Las células HEp-2 (según la investigación original de Toolan es un acrónimo de Human Epidermoid carcinomastrain #21 , aunque actualmente se utiliza también según la connotación Human Epithelioma) son un tipo particular de células de cultivo neoplásicas inmortalizadas que se utilizan en investigación científica y como sustrato en varios tests comerciales para anticuerpos antinucleares.
Células HEp-2 expuestas a autoanticuerpos humanos dirigidos contra los filamentos de actina y marcadas con un anticuerpo murino anti IgGhumana conjugado con isotiocianato de fluoresceína.
Origen de la línea celular
Hasta hace relativamente poco tiempo se creía que células originales provenían de un tumor metastásico nodular de laringe; extirpado en el año 1952 de un paciente masculino de 57 años de edad que padecía cáncer de garganta. Las células quirúrgicamente removidas fueron posteriormente implantadas en ratas inmunosuprimidas por irradiación con rayos X y cortisona, para finalmente ser establecidas en cultivo celular.2 1 3 4
Sin embargo investigaciones más recientes, demuestran que en realidad las células HEp2 contienen marcadores cromosómicos de HeLa, y que por lo tanto son una cepa derivada de esta línea celular, surgida posiblemente como producto de una contaminación cruzada durante las primeras etapas del cultivo. Dentro de estos estudios se ha establecido sobre la base de análisis de isoenzimas, marcadores cromosómicos HeLa, y huellas dactilares del ADN que pertenecen al linaje HeLa. Las células son positivas para queratina por la técnica de la inmunoperoxidasa, demostrando que se trata de un carcinoma epidermoide. Y se ha demostrado por medio de PCR que presentan secuencias de ADN pertenecientes al HPV, el virus responsable de la transformación maligna de las células HeLa originales.5 6
Uso en diagnósticos inmunológicos
Hasta el día de hoy, la detección de autoanticuerpos por medio de células HEp2 sigue manteniendo un rol central. En casos en que se sospecha una enfermedad autoinmune, el ensayo sobre células HEp2 es el método de cribado recomendado, el cual además tiene una excelente relación beneficio/costo y permite un diagnóstico diferencial de alta calidad entre varias enfermedades autoinmunes. Cualquier resultado positivo, es seguido por lo general de una batería de determinaciones en etapas, las cuales, dependiendo de la reactividad que presenten los anticuerpos frente a HEp2, pueden incluir otras pruebas inmunológicas tales como ELISA para anticuerpos individuales, o pruebas deinmunoblot.
Los cultivos celulares, o los cortes histológicos de tejidos presentan a los antígenos relevantes en su ambiente natural, además de que permiten la determinación de múltiples anticuerpos simultáneamente con una alta sensibilidad. La detección de autoanticuerpos por medio de células HEp2 provee mucha más información que una simple señal, positiva o negativa. Muchos anticuerpos presentan patrones de fluorescencia característicos, (homogéneo, granular, nucleolar, punteado, citoplasmático) que permiten la diferenciación en varios grupos de autoanticuerpos. En especial para la determinación de anticuerpos antinucleares (ANA), las células HEp2 de cultivo proveen una mayor sensibilidad que los cortes histológicos de tejidos de mamíferos. Los diferentes patrones de fluorescencia son fácilmente discernibles en la monocapa de células HEp2, mientras que son difíciles de apreciar en los cortes de tejido de hígado y riñón de rata.7
Ventajas y desventajas
Debido al gran número de antígenos presentados por un sustrato de células HEp2, la determinación resulta altamente sensible, pero por la misma razón, la especificidad es limitada. Los test AAN en células HEp2 son frecuentemente positivos en pacientes que no padecen una enfermedad autoinmune. Se han encontrado títulos de AANs elevados en aproximadamente el 13% de individuos sanos. En estos individuos, los títulos tienden a ser bajos (<1:80 1:80="" 4="" 87="" anas="" aparecieron="" autoinmune="" autoinmunes="" c="" centr="" class="reference" contraste="" control="" cromosomas.="" de="" del="" divisi="" el="" elevados="" en="" enfermedad="" espec="" exhiben="" ficos="" fino="" fluorescencia="" grupo="" homog="" id="cite_ref-ArthReum2011_8-0" individuos="" la="" lo="" los="" lulas="" mayor="" mero="" moteado="" n="" neo="" no="" padecen="" parte="" patr="" patrones="" presentan="" que="" s="" sanos.="" sin="" style="line-height: 1em; unicode-bidi: isolate;" su="" sup="" t="" tinci="" tulos="" una="">8
Los ensayos de inmunofluorescencia permiten un diagnóstico de alta calidad y buena relación beneficio/costo en enfermedades autoinmunes. Sin embargo, este método carece de posibilidades de estandarización y resulta altamente dependiente de la cualificación del observador. Por lo que los hallazgos positivos deben ser subsecuentemente evaluados por otros test inmunológicos, tales como ELISA o inmunoblot, en un enfoque diagnósitco por etapas.9
Los ensayos de cribado para AAN por IFI son laboriosos, lentos y subjetivos. Se han hecho muchos intentos para encontrar una solución sustentable, se han hecho estudios que indican que un ELISA para la detección de ANAs clínicamente significativos puede ser una alternativa al IFI,10 sin embargo todavía hay algunos anticuerpos que solo pueden ser detectados por IFI.
El reemplazo de los métodos de inmunofluorescencia estándar por otros métodos aún continúa en investigación, sin embargo la frecuencia de ANAs detectados por estos métodos continúa siendo menor a los que se consiguen por IFI, en especial en pacientes de ascendencia europea con LES. La detección de ANAs por IFI en sustratos de células HEp2 es superior a los ensayos automatizados y continúa siendo la técnica estándar para la detección de ANA.11
Sustrato ideal
Un sustrato ideal de células HEp2 debe cumplir ciertos estándares:12
- Los núcleos celulares deberían ser grandes y de tamaño y forma regulares.
- La distribución de células no debería ser ni demasiado densa, ni demasiado dispersa, el número óptimo debería estar entre 70 y 100 células por campo a un aumento de 400, menos de 50 o más de 110 no es adecuado.
- Es necesario que tengan citoplasmas amplios, donde puedan distinguirse claramente diferentes patrones citoplasmáticos y donde el núcleo se encuentre cláramente delimitado.
- Debe poseer un número considerable de células en diferentes fases del ciclo celular.
- Debe permitir ver un número limitado de cromosomas (<10 a="" claridad.="" con="" cromosomas="" cuales="" de="" dos="" en="" encuentren="" es="" li="" lo="" los="" metafasse="" ptimo.="" se="" seis="" tres="" uno="">
- Debe tener una fluorescencia de fondo mínima.
Etimología
El nombre de estas células deriva del comportamiento que presentan en cultivo, similar a un carcinoma epidermoide, y al número de cepa, en este caso la #2, al que pertenecían en el estudio de Toolan en el cual supuestamente se estableció esta línea celular.
Los ANA comprenden una variedad de auto-anticuerpos (AC) contra distintos constituyentes del núcleo de la célula, como son el ácido desóxirribonucleico (ADN), el ácido ribonucleico (ARN) y otras proteínas nucleares. Con esta técnica también es posible visualizar auto-AC dirigidos contra antígenos citoplasmáticos.
Como sustrato se utilizan cortes congelados de tejido animal (hígado o riñón de rata) o células Hep-2, las cuales provienen de una línea celular humana derivada de un carcinoma laríngeo epitelial. Ninguno de los dos sustratos es perfecto, ya que algunos antígenos se encuentran expresados en baja concentración en tejido animal (por ejemplo, Scl-70 en tejido de roedor), mientras que en cultivos de Hep-2 el antígeno Ro/SSA puede estar expresado en una conformación distinta a la reconocida por el Auto-AC, debido a lo cual pueden haber resultados falsos positivos. A pesar de esto, lo más utilizado son las células Hep-2, ya que presentan la ventaja de que es posible observar a las células solas, además este tipo celular posee un núcleo grande y organelos más fáciles de ver, por otro lado estas células se dividen rápido, por lo cual en un preparado es posible observar células en los distintos estados de división celular.
La IFI es la técnica de elección para el screening de ANA, debido a su alta sensibilidad cuando el resultado es positivo con un título alto (1/160). Sin embargo presenta una baja especificidad, por lo cual, su resultado siempre debe ser interpretado dentro del contexto clínico del paciente. Ante un resultado positivo, y dependiendo del patrón obtenido, generalmente es necesario continuar los estudios serológicos en busca de los antígenos específicos asociados, para lo cual se utilizan inmunoensayos de mayor especificidad, como el ELISA.
Interpretación de los resultados:
Las células Hep-2 de cada pocillo son una mezcla de células en reposo (interfase) no mitóticas y en varias fases de la mitosis. La mitosis es un proceso de división celular de cuatro fases: (1) profase, (2) metafase, (3) anafase, y (4) telofase. Durante la mitosis, la membrana nuclear se disuelve y los cromosomas pueden verse fácilmente en una disposición característica de cada fase. Entonces, para la correcta interpretación de la muestra, es necesario evaluar las células en la fase de reposo (interfase) y de las células mitóticas (durante la metafase).
Dependiendo del o los ACs presentes en el suero, se pueden obtener distintos patrones de fluorescencia.
I. Patrones nucleares
Patrón homogéneo:
Se observa una fluorescencia homogénea de todo el núcleo de la célula, además, cuando las células se encuentran en mitosis se ve la región de los cromosomas teñida intensamente (mitosis positiva). Estos ACs están dirigidos contra el DNA, anti-histonas y/o anti-DNP (AC anti-complejo ADN e histonas).
Patrón moteado:
Se observan numerosos puntos uniformes de fluorescencia de distintos tamaños (moteado fino o moteado grueso), diseminados por todo el núcleo con márgenes nucleares bien definidos . Son ACs dirigidos contra proteínas nucleares diversas: anti-Sm (ribonucleoproteína Smith), anti-RNP (ribonuceloproteína U1), anti-Scl-70 (topoisomerasa I), anti-SSA/Ro (antígeno de Sd Sjögren A), anti-SSB/La (antígeno de Sd Sjögren B) o contra antígenos indefinidos. En este patrón la cromatina no se marca, por lo que cuando las células se encuentran en fase de mitosis los cromosomas son negativos (mitosis negativa). Los antígenos específicos reconocidos pueden ser detectados mediante ELISA, correspondiendo a los antígenos nucleares extraíbles (ENA).
Patrón anti-centrómero:
Este patrón se observa cuando hay ACs contra el quinetoporo de los cromosomas. La fluorescencia se caracteriza por puntos de fluorescencia uniformes de mediano tamaño diseminados por todo el núcleo con márgenes nucleares poco definidos. En las células en mitosis (metafase) se pueden ver los cromosomas marcados alineados uno sobre el otro, visualizándose como una “escalera” de fluorescencia. A diferencia de los otros patrones ANA, este patrón es el único que se relaciona en forma específica con una enfermedad autoinmune, la forma localizada de esclerodermia sistémica progresiva (CREST). Los AC están dirigidos contra los antígenos centroméricos (CENP)-A, B y C.
Patrón nucleolar:
Corresponde a una tinción homogénea intensa de los nucleolos, asociada con frecuencia a fluorescencia homogénea pálida del resto del núcleo. Los cromosomas de las células mitóticas son normalmente negativos; no obstante algunos AC nucleolares pueden reaccionar con los cromosomas. En este patrón los ACs pueden estar dirigidos contra variados antígenos, alguno de los cuales pueden ser la ARN polimerasa II y I.
Como se dijo anteriormente, la técnica de IFI para la detección de los ANA tiene una alta sensibilidad, y es utilizada como screening cuando se sospecha de ANA (+). Estos auto-AC están positivos en distintas enfermedades reumatológicas, para las cuales presentan distinta sensibilidad. Es un método útil para orientar hacia un cierto diagnóstico, sin embargo sus títulos no se relacionan con la actividad de la enfermedad. En la tabla a continuación se resume la sensibilidad de ANA y las enfermedades relacionadas.
Tabla 1. enfermedades con ANA positivo
Enfermedad Pacientes con ANA (%)
- Lupus eritematoso sistémico (LES) 99
- LES inducido por drogas 100
- Esclerosis sistémica progresiva 97
- Enfermedad mixta del tejido conjuntivo 93
- Polimiositis/dermatomiositis 78
- Sd. De Sjögren 96
Si bien este examen presenta una alta sensibilidad para distintas enfermedades reumatológicas, es posible encontrar ANA en pacientes sanos, sobre todo en ancianos, además distintas enfermedades infecciosas pueden dar ANA (+), como también enfermedades inflamatorias crónicas. Sin embargo en estas situaciones generalmente los títulos son menores a 1/160, además que siempre es necesario evaluarlos en el contexto clínico de cada paciente.
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