducción intramolecular de la señal: el atrayente provoca un cambio conformacional en el dominio periplásmico, que se transmite por medio de la región transmembranal hasta el dominio citoplásmico, que a su vez cambia también de conformación. Este cambio del dominio citoplásmico supone de hecho unamodificación de la región efectora de este dominio que transmite la señal hacia el motor flagelar. El tiempo que tarda en llegar al motor explica el periodo de latencia.

Durante esta fase el nivel de metilación no se altera, pero el cambio conformacional deja "activados" a los glutámicos metilables.

Transducción intracelular de la señal: el cambio conformacional del dominio citoplásmico tiene el efecto de inhibir la activación de la CheA, de modo que desciende el nivel basal de su autofosforilación, lo que se traduce en que se fosforilan menos moléculas de CheY y de CheB. Al haber menos CheY-P, llegan menos señales al conmutador flagelar de que cambie a sentido igual al de las agujas del reloj. Por lo tanto, se prolongan los períodos de natación en línea recta (y es más probable que la bacteria se acerque al estímulo químico).

Mientras tanto, ha estado actuando la metiltransferasa (CheR), que ha ido añadiendo metilos a los glutámicos del dominio citoplásmico de la MCP. Si pasa un cierto tiempo y el dominio periplásmico sigue ocupado por el quimioatrayente, se alcanza un gran nivel de metilación en ese dominio citoplásmico. Esto hace que el dominio efector citoplásmico vuelva a una configuración "nula", o sea, deja de emitirse señal excitadora. A ello colabora igualmente que el nivel de metilesterasa (la proteína CheB-P, es decir la forma fosforilada) sea bajo. Esta es la explicación molecular de por qué ocurre al cabo de unos segundos la adaptación lenta al estímulo.

Como la metilación es relativamente lenta, esto significa que si en un determinado momento la concentración actual de quimioefector (detectada por el grado de ocupación del dominio periplásmico) es similar a la concentración unos segundos antes (manifestada por el nivel de metilación del dominio citoplásmico), la bacteria "sabe" que lleva ya un cierto tiempo acercándose al estímulo. Si la metilación se ha estabilizado a un nivel alto, se produce un cambio conformacional por el que el MCP deja de emitir señal (estado nulo), y la bacteria se ha adaptado al estímulo.

Como ejercicio, veamos qué pasaría si ponemos un repelente: la unión del repelente al MCP provoca un cambio conformacional que hace que el dominio citoplásmico interaccione ahora con el complejo CheW·CheA de modo que se aumenta la tasa de autofosforilación de CheA. Ahora esta CheA fosforila tanto a CheY como a CheB. La CheY-P difunde a la base del flagelo e interacciona con el conmutador (sobre todo con FliM y FliG), y "da la orden" de que se cambie más a menudo a giro en sentido de las agujas del reloj (AR), lo que hace que la bacteria vire caóticamente más a menudo. Con ello aumentan sus probabilidades de que encuentre una dirección de natación más favorable (en sentido opuesto al gradiente), en cuyo caso tendríamos un patrón similar a cuando se une un atrayente. Mientras tanto, la CheR ha encontrado más difícil acceder a los glutámicos, y el mayor nivel de la metilesterasa (CheB-P) hace que se eliminen metilos.
RECAPITULEMOS:

Añadimos un atrayente à unión a MCP à cambio conformacional que provoca una inhibición del nivel basal de fosforilación de CheA à rotación CAR à natación en línea recta durante mayor tiempo.

Simultáneamente el MCP estimulado expone sus resíduos de glutámico. Si el estímulo continúa durante un tiempo (durante el que la bacteria sigue nadando), aparece la regulación específica de ese receptor por la metiltransferasa à gradualmente se van añadiendo metilos que hacen que deje de producirse señal excitatoria (adaptación lenta).

Pero además, baja la tasa de metil-esterasa, lo que colabora a esta adaptación (debido a que deja de fosforilarse la CheB). La bacteria está preparada para recibir un estímulo distinto, superior.

1.4. BACTERIAS FLAGELADAS "DISPERSIVAS" ("SWARMERS")

Determinadas bacterias (las Gram-negativas del género Proteus, ciertas especies de Vibrio, Serratia, algunas Gram-positivas de los géns. Clostridium y Bacillus) tienen la capacidad de extenderse rápidamente sobre superficies sólidas húmedas, a base de oleadas periódicas. Este fenómeno se denomina dispersión ("swarming", en inglés), y en placa de agar se manifiesta por la invasión de toda la superficie a partir del foco de inoculación.
La base de este fenómeno se ha estudiado sobre todo en Proteus mirabilis y en Vibrio parahaemolyticus. Nos referiremos a esta última bacteria:
En medio líquido, V. parahaemolyticus es un bacilo provisto de un flagelo polar recubierto por una vaina que consiste en una prolongación de la membrana externa. Este tipo de célula se denomina nadadora, y su sistema de natación por ese flagelo envainado se denomina Fla.
Cuando se pasa a una superficie húmeda, ocurre un fenómeno de diferenciación: se detiene la división celular, aunque la bacteria sigue creciendo à la bacteria se convierte en un largo filamento, y al mismo tiempo se producen numerosos flagelos laterales, no envainados, que se agregan formando haces. Este segundo sistema flagelar se denomina Laf, y es totalmente distinto al Fla:

los flagelos carecen de vaina;

todos sus componentes estructurales (filamento, corpúsculo basal, etc) son distintos a los del sistema Fla.

Este tipo de células de flagelación mixta (flagelo polar envainado + flagelos laterales) son las células dispersivas, que están adapatadas a colonizar rápidamente superficies sólidas o semisólidas húmedas. Ambos tipos de células comparten, sin embargo, el mismo sistema intracelular de transducción de estímulos ambientales (proteínas Che de la quimiotaxis).)Cómo se produce la transición desde una célula nadadora a la fase dispersiva? Parece ser que existe un nexo de regulación entre el flagelo polar y la expresión inducible de los genes codificadores del sistema de flagelos laterales:
Cuando una célula nadadora llega a un medio de alta viscosidad (por ejemplo, la superficie de un epitelio de un animal), el flagelo polar actúa como un sensor táctil, a modo de dinamómetro, registrando la información sobre esa densidad. La señal se deriva de la resistencia que encuentra este flagelo a rotar en ese entorno de mayor densidad y viscosidad. Ello provoca una transducción intracelular de esa señal ambiental (por un mecanismo aún desconocido) que "desbloquea" la transcripción de los operones del sistema Laf (que hasta entonces estaban "silenciosos").
Pero además, se requiere una segunda señal para esta desrepresión: esta señal es quesimultáneamente, en ese medio viscoso debe de haber bajas concentraciones de hierro. Esto tienen un gran significado adaptativo relacionado con el modo de vida de esta bacteria: para que la bacteria se embarque en un proceso "caro" y complejo como la producción de esos flagelos, tiene que tener la "seguridad" de que ha llegado a un hábitat apropiado (un tejido animal). La bacteria deduce eso por dos señales simultáneas: el medio es más viscoso y además, hay carencia de Fe (el interior de los vertebrados carece de Fe libre). La detección simultánea de estos dos buenos indicios desreprime la producción del sistema Laf, que permite que esta bacteria colonice rápidamente el epitelio, su "nicho ecológico" al que se encuentra adaptada evolutivamente.

1.5. FLAGELOS PERIPLÁSMICOS

Son un tipo de flagelos que presenta exclusivamente el grupo de las Espiroquetas. Estas bacterias Gram-negativas son extremadamente finas y de forma helicoidal. Están compuestas de:

cilindro protoplasmático, formado por el protoplasto rodeado de la capa de peptidoglucano. El sáculo de mureína de este PG tiene forma helicoidal, y es responsable de la típica morfología de estas bacterias;

membrana externa;

entre el cilindro protoplasmático y la membrana externa se encuentran los peculiares flagelos, insertados subpolarmente y enrollados alrededor del cilindro. Estos flagelos se denominan flagelos periplásmicos (= endoflagelos = fibrillas axiales).

EstructuraCada flagelo, en sí mismo, es similar al tipo de flagelo clásico ya estudiado:

corpúsculo basal, con dos pares de anillos (excepto en Leptospira, con sólo un par);

codo

filamento, a base de subunidades de flagelina.

Ahora bien, lo característico es la disposición de los flagelos que salen de cerca de cada extremo, en relación con el cuerpo celular:

En la mayoría de las especies, cada flagelo se extiende a lo largo del eje bacteriano, paralelo a la superficie del cilindro protoplasmático, hasta alcanzar los 2/3 de la longitud total; esto se traduce en que los flagelos que salen de cada extremo se solapan en la zona central (la excepción la tenemos en el gén. Leptospira, en que no se solapan).

Las distintas fibrillas provenientes de cada extremo discurren paralelas y cercanas. El conjunto de estas fibrillas se manifiesta como filamento axial, recubierto por membrana externa.

Papel de los endoflagelos en la movilidad de las espiroquetasLos flagelos de estas bacterias, paralelos al eje longitudinal de la célula, están anclados al cilindro protoplasmático, que es rígido (mientras que la membrana externa es flexible). Al girar los flagelos de los dos extremos en el mismo sentido, obligan a girar al cilindro rígido en un sentido, y a la membrana externa en sentidos contrarios. El efecto es que el cilindro protoplasmático gira en torno del filamento axial formado por los flagelos periplásmicos. Esta es la base de los distintos tipos de movimientos que podemos observar en estas bacterias:
En medios líquidos se mueven

por avance muy rápido a modo de torniquete (el cuerpo bacteriano se comporta como un sacacorchos)

se pueden ver también contorsiones, "latigazos", etc.

Sobre la superficie de medios sólidos:

por rodamiento de la hélice. Esto se debe a que el filamento axial confiere movimiento de rotación a la membrana externa, lo que se traduce en que la bacteria pueda rodar. (Tome el alumno un muelle, deposítelo sobre una mesa y déle un empujón).

Flexiones. Se provocan ondas propagables del cilindro. La bacteria puede avanzar a modo de las larvas de las mariposas geómetras

Todos estos tipos de movimiento son adaptaciones evolutivamente conseguidas que permiten el rápido avance en medios de alta densidad (fangos espesos, mucosas de los animales, etc), medios donde los flagelos típicos ya no pueden servir adecuadamente. La evolución ha hecho que las espiroquetas se adapten, por su peculiar estructura y la de sus flagelos, a medios muy viscosos: de hecho, se mueven con mayor rapidez a 300-500 cP que a 10-50 cP. Presentan, además taxias positivas hacia esos medios viscosos.

2. FIMBRIAS O PELOS (= PILI)

Son apéndices filamentosos rectos y rígidos, más cortos y más finos (3-10 nm de diámetro) que los flagelos, y que aparecen en muchas bacterias (sobre todo Gram-negativas). La mayoría están compuestos por un solo tipo de proteína (la pilina), de unos 17-25 kDa, cuyas subunidades se disponen en una matriz helicoidal que deja un pequeño hueco central.
Están implantados a nivel de membrana citoplásmica.
Número variable: desde 1 a varios cientos o miles por célula.
Disposición: alrededor de todo el perímetro celular, y a veces, de inserción polar.
Aislamiento: por simple agitación mecánica de las células, seguido de ultracentrifugación.
Composición: ensamblaje de subunidades de pilina, proteína globular muy hidrófoba.
Ensamblaje: inserción de subunidades de pilina en la base del pelo en crecimiento, a partir de pre-pilina, que se procesa por escisión del correspondiente péptido-líder a su paso por la membrana citoplásmica.
Existen tres tipos principales de pili (pilus, en singular):

fimbrias adhesivas

pelos sexuales

otros

Fimbrias adhesivas

Son pelos de 4 a 7 nm de diámetro (según especies), repartidas por toda la superficie y que funcionan como adhesinas, es decir como estructuras para la adhesión a sustratos vivos o inertes. Condicionan varias propiedades biológicas, derivadas de sus propiedades adhesivas:

microcolonias y velos (los velos son películas formadas por acúmulos de bacterias en medios estáticos -en reposo-).

adhesión a superficies inertes

adhesión superficies vivas. En el caso de bacterias patógenas, esta capacidad tiene que ver con su virulencia, invasividad del tejido.

Ejemplos de función como adhesinas:

en la formación de la placa dental, por coagregación de individuos de distintas especies sobre el diente;

factores de colonización de tejidos, por ejemplo en el gonococo (Neisseria gonorrhoeae) y en las cepas uropatogénicas de Escherichia coli.

La función de adhesina no reside en la pilina que constituye la inmensa mayoría de la fimbria, sino en una proteína especial de la punta del pelo. La mayoría de estas proteínas de la punta pertenecen a la clase de las llamadas lectinas, es decir, proteínas o glucoproteínas capaces deunirse con gran afinidad a cadenas laterales de polisacáridos presentes en la membrana citoplásmica de las células del hospedador a las que se adhieren.
Aspectos genéticos: Los genes codificadores de las proteínas de los pelos adhesivos son delocalización cromosómica. En muchas bacterias patógenas se da un fenómeno de variación de fase: se trata de cambios rápidos y reversibles por los que células piliadas (Fim⁺) pueden convertirse en no piliadas (Fim^--), y viceversa. El significado adaptativo es que los individuos Fim⁺ son los más capaces de iniciar la colonización del animal hospedador, pero son más sensibles a la fagocitosis, mientras que una vez que han colonizado el epitelio, el cambio a Fim^--permite que los individuos resistan mejor la fagocitosis.
Pero además, existe otro interesante mecanismo adaptativo: las células Fim⁺ de algunas especies experimentan fenómenos de variación antigénica, es decir, por una serie de mecanismos genéticos, cambian la especificidad antigénica de su pilina, lo que supone una estrategia de evitación contra el sistema inmune del hospedador (un caso más de esa "carrera de armamentos" evolutiva que se libra entre microorganismos y organismos superiores).
Algunas pilinas (por ejemplo, en los géneros Moraxella y Neisseria) sirven también como parte del aparato necesario para la transformación genética por ADN exógeno.

Pelos sexuales de enterobacterias y otras bacterias Gram-negativas

Son más largos y más gruesos (unos 10 nm de diámetro) que las fimbrias adhesivas. Aparecen en menor número (de 1 a 10 por célula), y su función es la de permitir los contactos iniciales en la conjugación, como órgano de reconocimiento entre la bacteria donadora, dotada del pelo sexual, y la receptora, carente de él.
Sus genes son de localización plasmídica.
Hay dos clases principales de pelos sexuales: los de de tipo F y los de tipo I, cada uno con un tipo de proteína distinta (genéricamente conocida como pilina sexual). Son usados como receptores específicos por parte de algunos fagos.
Hablaremos de los pelos sexuales cuando abordemos el capítulo de Conjugación bacteriana.

Otros tipos de pelos

Túbulos contráctiles polares de los géneros Pseudomonas, Agrobacterium y Rhizobium. Permiten en algunos casos la formación de rosetas de varios individuos unidos por los túbulos, asi como receptores de fagos.
Tubos huecos de Agrobacterium, bastante gruesos (40 nm). Se desconoce su función.

3. PROSTECAS

Son prolongaciones semirrígidas vivas, propias de ciertas bacterias, con un diámetro menor que el cuerpo celular. Es decir, son apéndices del cuerpo celular rodeados por membrana y pared celulares.
Funciones:

En algunas bacterias prostecadas funcionan en la reproducción (prostecas reproductivas o "hifas"). Ejemplos: Hyphomicrobium, Hyphomonas.

En Caulobacter actúa como apéndice para unión a sustratos inertes o para la formación de rosetas de varios individuos, merced al botón de anclaje situado en el extremo

En general, suponen un modo de aumentar la relación superficie/volumen, lo cual redunda en:

mayor capacidad de flotabilidad para ciertas bacterias planctónicas;

mayor superficie para la captación de nutrientes en ambientes oligotróficos.

Ejemplos: Ancalomicrobium, Prosthecomicrobium, Stella, etc.

4. TALLOS O PEDÚNCULOS

Son estructuras filamentosas no vivas, terminadas en botones de anclaje (discos adhesivos), producidas por secreción continua de materiales polisacarídicos en una zona concreta de la superficie bacteriana.
Función: Permite la unión de ciertas bacterias de hábitats acuáticos a sustratos sólidos, vivos o no.
Ejemplos: Gallionella: es una bacteria con forma de media luna, de cuyo lado cóncavo surgen de 3 a 40 filamentos helicoidales, terminados en botones de anclaje. Planctomyces: es una bacteria con forma de pera, con flagelo subpolar, que pasa parte de su vida anclada a sustratos por medio de un tallo constituido por numerosas fibras rectas.

Receptor de tipo MCP	Aminoácidos atrayentes	Azúcares atrayentes ⁽¹⁾	Repelentes
Tsr	Ser Ala Gly		Acetato, leucina, benzoato, indol
Tar	Asp Glu	Maltosa	Cobalto, níquel
Trg		Galactosa, ribosa
Tap	Dipéptidos

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sábado, 26 de marzo de 2016

Estudios de la microbiología